全 文 ：　第 25 卷第 4 期
2006年 7月 　 　 　　　　 　
食 品 与 生 物 技 术 学 报
Journal of Food Science and Biotechnology
　 　 　　　　Vo l. 25　No . 4
Jul. 　2006
　文章编号:1673-1689(2006)04-0081-04
　　收稿日期:2005-03-30;　修回日期:2005-05-28.
作者简介:王立(1978-), 男 ,江苏溧阳人 , 工学博士.
乌饭树树叶中黄酮类色素的抗氧化活性
王立1 , 　姚惠源1 , 　陶冠军2 , 　秦 2
(1. 江南大学 食品学院 ,江苏 无锡 214036;2. 江南大学 分析测试中心 ,江苏 无锡 214036)
摘　要:对乌饭树树叶中提取出的色素进行了分离纯化 ,分离出了 4种黄酮类物质。并且对这 4
种物质清除活性氧自由基的能力进行了研究 ,发现乌饭树提取物都具有很强的清除自由基能力 ,
清除能力最强的槲皮素和 6#提取物的 IC50达到了 5. 9 μg /mL 左右。
关键词:乌饭树;黄酮;分离;纯化;自由基;清除
中图分类号:TS 207 文献标识码:A
Scavenging [O2 - ] and [ OH] of extracts from the Leaves
of Vaccinium bracteatum Thunb
WANG Li1 , 　YAO Hui-yuan1 , 　TAO Guan-jun2 , 　QIN Fang2
(1. Schoo l o f Food Science and Eng ineering , Southern Yang tze Univer sity , Wuxi 214036 , China;2. Testing and A-
nalysis Cente r , Southern Yang tze University ,Wuxi 214036 , China)
Abstract:In this article , four flavones from the leaves o f Vaccinium Bracteatum Thunb w ere
identified and puri fied. Thei r functions of scavenging [ O 2 - ] and [ OH] were also deiscussed. It
w as found that all the ex tracts have low IC50 . Quercetin and the 6 thex tract have the lowest IC50o f
about 5. 9 μg /mL.
Key words:Vaccinium bracteatum Thunb;f lavone;identification;purification;freeradicle;
scavenge
　　乌饭树属(又称为越桔属)植物属于杜鹃花科 。
该属全世界有约 450种 ,我国约有91种 。我国民间
有采食乌饭浆果的习惯 ,有些地方有制造果酱和酿
酒 ,但是没有形成规模 。国外对于乌饭树树果的研
究报道也有 ,但不是很多 ,主要研究是关于乌饭树
树果的生理功能 ,如抗衰老 、抗氧化 、抗癌防癌 、抗
菌等等[ 1 - 8] 。
从乌饭树树叶中分离出很多种化学成分 ,包括
黄酮类物质 、维生素 、糖 、果胶 、有机酸 、环烯醚萜类
和萜类化合物。紫黑浆果中含多种多酚化合物 ,如
花色素苷和一些甙元 、桂皮酸 、苯甲酸衍生物 、黄烷-
3-醇 、黄酮醇糖甙等[ 9] 。并且有报道已经从中分离
出了一种黄酮类物质———槲皮素[ 10] 。
黄酮类化合物一直是人们所关注的抗氧化剂
和自由基清除剂 ,众多的研究表明 ,黄酮类化合物
