全 文 ：第 39卷　第 2期 厦门大学学报 (自然科学版 ) Vol. 39　 No. 2
　 2000年 3月 Journal of Xiamen Univ ersi ty ( Natural Science) Mar. 2000　
文章编号: 0438-0479( 2000) 02-0235-06
组培甜菊糖苷的变化研究
收稿日期: 1999-05-21
基金项目: 福建省自然科学基金资助项目 ( C97007)
作者简介: 叶军 ( 1970- ) ,男 ,讲师 .
叶　军 ,陈睦传 ,沈明山 ,洪维廉
(厦门大学生物系细胞生物学研究室 ,福建 厦门　 361005)
摘要:研究了甜菊组培过程中 ,甜菊苷 ( Stev io side,缩写为 SS)和丽鲍迪苷 A( Rebaudioside,缩写为
RA)两种主要甜味成份的变化以及不同浓度的 6-卞氨基腺苷 ( 6-BAP)对愈伤组织合成 SS及 RA的
影响 ,并初步探讨了根部在糖苷合成过程中的作用 .结果表明:甜菊愈伤组织合成糖苷的能力随培养
时间的不同而异 .培养 10 d的愈伤组织可检测到少量残余叶片的 SS及 RA,而培养 20 d, 30 d的愈
伤组织则未检出 .培养 40 d的愈伤组织仅检测到 RA,表明此时的愈伤组织又恢复了合成糖苷的能
力 ,推测与叶绿体的再分化有关 .在含有不同浓度 6-BAP的培养基中培养 2个月的愈伤组织都能够
合成糖苷 ,但所合成糖苷的组分不同 .其中 ,在含有 0. 5 mg /L, 1 mg /L, 2 mg /L 6-BAP培养基中的
愈伤组织只能积累 RA,且随浓度的增加 , RA的含量逐渐降低 ;而含有 3 mg /L 6-BAP培养基中的
愈伤组织只能合成 SS.有根苗可合成 SS及 RA.而无根腋芽苗只能合成 SS.
关键词:组织培养 ; 甜菊糖苷 ; 6-BAP
中图分类号: Q343. 6 文献标识码: A　　　　　　　　　　　　　　　
利用组织培养技术生产甜菊糖苷 ,最早见于 Komatsu等人 [ 1]的报道 ,并获得了专利 . ,
Hsing
[ 2]
, St riedner
[3 ]等人也相继证实所培养的甜菊愈伤组织具有合成甜菊糖苷的能力 .但
Handro
[ 4]
, Sw anson
[ 5]等却得出了相反的结果 ,没有检测到甜菊糖苷的合成 .其中 Swanson进
一步证实 ,只有当甜菊愈伤组织诱导出根后 ,才能够启动甜菊苷的合成 .不过 ,上述学者对甜菊
愈伤组织培养过程中 SS、 RA两种主要甜味成分的变化都没有做进一步的研究 .
细胞分裂素 ( Cytokinin, CTK)是组织培养中不可缺少的植物生长促进物质 .在大多数研
究中 ,认为细胞分裂素对次生代谢产物的合成没有影响 .不过在某些实验中 ,也观察到某种细
胞分裂素对次生产物的积累有明显的作用 [6～ 7 ] .不同的细胞分裂素对于合成次生产物的作用
也不同 [8 ] . 6-卞氨基腺苷 ( 6-BAP)是人工合成的细胞分裂素之一 ,是 6-BA的衍生物 ,在诱导愈
伤组织的形成方面具有很好的效果 ,但对于不同浓度的 6-BAP对甜菊糖苷合成的影响的研究
还未见报道 .本文针对上述不同的结果及存在的问题 ,进一步探讨了甜菊愈伤组织合成糖苷的
能力 ,研究不同浓度的 6-BAP对愈伤组织合成 SS, RA的影响以及培养过程中这两种甜味成
分的变化 .通过对有根苗及无根腋芽苗的培养 ,在植株的水平研究根对糖苷合成的影响 .
1　实验方法
1. 1　有根苗、无根腋芽苗及甜菊愈伤组织的培养
无菌苗培养　甜菊种子经 75%的乙醇 , 0. 1%的升汞杀菌后 ,用无菌水冲洗 5次在无菌条
件下接种于 MS固体培养基上 ,定期更换培养基 .
甜菊愈伤组织的培养　取幼苗叶片 ,切成 0. 25 cm2大小 ,分别接种于 MS培养基+ 2 mg /
L N AA+ 0. 5 mg /L、 1 mg /L、 2 mg /L、 3 mg /L 6-BAP的培养基中 ,一个月后更换新的培养基 ,
进行继代培养 ,获得愈伤组织 .
有根苗、无根腋芽苗的培养 待幼苗生长两个月后 ,将带有腋芽的侧枝剪下 ,分别接种于生
芽培养基 ( M S培养基+ 0. 2 mg /L 6-BAP+ 0. 1 mg /L N AA)和生根培养基 ( M S培养基+ 0. 2
mg /L N AA)上 .
