全 文 ：峨眉四照花茎尖组织培养技术
路承香1 ,2 ,李仲芳2＊ ,王有科1 ,孙飞达3　
(1.甘肃农业大学林学院,甘肃兰州 730070;2.乐山师范学院化学与生命科学系 ,四川乐山 614004;3.甘肃农业大学草业学院,甘肃兰州 730070)
摘要　[目的]探讨峨眉四照花茎尖组织的最佳培养条件。[方法]采取峨眉山 4～ 5年生四照花树体枝条的幼嫩茎尖作为外植体 ,研究
不同生长激素对外植体诱导发育出丛生芽的影响。[结果]结果表明:培养基MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.5 mg/ L和MS+6-BA 2.0 mg/L
+IBA 1.0 mg/L组合对不定芽诱导效果较好。培养基MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/ L组合诱导茎尖产生大量愈伤组织。[结论]该
研究为峨眉四照花的快速繁育、种质资源保存提供了技术依据和参考。
关键词　峨眉四照花;组织培养;茎尖;愈伤组织
中图分类号　Q943.1　　文献标识码　B　　文章编号　0517-6611(2008)04-01416-03
Preliminary Discussion on Tissue Culture Technology for the Stem-tip in the Rare and Protected Plant Dendrobenthamia japonica var.emeinsis
LU Cheng-xiang et al　(College of Forestry , Gansu Agricultural University , Lanzhou , Gansu 730070)
Abstract　[Objective] The aim of the research was to discuss the optimum culture conditions for the stem-tip tissue inDendrobenthamia japonica var.e-
meinsis.[Method] The tender stem-tips on the branches ofD.japonica with 4～ 5 years old were taken as explants to study the effects of different growth
hormone on the induction and development of the clustered buds from explants.[ Result] The medium combinations of MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L
IBA and MS+2.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L IBA had better induction effects on the adventitious buds.A great deal of calli were produced by inducing
stem-tips in the medium combination of MS+0.5 mg/L NAA +2.0 mg/L 6-BA.[ Conclusion] The research provided technical basis and references for
the rapid propagation and gerplasm resource conservation of D.japonica.
Key words　 Dendrobenthamia japonica var.emeinsis.;Tissue culture , Stem-tip;Callus
　　峨眉四照花(Dendrobenthamia capitata var.emeinsis Fang et
Hu.)隶属于山茱萸科 ,四照花属 ,别名石枣 、山荔枝 ,落叶小
乔木或灌木 ,高可达 9 m ,产于长江流域诸省 ,多生长于海拔
600～ 2 000 m的河谷 、溪边及杂木林中 ,喜温暖湿润气候 ,有
一定耐寒力 ,本种树形整齐 ,枝条疏散 ,树姿秀丽 ,夏赏玉花 ,
秋观红果 、红叶 ,是一种稀有的庭园观赏树种 ,也是一种珍稀
保护植物。果实营养丰富 ,可鲜食 ,也可酿酒 、制醋和入药 ,
用途十分广泛[ 1] 。目前对于四照花的研究主要集中在种质
