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蒙药梅花草乙醇提取物对肝癌细胞增殖作用的实验研究



全 文 :疾病直接归属于“毒症”范畴,并有详细的辨证治疗方法。
因此本研究选用了具有调节三根之平衡、解毒、增进食欲等
功效的蒙药“伊赫汤”作为治疗药物。
而缺糖转铁蛋白( CDT) 是到目前为止最为特异的酒精
性肝病的诊断和疗效判定指标。据研究,每日摄入含酒精
60g的酒,血清 CDT指标就会显著升高[7]。如果戒酒 2 周
以上,血清 CDT未降低,反而上升,且超过 30%者,表明此
患者还在酗酒[8]。因此 CDT 是诊断慢性少酒精中毒的重
要的特异性指标。本研究结果表明模型组的血清 CDT 指
标与空白组比较,显著上升。给药后硫普罗宁组和伊赫汤
高剂量组的血清 CDT指标显著下降,且与模型组比有统计
学意义。而伊赫汤中剂量组和低剂量组也有下降趋势,但
未出现显著性差异。由此可初步判定蒙药伊赫汤具有解酒
精毒性的作用。对酒精性脂肪肝,酒精性肝病有治疗作用。
有待进一步研究、证实。从而开发应用。
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2016 年 5 月 24 日收稿
△基金项目:内蒙古自治区自然科学基金资助( 2016MS0817 ) ; 内
蒙古自治区高等学校科学研究项目( NJZZ16184)
作者简介:红艳,女,讲师,从事蒙药栽培与鉴定研究。
* 通讯作者:辛颖,女,副教授,从事民族药物研究,E - mail: xiny-
ing20081115@ 163. com
蒙药梅花草乙醇提取物对肝癌细胞增殖作用的实验研究△
红 艳 达拉胡 辛 颖*
( 内蒙古民族大学蒙医药学院,内蒙古 通辽 028000)
摘 要:目的:研究蒙药梅花草的乙醇提取物对人肝癌细胞( HepG2 细胞) 的体外增殖抑制作用。方法:采用 MTT法检测梅
花草乙醇提取物的不同剂量组对 HepG2 细胞增殖的抑制作用; ELISA检测 HepG2 细胞内 Bax和 Bcl - 2 蛋白的表达变化情
况。结果:梅花草乙醇提取物处理 HepG2 细胞 24h后,可以明显抑制 HepG2 细胞的增殖。与对照组相比,梅花草的乙醇提
取物可以明显升高 HepG2 细胞的 Bax蛋白水平,降低 Bcl - 2 蛋白水平( P < 0. 05 和 P < 0. 05) 。结论:蒙药梅花草的乙醇提
取物体外对 HepG2 细胞的增殖有抑制作用,其作用机制与诱导肿瘤细胞的凋亡有关。
关键词:梅花草乙醇提取物; HepG2 细胞;细胞凋亡; Bax; Bcl - 2
中图分类号: R291. 2 文献标识码: A 文章编号: 1006 - 6810( 2016) 10 - 0063 - 03
梅花草( Parnassis palustris L. ) 为虎耳草科梅花草属植
物突隔梅花草的全草或根,又称白侧草、马蹄草等,是蒙古族
历代和民间常用的特色蒙药,蒙古名为那木戛纳、乌力地格
和那木日因查干 -其其格等。在现代蒙医临床应用是用于
治疗肿瘤及其相关疾病的常用蒙药材之一。梅花草气味甘、
苦,无明显毒性,具有清热解毒、破痞、消肿排脓和抑希日等
功效,临床主要用于治疗腑器热性希日病和热性痞症,即治
疗肝、胆肿瘤及部分肠道肿瘤( 如结肠肿瘤) 等,也可以治疗
黄疸型肝炎、咽喉炎、腮腺炎、脉管炎和肺结核等[1,2]。
“破痞”属于一种蒙药功效,相当于现代医学中的抗肿
瘤作用。现代蒙药药理学[3]上认为具破痞功效的蒙药具
有抗肿瘤活性。蒙医理论认为“痞症”可发生于人体的各