具有广泛的生物活性 ,如抗氧化 、抗突变 、抗衰老 、
抗肿瘤 、抗菌等等[ 12 - 15] 。其中最主要的是黄酮的抗
氧化活性 ,主要表现在减少自由基的产生和清除自
由基两个方面 。
作者对乌饭树树叶中提取出的黄酮类色素进
行了分离纯化 ,首次从中分离出了 4 种黄酮类物
质 ,并且对这些物质清除活性氧自由基的能力进行
了研究。
1　材料与方法
1. 1　实验材料 、试剂与设备
乌饭树树叶黄酮单体:实验室自制;鲁米诺:
FLUKA 公司产品;0. 05 mo l /L pH 7. 8磷酸盐缓
冲液(PB),1 mmol /L 鲁米诺(L), 0. 1 mmol /L 维
生素 C 溶液 ,33. 3 mmol /L 过氧化氢溶液(H 2O 2),
1 mmol /L 邻菲罗啉 , 1 mmol /L 硫酸铜缓冲液 ,
0. 05 mo l /L pH 9. 0 的硼酸-硼砂盐缓冲液(BB),
0. 05 mol /L pH 10. 2 碳酸-盐缓冲液(CB-L), 1
mmo l /L 邻苯三酚水溶液(P),均为分析纯;槲皮素:
贵州大学生化中试基地提供;芦丁:上海生化试剂
一厂产品 。Waters 2690 型高效液相色谱仪 , Li-
chrospherC-18色谱柱:美国Waters公司产品;生物
化学发光测定仪:上海上立检测仪器厂产品;微型
混合器:上海彭氏实业有限公司产品;微量移液器:
上海求精生化试剂仪器有限公司。
1. 2　实验方法
1. 2. 1　分离纯化　乌饭树树叶 →体积分数 95%
乙醇提取液→石油醚萃取脱脂→水相用氯仿 、正丁
醇萃取→正丁醇萃取部分浓缩至无醇味→上 AB-8
大孔吸附树脂柱初步纯化 →水洗除杂质→体积分
数 95%乙醇洗脱→上聚酰胺柱粗分→不同体积分
数的乙醇梯度洗脱 →各组分聚酰胺柱细分 →
HW40柱乙醇梯度洗脱→得到纯物质 3#～ 6#。
1. 2. 2　鉴定　盐酸 - 锌粉试验:取试液 1 mL ,加
入少量锌粉 , 摇晃 , 滴加少量浓盐酸 ,加热 3 ～ 5
min;铅盐沉淀试验:取试液 2 mL ,滴加少量乙酸铅
试剂;三氯化铝试验:取少量试液滴于滤纸上 ,喷质
量分数 1%三氯化铝溶液 ,然后于紫外灯下观察;
氨熏试验:取少许样品滴于滤纸上 ,氨气熏 ,在可见
光和紫外灯下观察;HPLC 图谱鉴定:观察样品的
HPLC图谱[ 16 - 19] 。
1. 2. 3　超氧阴离子自由基[ O2 - ] 的清除实验　
配制一定浓度的乌饭树树叶黄酮单体甲醇溶液 ,并
用 0. 05 mol /L pH 7. 8并含有 0. 1 mmol /L 的 ED-
TA磷酸盐缓冲液稀释成不同的浓度 ,发光系统采
用邻苯三酚 -鲁米诺体系 。配比如下:空白试剂 10
μL;样品 10 μL;邻苯三酚 20 μL ;0. 05 mmol /L
CB-L:970 μL。
精确移取样品和邻苯三酚加入无色透明的硬
质玻璃管中 ,置于发光测定仪中并使之进入测定位
置 ,准确加入 CB-L ,启动发光装置 ,立即使用 R程
序测量 1 min 内每 6 s 的发光积分强度 CP6S ,同时
测定甲醇及各种不同稀释浓度的甲醇溶液作为空
白的发光值 ,用下式计算测试样品的抑制率:
抑制率(%)=(A0 - As) /A0 ×100% (1)
A0为空白发光值 , As 为测试样品发光值[ 20 - 22] 。
以样品浓度与抑制率作图 ,根据拟合方程求出
抑制率为 50%时所需样品的浓度 ,即半抑制浓度
IC50 。
1. 2. 4　羟基自由基[ OH ]的清除实验　测定体
系采用邻菲罗啉发光体系。测定操作配比如下:样
品液 V μL;0. 1 mmol /L VC 20μL ;1 mmol /L Cu-
SO 4 50μL;1 mmol /L 邻菲罗啉 50 μL;缓冲液BB