资源调查 、常规栽培和繁育技术的研究上。吕寻等研究了四
照花的栽培与管理技术[ 2] 。韩维栋等对四照花鲜果的营养
成分及其类群种质资源的开发利用作过调查[ 3] 。易咏梅等
进行了四照花种子萌发等方面的研究[ 4] 。而有关峨眉四照
花组织培养的研究未见报道。为此 ,笔者以峨眉四照花的茎
尖作为外植体 ,探讨四照花有效的繁殖方法 ,试图为峨眉四
照花的快速繁育 、种质资源保存提供技术依据。
1　材料与方法
1.1　试验材料　供试材料来源于四川省自然资源研究所峨
眉山生物站(海拔 990 m ,年平均气温 22 ℃)。采 4～ 5年生树
体枝条的幼嫩茎尖 ,装入保鲜袋备用。采集时间分别为 3月
中旬 ,4 、5月的上旬和下旬。
1.2　试验方法
1.2.1　培养基。诱导愈伤组织及芽分化均选用MS培养基
为基本培养基。在愈伤组织诱导培养基中附加不同浓度的
6-BA及NAA进行对比试验;而在诱导芽分化的培养基中附
加不同浓度的 6BA 、NAA及 IBA ,设MS+6-BA +NAA和MS+
6-BA +IBA 2种处理。每个处理中加蔗糖 30g/L 、琼脂 7g/L ,
培养基 pH值调至 5.8左右 。
1.2.2　外植体消毒与接种。将采集的材料先用自来水冲洗
基金项目　四川省教育厅重点项目(2006A128)。
作者简介　路承香(1981-),女 ,甘肃靖远人 ,硕士研究生 ,研究方向:园
林花卉。＊通讯作者。
收稿日期　2007-10-11
干净 ,在超净工作台上用 70%酒精消毒 20 s ,再用 0.1%升汞
消毒 5～ 8 min ,最后用无菌水清洗 5遍。将灭完菌的外植体
用无菌滤纸吸干水分 ,切除茎尖以下较大叶片 ,切取茎尖接
种于愈伤组织诱导培养基上。
1.2.3　培养条件。白天温度(24±1)℃,夜晚温度(21±1)
℃,光照时数 12 h/d 。采用的培养环境为GXZ智能型光照培
养箱 。
1.3　测定项目　外值体接种后每日观察 ,发现有污染 、褐变
的植株后详细记录并及时转接或清除 , 20 d后开始观察外植
体的生长状况 。
2　结果与分析
2.1　采集时间对峨嵋四照花茎尖组织培养的影响　从表 1
可以看出 ,外植体的采集时间对其成活具有很大的影响。3 、
4月为取材和接种的最佳时间 ,而 5月采集的材料接种后几
乎全部褐化。3、4月采集的茎尖颜色为嫩绿色 ,接种后发生
轻微褐变 ,不影响植株的正常生长 ,随着培养时间的延长 ,褐
变逐渐消失;而 5月采集的幼嫩茎尖为浅红色或红色 ,到 5
月下旬有的已变为褐红色 。5月上旬所采材料在接种后第 2
天就发生较严重褐变 ,此时及时转接并将基部切除 ,观察发
现褐变减轻甚至无褐变现象发生。5月下旬所采材料在接种
后 2 h基部已发红 ,随着时间延长 ,颜色越深 ,到第 2天全部
发生严重褐变 。这说明随着气候的变化 ,气温的升高 ,四照
花茎尖所分化的酚类物质可能增加 ,褐变率也随之增高[ 5] 。
2.2　愈伤组织的诱导　从表 2可以看出 ,不同培养基对愈
伤组织的诱导效果有明显差异。方差分析表明 ,MS+6-BA
2.0mg/L+NAA 0.5 mg/L培养基的诱导效果与其他处理差
异在 0.05水平显著 ,对愈伤组织的诱导效果最好 ,外植体生
长快 ,所形成的愈伤组织细密 ,数量大 ,愈伤组织数达到 12
个 ,诱导率达 80.0%(图 1);MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2
mg/L培养基对愈伤组织诱导效果最差 ,形成的愈伤组织松
散 ,数量少 ,愈伤组织数仅为 4 个 ,诱导率仅为 26.7%。同
时 ,在峨嵋四照花愈伤组织的诱导中 ,相同的 6-BA浓度下 ,
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2008 ,36(4):1416-1418　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　理雪莲　责任校对　马君叶
NAA浓度高有利于愈伤组织的形成;而相同的NAA浓度下 , 6-BA浓度高低对愈伤组织的形成没有直接关系 。
表1　采集时间对峨嵋四照花茎尖组织培养的影响
Table 1　Effects of different sampling time on culture of explants
采集时间
Sampling time
月-日
接种数
No.of inoculated
个
褐化状况
Browning situtation
生长状况
Growth status
污染率
Contamination rate
%
愈伤组织数
No.of callus
个