个器官,多属于继发于各种疾病的郁结性痼疾,其发病原因
主要是由于维持人体生命的“三根”( 赫依、希日、巴达干)
因某种原因失去平衡,使“七素”( 食物精华、血、肉、脂、骨、
骨髓、精液) 的转化过程中因积聚凝结而成浑浊、恶血激
增、黄水淤积,在赫依的促动作用下,在人体的某一部位形
成痞块。医治痞病,不但要破痞瘤本身同时要判明其发病
原因,对症施治。长期以来,蒙医药学对于“痞症”的治疗
方面已经积累了非常丰富的治疗方法和传统用药经验,临
床疗效显著,并且副作用小,资源丰富。但存在的挑战在于
如何利用现代医药学理念去解释蒙医药“破痞”功效的根
本原因和机制。
据文献查阅,目前未见国内外专家和学者关于蒙药梅
花草的“破痞”功效的活性化学成分和作用机制等方面的
362016 年 10 月第 10 期 中国民族医药杂志
DOI:10.16041/j.cnki.cn15-1175.2016.10.038
研究报道。从天然药物的发展趋势来看,应该将化学成分
和药效学研究结合起来进行研究,应该以天然药物的有效
部位为切入点,对其有效部位进行提取分离,了解其主要活
性成分,再进一步寻找其作用机制。本研究沿着天然药物
研究的这一思路,首先拟用活性追踪法对蒙药梅花草乙醇
提取物的抗肿瘤作用进行研究,旨在通过体外实验初步评
价梅花草的乙醇提取物对人肝癌细胞( HepG2 细胞) 的增
殖是否具有抑制作用,进一步研究梅花草的抗肿瘤效果。
1 实验材料
1. 1 细胞:人肝癌细胞系( HepG2 细胞) 购自上海博谷生
物科技有限公司。
1. 2 仪器: TS100 倒置相差显微镜( 日本尼康) ; SW - CJ -
2F双人双面净化工作台( 苏州智净有限公司) ; DNM -9602
酶标( 北京普朗责任有限公司) ; 3110 系列水套 CO2 培养
箱( 美国 Thermo Scientific) ; GYJ1 /2 - 40L - S超纯水机( 重
庆华创责任有限公司) ; YXQ - LS - 100A 立式压力蒸汽灭
菌器( 上海博讯有限公司) ; DHG - 9203A 鼓风干燥箱 ( 上
海精宏有限公司) ; 98 - 1B型电子调温电热套( 天津市秦斯
特仪器有限公司) ; KQ -100 型超声波清洗器( 昆山市超声
仪器有限公司) ;旋转蒸发仪( 德国 Heidolph 集团) ; SHZ -
DIII循环水式多用真空泵( 郑州长城仪器有限公司) ; 96 孔
培养板及培养瓶( 美国 Corning公司) 。
1. 3 试剂: DMEM 培养基 ( 美国 Gibco 公司) ; 胎牛血清
( 美国 Gibco公司) ; MTT( 北京索莱宝科技有限公司) ;胰酶
( 北京索莱宝科技有限公司) ; 人 B 细胞淋巴瘤因子 - 2
( Bcl - 2) ELISA试剂盒( 上海江莱生物科技有限公司) ; 人
Bcl - 2 相关 X蛋白( Bax) ELISA 试剂盒( 上海江莱生物科
技有限公司) ;生理盐水、乙醇、二甲基亚砜( DMSO) 等试剂
均购自天津科密欧公司。
2 实验方法
2. 1 药物制备:取一定量的梅花草( 500g) ,用 95%的乙醇
浸泡后放于大圆底烧瓶中加热浸煮,每次煮 3h,提取 3 次,
每次所得的煮液合并为提取液,减压浓缩干燥后得浸膏,备
用。经计算得提取率为 33. 26%。用 DMSO 作为梅花草乙
醇提取物的溶剂。
2. 2 MTT实验: HepG2细胞消化,调整细胞浓度为 1 × 105 /
mL,接种于 96孔板中,每孔 100μL,培养 24h,加入不同浓度
的梅花草乙醇提取物,使终浓度为 3. 125、4. 167、6. 25、12.