830 μL;33. 3 mmo l /L H 2O 2 50 μL 。V 为按照需要
加入样品液体积。
依次将样品和各种试剂加入到试管中 ,最后加
入 H 2O 2 ,启动发光反应 ,放入发光测定仪中并使之
进入测定位置 ,立即使用 R程序测量 1 min内每 6 s
的发光积分强度 CP 6S ,以第六个 6 s 的发光强度
CP6S为标准进行计算 ,同时以不同体积的甲醇替代
样品作为空白对照 , 计算抑制率(计算公式同式
(1))[ 23 - 25] 。
以样品浓度与抑制率作图 ,根据拟合方程求出
抑制率为 50%时所需样品的浓度 ,即半抑制浓度
IC50 。
2　结果与讨论
2. 1　纯化鉴定
纯化鉴定见表 1和图 1。
表 1　黄酮类化合物定性分析结果
Tab. 1　Qualitative analysis of the extracts
反应类型 现象 结果
盐酸—锌粉
试验
4 种物质都变成红色
并且静置后有红色沉
淀
为黄酮 、二氢黄酮或二
氢黄酮醇类化合物
铅盐沉淀
试验
4 种物质都有明显的
红色沉淀
为黄酮类化合物 ,有邻
二酚羟基或兼有 3-
OH 、4-酮基或 5-OH 、
4-酮基黄酮
三氯化铝
试验 4 种物质都生成黄色
为查耳酮 、黄酮醇或黄
酮类化合物
氨熏试验 4 种物质都生成黄色 为黄酮类化合物
　　由表 1可见 ,4种物质均为黄酮类化合物 。
HPLC分析条件:检测器:WATERS 996;分析
柱:Lichro spher C-18 2. 1X250 mm;流动相:甲醇-
水-体积分数 1%乙酸梯度洗脱;柱温:30 ℃;流速:
0. 3 mL /m in;进样量:10 μL。(以时间 /min和相对
强度 /%作图)
82 食　品　与　生　物　技　术　学　报　　　　　　　　　　　　第 25卷　
图 1　3#、4#、5#和 6#的 HPLC图谱
Fig. 1　The HPLC spectra of extracts(Coded 3#, 4#, 5
# and 6#)
　　从图 1中的 4张液相图谱可以初步看出 ,这 4
种物质均为纯物质。
2. 2　乌饭树树叶提取物对超氧阴离子自由基
[O2 - ]清除的影响
超氧阴离子自由基是基态氧接受一个电子产
生的第一个氧自由基 ,是其它氧自由基的前身 ,最
主要的是可以经过一系列的反应生成其它的氧自
由基 ,因此对于超氧阴离子自由基的清除具有特别
重要的意义[ 11] 。
邻苯三酚-鲁米诺发光体系常用于超氧阴离子
自由基清除的研究 ,它具有专一性强 、灵敏度高的
优点 。在碱性条件下 ,邻苯三酚自氧化产生超氧阴
离子自由基[ O 2 - ] , [ O2 - ]激发鲁米诺使之处
于激发态 ,当鲁米诺分子退激时 ,发出化学冷光 ,在
一定的浓度范围内 ,发光强度与[ O 2 - ]的数量呈
一定的比例关系 ,可以采用生物化学发光仪检测发
光强度 ,进而考察样品对[ O 2 - ]的清除能力。
从图 2可以看出从乌饭树树叶中提取出的物
质对超氧阴离子[ O 2 - ] 都具有一定的清除能力 ,
但是清除能力具有差异 ,同时也可以看出 ,乌饭树
树叶粗提物也具有相当强的清除能力 。提取物中
最强的是槲皮素和 6#物质 ,计算其 IC50发现达到
5. 48μg /mL 和 5. 91 μg /mL ,最差的是 3#,其 IC50
为 17. 44 μg /mL。具体的强弱顺序为:槲皮素≈6
#测试样品>4#测试样品>5#测试样品>3#测
试样品>芦丁>粗提物 。
图 2　不同测试样品对超氧阴离子[ O2 - ] 的清除
效果
Fig. 2　The superoxide anion scavenging capacity of the
extracts
2. 3　乌饭树树叶提取物对羟基自由基[ OH]清除