03-16 46 几乎无褐化Almost no browning 生长良好 Growth all right 　　　34.8 　　　33
04-10 50 少量有轻微褐化 A few of explants browning
slightly
生长良好 Growth all right 32.0 32
04-22 60 有轻微褐化 Browning slightly 生长良好 Growth all right 36.7 35
05-09 72 褐化严重 ,仅有几株轻微褐化 Browning severe-
ly , just several assumed browning slightly 几乎无生长Almost no growth 40.3 6
05-21 75 全部褐化死亡All the explants browning and death 无生长No growth 0 0
表 2　不同培养基对愈伤组织诱导的影响
Table 2　Effects of different culture medium on callus induction
基本培养基
Basic medium
6-BA∥mg/ L NAA∥mg/ L 接种数
No.of inoculated∥个
愈伤组织数
No.of callus∥个
诱导率
Induction rate∥%
MS 2.0 0.5 15 　　　　　　12 80.0 a
MS 1.0 0.5 18 13 72.2 b
MS 0.5 0.5 22 15 68.2 b
MS 0.5 0.2 19 9 47.4 c
MS 3.0 0.5 16 7 43.8 c
MS 2.0 0.2 15 6 40.0 c
MS 3.0 0.2 17 5 29.4 d
MS 1.0 0.2 15 4 26.7 d
　注:表中数值均为平均值。采用 LSD法进行方差检验 ,不同字母表示差异在 0.05水平显著。下同。
　Note:Values in above table are mean , followed by a different letter indicate significantly different at 0.05 probabi lity level according to LSD method.The same as below.
图 1　愈伤组织诱导
Fig.1　Induction for callus
2.3　芽的分化　从表 3可以
看出 ,2种培养基配比所形成的
芽增殖系数没有很大的变幅。
方差分析表明 ,MS +6-BA 2.0
mg/L +IBA 0.5 mg/L 和 MS +
6-BA 2.0 mg/L +IBA 1.0 mg/L
处理之间差异不显著 ,而与其
他处理差异在 0.05水平显著 ,
增殖系数分别达到 3.35 和
3.41。由此得出 ,附加了 IBA的
6-BA 2.0mg/L培养基中芽的分
化较多 ,不定芽形成率较高 ,其
中以MS +6-BA 2.0 mg/L+IBA
1.0mg/L培养基对四照花芽分化诱导效果最好(图 2);而在
附加生长素NAA的处理中 ,芽的分化率不高 ,MS+6-BA2.0
mg/L+NAA 0.5mg/L培养基的增殖系数最大 ,仅为 1.53 。可
见 ,在峨嵋四照花的芽诱导分化中 , IBA比NAA效果好 。
图 2　有效芽分化
Fig.2　Differentiation of available bud
表3　不同培养基对芽分化的影响
Table 3　 Effects of different culture medium on buds differentiation
基本培养基
Basic medium
6-BA∥mg/ L NAA∥mg/ L IBA∥mg/ L 接种数
No.of inoculated∥个
分化芽数
No.of buds differentiation∥个
增殖系数
Proliferation coefficient
MS 2.0 　　　0 　　　1.0 22 75 3.41 a
MS 2.0 0 0.5 20 67 3.35 a
MS 1.0 0 1.0 18 35 1.94 b
MS 1.0 0 0.5 21 32 1.52 c
MS 1.0 0.5 0 17 23 1.35 c
MS 2.0 0.2 0 20 29 1.45 c
MS 2.0 0.5 0 15 23 1.53 c
MS 1.0 0.2 0 19 21 1.11 d
　注:增殖系数=分化芽数/接种数。Proliferation coef ficient=No.of buds differentiation/No.of inoculated.