5mg /mL,置 CO2培养箱内孵育 24h,弃培养液,每孔加 MTT
溶液( 5mg /mL) 50μL,继续孵育 4h,终止培养,小心吸弃孔内
MTT,每孔加 100μLDMSO,振荡 2 ~ 3min,使结晶物充分融
解。选择 490nm波长,在酶标仪上测定各孔 OD 值,记录结
果,计算抑制率。抑制率 = ( 对照组 OD 值 - 实验组 OD
值) /对照组 OD值 ×100%,实验重复 3次,取平均值。
2. 3 ELISA检测 Bax、Bcl -2蛋白表达: HepG2细胞加入梅花
草的乙醇提取物处理 24h后,用 PBS洗涤 2次,用 ELISA方法
测定细胞上清液中 Bax和 Bcl -2蛋白的含量。使用标准曲线
法,按着试剂盒的说明方法进行操作,使用酶标仪检测结果。
2. 4 统计学方法:应用 SPSS17. 0软件进行统计学分析,所有
数据用平均值 ±标准差表示,多组间均数差异性比较采用单
因素方差分析,P <0. 05或 P <0. 01为差异具有统计学意义。
3 实验结果
3. 1 梅花草乙醇提取物对 HepG2 细胞的生长抑制作用:
梅花草乙醇提取物在浓度为 4. 167、6. 25、12. 5mg /mL 时对
HepG2 细胞均表现出抑制其增殖的作用,且随着提取物浓
度的增高而抑制作用逐渐增强。结果见表 1。
表 1 梅花草乙醇提取物对 HepG2 细胞增殖的作用
组别 剂量( mg /mL) OD值 抑制率( % )
对照组
梅花草乙醇提取物
— 0. 98 ± 0. 0788 —
3. 125 0. 92 ± 0. 0788 6. 10
4. 617 0. 85 ± 0. 1811* 13. 27
6. 25 0. 84 ± 0. 0859* 14. 29
12. 5 0. 78 ± 0. 848** 20. 40
注:与对照组相比,*P <0. 05,**P <0. 01
3. 2 梅花草乙醇提取物对 HepG2 细胞 Bax、Bcl - 2 蛋白表
达的影响:与对照组相比,梅花草乙醇提取物浓度为 12.
5mg /mL 时 Bax蛋白表达显著升高,Bcl - 2 蛋白表达明显
降低( P < 0. 05 和 P < 0. 05) 。梅花草乙醇提取物的其他浓
度与对照组比较差异不显著( P > 0. 05) 。结果见表 2。
表 2 梅花草乙醇提取物对 HepG2 细胞 Bax、Bcl - 2
蛋白表达的影响
组 别 剂量( mg /mL) Bcl - 2( U /mL) Bax( U /mL)
对照组
梅花草乙醇提取物
— 31. 33 ± 3. 95 29. 044 ± 3. 67
3. 125 31. 88 ± 4. 06 31. 98 ± 3. 53
4. 617 29. 63 ± 5. 09 30. 32 ± 4. 44
6. 25 29. 63 ± 3. 81 29. 32 ± 4. 56
12. 5 26. 79 ± 3. 83* 35. 23 ± 4. 09*
注:与对照组相比,*P <0. 05
4 讨论
中蒙药既可以作为抗肿瘤的手术治疗、放射性治疗和
化学药物治疗的辅助用药,又可以独立发挥直接的抗肿瘤
作用。它防治肿瘤的作用机理一般是比较复杂的,常常涉
及到多个靶点、多条途径和多种环节的共同作用,包括抑制
肿瘤自身血管的生长、调节机体自体免疫的功能、诱导促进
肿瘤细胞的凋亡和分化、调节肿瘤细胞的信号传导通路、逆
转肿瘤细胞的多重耐药性和抑制端粒酶活性等[4]。此外,
与化学合成药物相比,中、蒙药还具备很多实用性的特点利
于其应用,比如其取材方便、价格低廉、毒副作用小等。所
以中、蒙药及其有效成分的抗肿瘤作用及其机理的研究已
成为当今医药学领域研究的重点。
本实验研究的结果显示,梅花草乙醇提取物的不同剂
量组对 HepG2 细胞可以表现出不同程度的抑制作用,且呈
现剂量反应关系。细胞凋亡是生命的基本现象,可以维持
机体内细胞数量的动态平衡,维持机体内环境的稳定,具有
十分重要的生物学意义。哺乳动物细胞凋亡受基因的严格
调控,研究表明 Bax和 Bcl - 2 的表达高低与细胞凋亡有密
切关系,其中 Bax是细胞凋亡的促进基因,Bcl - 2 是细胞凋
46 中国民族医药杂志 2016 年 10 月第 10 期