的影响
羟基自由基[ OH] 是最活泼的自由基 ,也是
已知自由基中氧化能力最强的自由基 ,反应能力极
强 ,对生物机体的危害极大 ,几乎可以与任何大分
子物质(如蛋白质 、核酸 、脂质)等发生作用 ,导致机
体受损和基因突变 ,引起机体衰老和癌变[ 26 - 27] 。
邻菲罗啉-CuSO4-VC-H2O 2发光体系常用于羟
基自由基[ OH ]的清除研究 ,羟基自由基[ OH ]
攻击发光剂邻菲罗啉 ,使之发光 ,其发光强度在一
定的时间范围内与[ OH ] 的量呈一定的比例
关系 。
从图 3可以看出从乌饭树树叶中提取出的物
质对羟基自由基[ OH ]都具有一定的清除能力 ,
但是各个提取成分之间清除能力具有一定的差异 ,
同时也可以看出 ,乌饭树树叶粗提物也具有一定的
清除能力 。提取物中最强的是槲皮素和 6#物质 ,
计算得到其 IC50达到 5. 63 μg /mL 和 5. 99μg /mL ,
最差的是 3#,其 IC50为 22. 45 μg /mL 具体的强弱
顺序为:槲皮素≈6#测试样品>4#测试样品>5
#测试样品>3#测试样品>芦丁>粗提物 。
83　第 4期 王立等:乌饭树树叶中黄酮类色素的抗氧化活性
图 3　不同测试样品对羟基自由基[ OH] 的清除效果
Fig. 3 　The hydroxyl radical-scavenging capacity of the
extracts
3　结　语
乌饭树树叶具有一定的生理功能 ,但是目前利
用不是很多 ,主要原因是其中的成分不够明确。作
者从乌饭树树叶分离出了 4种黄酮类物质 ,并且发
现这些物质具有很强的清除自由基的能力 ,相信这
将有助于乌饭树的进一步开发利用。
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(下转第 88页)
84 食　品　与　生　物　技　术　学　报　　　　　　　　　　　　第 25卷　
蛋白质肽 ,并进行活性探讨 ,充分利用软骨多糖和 蛋白质资源。
表 2 硫酸软骨素粗品和纯品的氨基酸分析
Tab. 2　Individial AA contents of crude and purified ChS
非必需氨基酸名称 质量分数 /(g /Kg)粗品 纯品 必需氨基酸名称
质量分数 /(g /Kg)
粗品 纯品
天冬氨酸(Asp) 11. 89 1. 68 缬氨酸(Val) 2. 63 0. 68
谷氨酸(Glu) 20. 66 2. 94 蛋氨酸(Met) 0. 42 0. 22
丝氨酸(Ser) 6. 61 3. 64 苯丙氨酸(Phe) 1. 92 1. 90
组氨酸(H is) 2. 80 0. 66 亮氨酸(Leu) 3. 57 1. 50
甘氨酸(Gly) 34. 14 2. 16 异亮氨酸(Ile) 1. 68 1. 02
精氨酸(Arg) 20. 02 0. 50 赖氨酸(Lys) 8. 19 0. 17
胱氨酸(Cys - Cys) 0. 99 0. 13 苏氨酸(Thr) 2. 60 1. 11
酪氨酸(Ty r) 0. 86 0. 10 丙氨酸(Ala) 9. 90 1. 28
脯氨酸(P ro) 9. 39 3. 00 羟脯氨酸 9. 98 - -
总非必需氨基酸量 127. 24 16. 09 总必需氨基酸量 21. 01 6. 60
氨基酸总量 148. 25 22. 69
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(责任编辑:杨 萌)
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(责任编辑:朱 明)
88 食　品　与　生　物　技　术　学　报　　　　　　　　　　　　第 25卷