全 文 ：不同生长期续断菊中氨基酸柱前衍生RP-HPLC
同时测定及营养特性比较
高向阳1,2， 张 娜1， 史可夫2
(1.郑州科技学院食品科学系，河南 郑州 450064；2.河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002)
摘 要：为比较不同生长期的续断菊中氨基酸含量分布及其营养特性，合理、科学地利用该野生食品资源，以郑州市龙子湖同
一位置不同月份采集的续断菊为样品，采用柱前衍生反相高效液相色谱法同时测定 17 种氨基酸。结果表明：样品中必需氨基酸含
量分布合理，适宜人体吸收利用，相对标准偏差（RSD）为 0.3%~3.2%，加标平均回收率为 97.1%~102.6%。对不同月份采集样品中的
必需氨基酸总量、氨基酸总量、必需氨基酸指数进行比较分析得知，3 月下旬采集的样品中必需氨基酸指数（Essential Amino Acids
Index，EAAI）和营养价值相对较高，最适于采集食用。
关键词： 高效液相色谱； 柱前衍生； 续断菊； 氨基酸； 营养特性； 时间梯度
中图分类号：O657.7+2; Q949.91 文献标识码：A 文章编号：1004-874X(2013)12－0111-04
Simultaneous determination of amino acids in during different
growth periods Sonchus asper by reversed phase HPLC
with pre-column derivatization
GAO Xiang-yang1,2，ZHANG Na1，SHI Ke-fu2
(1. Department of Food Science , Zhengzhou Institute of Science and Technology, Zhengzhou 450064, China;
2.College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)
Abstract: To compare the content distribution and nutritional characteristics of amino acids in the different growth periods of
Sonchus asper (L.) Hill and make rational and scientific use of the wild to determine food resources, taking the Sonchus asper (L.) Hill
collected in same location and different months as samples, simultaneous determination of 17 amino acids by the pre -column
derivatization RP-HPLC method. The results showed that the distribution of the content of essential amino acids in samples were rational,
they were suitable for human absorption and utilization，the relative standard deviation RSD for the parallel determination was 0.3%~
3.2%, the recovery rate with added specimen was held in the range of 97.1%~102.6%. Comparing analysis of essential amino acids, amino
acids and essential amino acid index in samples collected in different months , the essential amino acids index (EAAI) and nutritional
value of samples collected in late March were relatively high, best suitable for collecting and edible.
Key words: HPLC;pre-column derivatization; Sonchus asper(L.) Hill ;amino acids ;nutritional characteristics;different growing periods
续断菊〔Sonchus asper (L.) Hill〕，俗称花叶滇苦菜，菊
科，苦苣菜属，一年两生草本，分布在亚热带、温带地区，喜
光，生于路边和荒野处，花果期 5~10月[1]，常作为野菜食用，
但其氨基酸含量分布及营养价值未见文献报道。 自然界发
现的 180多种氨基酸中，参与蛋白质合成的基本氨基酸有
20多种，而苯丙氨酸、缬氨酸等必需氨基酸最为重要，常作
为评价食品营养价值的重要指标[2]。 目前，氨基酸的分析方
法主要有柱前衍生反相高效液相色谱 法[3]，柱后衍生高效
阳离子交换色谱法[4]、高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培