亡的抑制基因,Bcl - 2 与 Bax 比值的升高会导致肝癌细胞
凋亡发生的机率增加[5]。实验结果表明,梅花草乙醇提取
物促进 HepG2 细胞中 Bax蛋白的表达,抑制 Bcl - 2 蛋白的
表达,即梅花草乙醇提取物可以诱导 HepG2 细胞凋亡。
综上所述,梅花草乙醇提取物在体外对 HepG2 细胞有
抑制作用,且其作用机制与诱导肿瘤细胞的凋亡有关。
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2016 年 6 月 29 日收稿
藏药加艾灸治疗偏头痛
拉毛才旦 旦知吉
( 青海省藏医院,青海 西宁 810007)
关键词:偏头痛;藏医药 ;藏医艾灸
中图分类号: R291. 4 文献标识码: B 文章编号: 1006 - 6810( 2016) 10 - 0065 - 01
偏头痛是一种反复发作,搏动性的剧烈头痛,常累及一
侧头部,也可双侧受累。表现为发作性的偏侧搏动性头痛,
伴恶心、呕吐,间歇期后可再次发病。在安静、黑暗环境内
或睡眠后头痛缓解,最常见于青年或中年女性,病程漫长,
迁延不愈,给病人带来莫大的痛苦。本人在临床上用藏医
治疗偏头痛,积累了丰富的经验,取得了较满意的效果。
1 病例
患者吉某,男,35岁,教师。患者偏头痛 5年有余,起居不慎
如劳累或紧张、生气、情绪低落诱发头痛。头痛部位或侧或巅常
不固定,头痛波及眼眶眉心,伴有胸满心烦、恶心失眠、食欲不振、
倦怠、昏昏欲睡、掌心灼热等症状,曾简短服用镇痛药及非甾体类
消炎药来缓解头痛的发作多年,虽能缓解,但不能根治。患者舌
质淡,苔白滑,脉沉弦,属于“隆”个体者。诊断为隆偏盛性偏头
痛,以补肾健胃,舒肝理气,活血通络,除湿通窍为原则。黎明空
腹服二十五味珊瑚丸 1g,疏通经脉,行气活血;中午服用如意珍
宝丸3粒,理气通脉;晚上服用二十味沉香丸 3粒,补气安神;在
头部百会穴行温针并选风池、合谷、列缺等处藏医艾灸治疗。因
为百会可疏导头部经气,主治隆引起的头昏、晕厥等。《秘诀补
遗·银匙》:“百会为肌肉脉、骨脉、脑脉汇合之处,称为大结门,灸
此结门,主治隆侵入头部、头晕、倒仆,或者浑浑噩噩意识不清
等”。风池为足少阳与阳维脉的交会穴,按之眼睛隐隐作痛的地
放,祛风活血、通络止痛。列缺为肺经络穴,可宣肺解表,祛风通
络。结合治疗约1月症状改善后停止,偏头痛复发时再进行上
述治疗约5次偏头痛基本痊愈。
2 讨论
偏头痛属于藏医“白脉”病范畴。引发偏头痛的内因
是隆、赤巴、培根等,外因是饮食起居出现不足、过甚、相反
等变化。西医调节神经治疗有一定的效果。但本人用藏医
药与针灸结合并用治疗效果非常明显。
《四部医典》中所述,从脑中发出与“江玛”脉链接,主
要是由隆物质构成司理机体发育、活动的脉称为白脉,也称
水脉,在人体如树根状向下分布。所以,白脉中是以隆物质
循行为主,凡是剧烈活动引起伤热扩散,或中毒、热证等病
邪落于脉到,导致隆功能紊乱,伤及白脉而发白脉病,表现
为半侧头痛,心烦意乱,疼痛时缓时急,舌质干燥,脉率减
慢,尿中浑悬物薄。有的遇风寒疼痛尤甚。三因素之“隆”
具有轻、浮之特性,易上升至头部,因此,偏头痛之疾与
“隆”有关。“隆”是偏头痛的一个重要原因。
藏医艾灸是藏医传统疗术之一,对“隆”所引起的一切寒
性疾病,特别是白脉病等对症治疗能起到非常显著的效果。
藏医艾灸是利用艾绒等物体,在体表固定或疼痛部位烧灼、熏
熨,借助温热性或药力对神经末梢的刺激作用,促进大脑皮质
对脑、自主神经、内分泌、免疫系统的调整,促进血液循环,使得
隆、赤巴、培根人体三大生理物质趋于平衡,达到治疗隆引起疾
病的一种峻外治法之一。藏医艾灸能够封闭脉道,防止病邪
扩散,止痛,抑制隆势上扬,痉挛枯竭之脉络得以灌溉,缺氧缺
血状态迅速改善,达到其他疗法不能治愈的效果。
本人治疗偏头痛病以藏医理论为依据,将藏药与藏医
艾灸相结合,得到了非常满意效果。
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版社,2005.
2016 年 7 月 8 日收稿
562016 年 10 月第 10 期 中国民族医药杂志
DOI:10.16041/j.cnki.cn15-1175.2016.10.039