1. 2　甜菊糖苷的提取与检测
培养于 MS+ 2 mg /L N AA+ 0. 5 mg /L 6-BAP培养基中的愈伤组织 ,分别收集培养 10、
20、 30、 40、 60 d的组织块 .培养于 MS+ 2 mg /L N AA+ 1 mg /L、 2 mg /L、 3 mg /L 6-BAP培养
基中的愈伤组织 ,培养至 60 d分别收集 ,烘干研磨后 ,取一定量粉末用滤纸包好 ,置于索氏提
取器中 .先用三氯甲烷提取 3 h脱脂 .弃去提取液 ,残渣再用甲醇 50 mL提取 5 h.甲醇提取液
最后浓缩定容至 20 mL.
分别采集无根腋芽苗和有根苗的叶片 ,烘干后研磨得一定量粉末用滤纸包好 ,按上述方法
提取甜菊糖苷 .
1. 3　高效液相色谱法 ( HPLC)检测甜菊糖苷
标准液　 10 mg甜菊苷纯品溶于 10mL CH3OH∶ H2 O( 62∶ 38) ,使用时稀释 10倍 . 样品
液　吸取 5 mL甜菊苷甲醇提取液 , 15 000 r /min离心 20 min,取上清液直接上样 .色谱条件　
流动相 CH3OH∶ H2O( 62∶ 38) ;流速 1 mg /min,检测波长 210 nm ,进样量 20μL.
2　实验结果
2. 1　培养时间对甜菊愈伤组织糖苷含量及组分的影响
表 1　培养不同时间后 SS及 RA的含量
　　 Tab. 1　 The contents of SS, RA with differ ent culturing time
培养时间 /d 糖苷含量 /μgmg
- 1 .愈伤组织干重
SS RA
0 3. 72 3. 37
10 0. 2 0. 16
20 0 0
30 0 0
40 0 0. 32
　　分别收集在 MS+ 2 mg /L N AA
+ 0. 5 mg /L 6-BAP培养了 10、 20、
30、 40 d的愈伤组织块进行糖苷含量
的测定 . HPLC检测的结果 (如图 1)
表明:培养 10 d的愈伤组织含有少量
叶片残留的 SS及 RA.培养 20、 30 d,
没有检测到 SS及 RA.培养 40 d时 ,
RA重新出现 ,但检测不到 SS.以峰面
积表示 SS及 RA的相对含量 ,标样单
位峰面积所含 SS及 RA的量为基准 ,
计算不同时期愈伤组织中 SS及 RA
的量 ,结果见表 1.
·236·　　　　　　　　　　　　　　　　厦门大学学报 (自然科学版 )　　　　　　　　　　　　　　 2000年
表 2　不同浓度的 6-BAP对糖苷含量的影响
　　 Tab. 2　 The contents of SS, RA in callus with different
6-BAP concentra tions
不同浓度的
6-BAP /mg. L- 1
糖苷含量 /μgmg- 1.愈伤组织干重
SS RA
0. 5 0 0. 71
1 0 0. 6
2 0 0. 46
3 0. 009 0
2. 2　不同浓度的 6-BAP对愈伤组
织糖苷含量及组分的影响
在含有 0. 5 mg /L、 1 mg /L、 2 mg /L 6-
BAP的培养基中经 2个月培养的愈伤组
织只能积累 RA,并且随浓度的增加逐渐
降低 .而培养在含有 3 mg /L 6-BAP培养
基中的愈伤组织只有 SS的合成 (图 2) .可
见 ,培养在含有不同浓度 6-BAP的培养基
中的愈伤组织 ,都具有合成糖苷的能力 .但
合成的糖苷组分却不相同 (表 2) .
　　图 1　标准样及糖苷提取液 HPLC峰图
( a): 甜菊糖苷标准样 ;　　 ( b):接种前甜菊糖叶片糖苷 ;　　 ( c):培养 10 d;
( d):培养 20 d;　　 ( e): 培养 30 d;　　 ( f): 培养 40 d
　　 Fig. 1　 HPLC diag rams o f steviol-g ly co side standa rd and c rude ex trac ts from stev ia
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　　图 2　不同浓度 6-BAP的愈伤组织 HPLC峰图
( a): 含 0. 5 mg /l 6-BAP,　 ( b): 含 1 mg /l 6-BAP,　 ( c): 含 2 mg /l 6-BAP,　
( d): 含 3 mg /l 6-BAP
　　 Fig. 2　 HPLC diag rams o f SS, RA in ca llus with different 6-BAP concentr ations
2. 3　有根苗与无根腋芽苗糖苷含量与组分的比较
用 HPLC检测两种苗叶片中糖苷的成分及含量 .结果表明:无根腋芽苗仍具有合成 SS的
能力 ,且其含量高于有根苗 ,但不能合成 RA.而有根苗除合成 SS外 ,还合成 RA(图 3) .无根
腋芽苗经继代培养后 ,仍具有甜味 ,虽然其甜度远远低于有根苗 .这说明根对合成糖苷的影响
主要是促进 RA的形成 .