检测法[5]、毛细管电泳[6]技术以及液相色谱-质谱法[7]等。阳离
子交换色谱与柱后茚三酮衍生相结合的方法是测定氨基
酸含量的经典方法， 该方法实现了氨基酸分析的自动化，
但氨基酸分析仪昂贵，分析时间长，且只能用于氨基酸的
测定[8]，应用技术广泛受限。 近 20年来，柱前衍生反相高效
液相色谱法由于更灵敏、快速，通用性强，灵敏度高，已用
于多种物质的分析[9-14]。 本研究采用柱前衍生 PR-HPLC法
同时测定了不同生长期续断菊中的 17种氨基酸，对必需氨
基酸指数（Essential Amino Acids Index ,EAAI）进行计算，据
此比较、分析其营养特性，为该野生自然资源的合理开发利
用提供基本数据和科学参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
续断菊〔Sonchus asper (L.) Hill〕，叶片绿色，叶脉呈暗
红色，匍匐状，叶片边缘呈锯齿状，采集于郑州市龙子湖同
一位置， 经河南农业大学生命学院朱长山教授鉴定。 于
2011 年 12 月 10 日、2012 年 1 月 11 日、2012 年 3 月 25
日、2012 年 4 月 14 日，分 4 次进行采集，经清洗、烘干、研
磨、过筛后置于广口瓶中保存。
仪器：Waters-515 高效液相色谱仪， 配有 2487 紫外
检测仪、 色谱工作站 （美国 Waters 公司）；VIC-412 型
Sartorius 电子天平 （北京赛多利斯仪器系统有限公司）；
101-2-S-Ⅱ型电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械
厂）； SK5200H 型超声波洗涤器（上海科导超声仪器有限
公司）；XH-C型旋涡混匀机（江苏金坛市医疗仪器厂）。
收稿日期：2013-04-11
基金项目：河南省重点学科建设基金 (10466-X-082301)
作者简介：高向阳(1949-)，男，教授，E-mail：ndgaoxy@163.com
广东农业科学 2013 年第 12 期 111
C M Y K
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2013.12.043
流动相 B（%）
0.0
7.0
12.0
15.0
34.0
70.0
100.0
100.0
0.0
0.0
流动相 A（%）
100.0
93.0
88.0
88.0
88.0
30.0
0.0
0.0
100.0
100.0
时间（min）
0.01
11
13.9
14
29
32
35
42
45
60
表 1 梯度洗脱程序
色氨酸
10
10
赖氨酸
55
43
苯丙氨酸
+酪氨酸
60
63
亮氨酸
70
56
蛋氨酸
+半胱氨酸
35
39
缬氨酸
50
40
异亮氨酸
40
33
苏氨酸
40
27
氨基酸
种类
人体
鸡蛋蛋白
表 2 鸡蛋蛋白和人体蛋白质氨基酸模式
主要试剂：色谱级乙腈、正己烷、三水合醋酸钠、冰醋
酸 （天津市永达化学试剂开发中心）； 衍生试剂 A 和 B、
100 μmol/L 17 种氨基酸混合标样 （Welch Materials 公
司）；试验用水为超纯水，18.3 MΩcm。 流动相 A：称取三水
合醋酸钠 13.6 g于 1 000 mL 水中溶解， 用冰醋酸或氢氧
化钠溶液调 pH 6.50后，量取 465 mL 与乙腈 35 mL 混匀，
抽滤过 0.45 μm 滤膜，备用。 流动相 B：量取水 100 mL 与
乙腈 400 mL混匀，抽滤过 0.45 μm滤膜，备用。
1.2 试验方法
1.2.1 色谱条件 色谱柱：Ultimate Amino Acid，5 μm，4.6
mm×250 mm； 流动相流速 1.0 mL/min； 柱温 40℃； 波长
254 nm；进样量 5 μL；工作站记录时间 60 min，按表 1 程
序进行梯度洗脱。
1.2.2 标准混合溶液的测定 用移液器移取 17种氨基酸
混合标样 100 μL，加 0.90 mL水，混匀，备用。 该标准溶液
各氨基酸的浓度均为 10 μmol/L。吸取 10 μL于衍生管（6
mm×50 mm）中，加入 10 μL 硼酸盐缓冲液和 20 μL 衍生
剂，保持涡旋混合 30 s，移至自动进样小瓶，于 50℃烘箱
中加热 10 min，取出冷至室温，在 1.2.1 色谱条件下进行
氨基酸分析。
1.2.3 试液的测定 将续断菊新样品洗净风干，55℃恒温
干燥约 22 h， 研钵中研磨后过 0.25 mm 尼龙筛 。 称取
0.1000 g置于水解管中，加 6 mol/L盐酸 10 mL，封口，置于
110℃鼓风干燥箱中水解 24 h。 放冷调节 pH值为 8~10，用
水定容至 50.00 mL，混匀，过滤，经 0.45 μm 微孔过滤，备
用。 吸取滤液 10 μL于衍生管中，加 10 μL硼酸盐缓冲液
和 20 μL衍生剂，涡旋 30 s后，移至自动进样微量小瓶中，
置于 50℃烘箱中 10 min，取出冷至室温，在 1.2.1色谱条件
下进行氨基酸分析，由各氨基酸工作曲线或回归方程得到
试液中氨基酸组分的质量浓度 ρ，按下式计算含量：
ω= 50.00×ρ1000m
式中，ω为样品中被测氨基酸组分的质量分数，mg/g；ρ为试
液中被测氨基酸组分的质量浓度，μg/mL；m为称样质量，g。
1.2．4 氨基酸评价方法 按文献推荐的 Penaflorida 的方