141736卷4期　　　　　　　　　　　　　　　　　路承香等　峨眉四照花茎尖组织培养技术
3　小结与讨论
峨眉四照花愈伤组织诱导培养基以MS+6-BA 2.0mg/L
+NAA 0.5mg/L最好 ,诱导率达 80.0%;芽分化培养基以MS
+6-BA2.0mg/L+IBA1.0mg/L最好 ,且 IBA比 NAA效果好;
最佳接种时间为树体萌芽后的最初 1～ 2个月 ,即 3～ 4月。
在木本植物的组织培养中 ,褐变是普遍存在的一种现
象。褐化是由于植物受伤后体内多酚氧化酶被激活 ,酚类物
质氧化产生醌类物质而造成的。它们会逐渐扩散到培养基
中 ,抑制其他酶活性 ,毒害整个外植体组织[ 6] 。研究表明 ,随
着峨嵋四照花的生长 ,萌芽后时间越长 ,组织培养中的褐化
率越高 ,发生褐变的时间越短 。
试验表明 ,峨嵋四照花丛生芽易诱导产生 ,但生长缓慢 ,
易褐变及污染;愈伤组织易产生 ,但不易分化出不定芽 ,主要
是由于供试材料为野外采集的材料 ,不易消毒。对于四照花
的组织培养及培养基配方还处于摸索阶段 ,目前只能参考木
本植物的组织培养[ 3] 。就组织培养而言 ,四照花最适生根培
养基的确定 、组培苗移栽时间长短的确定 、组培苗化学成分
的测定及其次生代谢产物的成分测定等都是当前工作的
重点。
参考文献
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究进展[ J] .园艺学报 ,2000,27(S):481-486.
(上接第 1324页)
2　结果与分析
术后 ,所有施术牦牛精神状态 、体温及饮食欲等皆正
常。7 d后检查 ,全部施术牦牛的瘤胃壁都与腹膜 、腹肌及
皮肤愈合在一起 ,形成自然瘘管 ,没有出现腹腔感染的征
象。全部施术牦牛的瘤胃试验瘘管都保持到 1.5年以上。
图 2　装置完毕后的外观示意图
Fig.2　The appearance sketch after devices fixed
3　小结与讨论
牦牛体型小 ,手术操作简便 。术后恢复快 ,护理简单 ,
瘘管安装后 1周即可进行试验。因瘘管部位的腹部肌肉张
力较大 ,对于常规手术安置方法 ,若缝合不牢固 ,容易导致
瘘管脱落 ,引起胃液外流 ,造成瘘管周围组织溃烂和长期化
脓 ,进而会导致瘘管松动滑脱难以固定 ,从而改变试验牦牛
的瘤胃内环境 ,影响试验结果。该方法无须缝合固定瘤胃
及其创口 ,也无须荷包缝合安置好的瘘管 ,只需常规闭合手
术通路 ,故安装的瘘管结合牢固 、不易滑脱 、密闭性好 ,具有
创口恢复快 、无感染 、简洁 、实用 、可靠等特点 ,明显优于传
统的常规手术安置方法。
安放瘤胃试验瘘管时 ,皮肤及瘤胃切口一定要尽可能
小 ,使皮肤和瘤胃紧紧箍于瘤胃试验瘘管上 ,这有助于防止
瘤胃液外溢 。皮肤切口宜靠近背部 ,尽量使瘤胃瘘管处于
瘤胃的背囊顶部 ,以避免瘤胃内容物长时间浸泡切口和瘘
管 ,减少瘤胃及腹壁切口术后感染的机会 ,以促进瘤胃壁 、
腹膜以及腹肌的愈合。
除个别性烈牦牛补注了全身麻醉药物外 ,其余皆采用
局部麻醉方法 ,有效降低了手术的危险性 ,保证了施术动物
的安全 。
参考文献
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1418 　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年