3　讨　论
甜菊苷 ( SS)的非糖配基 -甜菊醇是由贝壳杉烯途径产生 [ 9] ,而甜菊醇是在质体中合成 ,并
且贝壳杉烯合成酶活性依赖与质体内膜系统的发育 [10 ] ,因此甜菊愈伤组织合成糖苷的能力与
叶绿体的分化程度密切相关 [11 ] .本实验中愈伤组织培养 20 d到 30 d时均未检测到糖苷的合
成 ,这与此时叶绿体分化程度低有关 .叶绿体分化程度低 ,片层结构不发达可能导致贝壳杉烯
合成酶活性降低 ,从而使甜菊醇的合成受阻 ,进而不能合成 SS及 RA.培养 30到 40 d时 ,叶绿
体开始分化 ,至 60 d仍保持较高的分化程度 ,这一期间检测到 RA的合成 ,说明此时的愈伤组
织又恢复了糖苷的合成能力 ,甜菊醇的合成途径未受到阻抑 ,但合成的糖苷只能积累 RA而不
能积累 SS,这可能是由于此时的培养条件 ( 0. 5 mg /L 6-BAP)激活糖基转移酶 II造成的 [12 ] .
Handro, Swanson等人的实验结果可能是培养基的组分 ,特别是生长素和细胞分裂素的种类及
浓度比例造成叶绿体分化程度的差异所致 ,从而阻抑糖苷合成 .
·238·　　　　　　　　　　　　　　　　厦门大学学报 (自然科学版 )　　　　　　　　　　　　　　 2000年
　图 3　根对糖苷合成的影响
( a): 有根苗 HPLC原始峰图 ,　 ( b): 无根腋芽苗 HPLC原始峰图
　 Fig. 3　 The effects o f roo ts on the stev io l-g lycoside biosynthesis
不同浓度的 6-BAP对 SS及 RA合成的影响主要表现在两个方面:一是通过影响叶绿体
片层结构的分化程度而导致合成 SS的量的差异 .随着 6-BAP浓度从 0. 5 mg /L, 1 mg /L到 2
mg /L的逐渐增加 ,合成 SS的量逐渐降低 .另一方面是通过影响催化 SS转化为 RA的糖基转
移酶 II的活性 ,而导致 RA合成量的差异 ,其中 0. 5 mg /L、 1 mg /L、 2 mg /L的 6-BAP激活糖
基转移酶的活性 ,使合成的 SS迅速转变为 RA,而 3mg /L 6-BAP则抑制糖基转移酶Ⅱ的活
性 ,使合成的 SS不能进一步转变为 RA.
无根腋芽苗仍具有合成 SS的能力 ,但不能合成 RA. Shibata[12 ]从大田苗叶片中提取的粗
酶提取液可催化 SS及 RA的合成 ,而本研究中从无根腋芽苗中没有检测到 RA,这说明无根
腋芽苗中由 SS到 RA的反应受到阻抑 .而有根苗在合成 SS的同时 ,一部分 SS又进一步转化
为 RA,从而使 SS的量相对低于无根苗 .舒世珍 [13 ]曾报道 SS含量与 RA含量呈负相关 .推测 ,
根对糖苷合成的影响可能是合成一些因子来引发 RA的合成 .这些因子作为糖基转移酶的激
活剂起作用 .至于这些因子的性质 ,还有待于进一步研究 .
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·239·第 2期　　　　　　　　　　　　叶　军等:组培甜菊糖苷的变化研究　　　　　　　　　　　　　　
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The Study of Stevia-g lucoside Change in Stevia Tissue Culture
YE Jun, CHEN Mu-chuan, SHEN Ming-shan, HONG Wei-lian
( Dept. of Biol. Xiamen Univ. , Xiamen　 361005, China)
Abstract: The changes of tw o main sw eet content, Stevioside( SS) and Rebaudioside ( RA) , the
effects of 6-benzylaminopurine riboside ( 6-BAP) on the two sw eet content in callus of stevia
rebaudiana, as w ell as the role of roo t in the process of stevioside biosynthesis have been studied.
the result show ed that the ability for stevioside biosynthesis of callus altered w ith the lapse of
cultural time; when cultured 10 days, Trace SS and RA were tested on callus. 20、 30 days later,
neither SS no r RA were tested, w hich indicated the callus had no abi lity for stevioside
biosynthesis. But 40 days la ter, only RA was synthetized. It seems that the stevioside
biosynthesis is related to re-dif ferentia tion of chloroplast. when cultured 60 days later, all the
callus with different concentration 6-BAP do have ability to synthetize SS or RA. The callus in
culture w ith 0. 5 mg /L, 1 mg /L, 2 mg /L 6-BAP can only synthetize RA, w hile the callus wi th
3mg /L 6-BAP only sythetize SS. The roo ted seedling demonstrated the abili ty to synthetize bo th
SS and RA, Shooted seedling only to synthetize SS.
Key words: ti ssue culture; stevia-glycoside; 6-BAP
·240·　　　　　　　　　　　　　　　　厦门大学学报 (自然科学版 )　　　　　　　　　　　　　　 2000年