法[15-17]计算必需氨基酸指数（EAAI）。将续断菊中蛋白质的
必需氨基酸含量分别与模式蛋白（鸡蛋蛋白）氨基酸进行
比较，按下式计算 EAAI：
必需氨基酸指数（EAAI）＝
n
i ＝ 1
Σ aaiAAi
n
姨
式中，aai为受试蛋白质中某必需氨基酸占必需氨基酸总量
的百分数；AAi为模式蛋白（鸡蛋蛋白）中该必需氨基酸占
必需氨基酸总量的百分数。 由于必需氨基酸指数反映了蛋
白源的必需氨基酸组成与标准蛋白必需氨基酸组成的拟
合程度，因此，可用 EAAI 评价蛋白源的营养特性和价值。
用 EAAI 评价蛋白源时， 提出的实用评价标准为：EAAI＞
0.90为优质蛋白源，0.85＜EAAI≤0.90为良好蛋白源，0.75＜
EAAI≤0.86为可用蛋白源，EAAI≤0.75为不适蛋白源[15-17]。
鸡蛋蛋白和人体蛋白质氨基酸模式[18]如表 2所示。
试验所得数据用 Empower、Excel 等数据软件进行处
理。
2 结果与分析
2.1 柱温的选择
试验发现小幅升温能提高精氨酸（Arg）/苏氨酸（Thr）
的分辨率，同时降低半胱氨酸（Cys）/酪氨酸（Tyr）的分辨
率。 试验结果表明：柱温选择为 40℃时，测定效果较好。
2.2 工作曲线
分别称取氨基酸对照品各 10 mg， 置于 50 mL容量瓶
中， 加水溶解并定容后， 分别逐级稀释为 2.00、8.00、16.00、
40.00、80.00、120.00 μg/mL，得系列对照品标准溶液。 按 1.2.2
方法衍生和测定， 以各氨基酸浓度对峰面积作图绘制标准
曲线， 各回归方程如表 3所示。 由表 3可知， 在工作曲线
2.00~120.00 μg/mL浓度范围内，17种氨基酸的线性关系良
好。
2.3 回收率和相对标准偏差
精确称取续断菊样品 0.1000 g 置于水解管中， 加入
10 μmol/mL 氨基酸标准混合溶液后， 进行加标回收率平
行测定，结果见表 4。由表 4可知，17种氨基酸的平均回收
率为 97.1%~102.6%，RSD为 0.3%~3.2%.
2.4 样品测定结果
在 1.2.1色谱条件下，取标准混合液和样品 1至样品 4
溶液各 10 μL 进行分析，测定峰面积值，对样品进行 3 次
平行测定，检验无可疑值后，以平均含量报告测定结果。 标
准混合氨基酸分析色谱见图 1，样品分析色谱图见图 2～图
112
C M Y K
0.65
0.60
0.55
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
As
p
Gl
u
Se
r
Gl
y
H
is Ar
g
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Al
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Pr
o
Cy
s
峰
11 Aa
l
M
et
lle
峰
15
峰
16 L
eu
Ty
r
Ph
e
峰
20
峰
21
Ly
s
AU
min
图 1 氨基酸标准品的色谱
AU
0.13
0.12
0.11
0.10
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
保留时间（min）
图 3 续断菊样品 2的氨基酸色谱
As
p Gl
u
Se
r
Gl
y
H
is A
rg Th
r
Al
a
Pr
o
Cy
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峰
11 A
al
M
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15
峰
16
Le
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峰
20
峰
21
Ly
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AU
0.13
0.12
0.11
0.10
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
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p Gl
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Gl
y
H
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Cy
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峰
11 A
al
M
et
lle
峰
15
峰
16
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Ph
e
峰
20
峰
21
Ly
s
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
保留时间（min）
图 4 续断菊样品 3的氨基酸色谱
AU
0.13
0.12
0.11
0.10
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
As
p Gl
u
Se
r
Gl
y
H
is
Ar
g
Th
r
Al
a
Pr
o
Cy
s
峰
11 A
al
M
et
lle 峰
15
峰
16
Le
u
Ty
r
Ph
e
峰
20
峰
21
Ly
s
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
保留时间（min）
图 4 续断菊样品 3的氨基酸色谱
相关系数 r
0.9992
0.9996
0.9998
0.9999
0.9994
0.9996
0.9999
0.9999
1.0000
0.9994
0.9997
0.9996
1.0000
0.9953
0.9998
0.9998
0.9982
回归曲线
y=13789x+694.72
y=11181x+6108.3
y=18356x+7861.9
y=28263x-9560.9
y=13152x-3204.3
y=11611x+880.42
y=17067x+1588.5
y=22232x+330.71
y=18702x+16916
y=11716x+861.27
y=20543x+2528.6
y=15617x-2351.5
y=16722x+9378.7
y=20772x-31491
y=13538x+1890.6
y=15025x-7909.1
y=26514x+12074
氨基酸
Asp
Ser
Glu
Gly
His
Arg
Thr
Ala
Pro
Cys
Tyr
Val
Met
Lys
Ile
Leu
Phe
序号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
表 3 氨基酸标准曲线
RSD
(%)
1.3
2.6
2.2
1.3
2.5
2.0
3.2
1.5
0.8
0.7
0.9
1.1
0.3
0.7
1.6
1.3
1.1
加标
回收率（%）
97.7
101.1
102.0
100.4
100.4
101.0
100.7
101.4
99.6
97.9
98.4
101.1
97.1
98.0
102.1
102.6
101.7
9.77
10.11
10.20
10.04
10.04
10.10
10.07
10.14
9.96
9.79
9.84
10.11
9.71
9.80
10.21
10.26
10.17
加标量
（μmol/mL）
10.00
10.00
10.00
10.00
10.00
10.00
10.00
10.00
10.00
10.00
10.00
10.00
10.00
10.00
10.00
10.00
10.00
氨基酸
Asp
Ser
Glu
Gly
His
Arg
Thr
Ala
Pro
Cys
Tyr
Val
Met
Lys
Ile
Leu
Phe
表 4 17 种氨基酸的回收率
回收量（μmol/ mL）
5，不同生长期采集的续断菊样品中氨基酸测定的结果见表
5。由表 5可知，不同月份采集的续断菊样品，总氨基酸含量 3
月>4月>12月>1月；必需氨基酸含量 4月>3月>12月>1月；
半必需氨基酸含量 3月>4月>12月>1月；必需氨基酸占总氨
基酸的比值（E/T）为 4月>12月=1月>3月。
2.5 必需氨基酸指数（EAAI）分析
由表 2、表 5和 EAAI计算公式，可得到不同月份采集
续断菊的必需氨基酸指数，12、1、3、4 月的必需氨基酸指
数分别为 1.313、1.312、1.314 和 1.311。 由此可知，续断菊
样品必需氨基酸指数为 3 月>12 月>1 月>4 月， 且均大于
0.95，为优质蛋白源，即续断菊蛋白质中的氨基酸含量分
布合理，适宜人体吸收利用。
3 结论
本研究采用柱前衍生 PR-HPLC 法同时测定了不同生
长期续断菊中的 17种氨基酸， 并检出了 8种人体必需氨基
酸，其中，3月下旬采集的续断菊样品氨基酸总量较多，必需
氨基酸指数略大；4 月中旬采集的样品必需氨基酸总量较
多。 不同生长期的续断菊中氨基酸含量分布合理，必需氨基
酸指数均大于 0.95，为优质蛋白质源，适宜人体吸收利用。测
定结果表明：续断菊具有较高的食用价值和开发前景。 但由
于 5~10月为续断菊花果期，2月郑州地区天气寒冷，影响了
As
p G
lu
Se
r
Gl
y
H
is
Ar
g Th
r
Al
a
Pr
o
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s
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11 A
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峰
20 峰
21
Ly
s
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
保留时间（min）
图 2 续断菊样品 1的氨基酸色谱
AU
0.13
0.12
0.11
0.10
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
113
C M Y K
263-282.
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2012 年
4 月采集
8.61
5.91
13.51
2.43
8.46
10.16
8.20
57.28
8.32
13.70
23.83
11.73
8.27
65.85
13.86
4.66
20.53
14.69
15.50
69.24
192.38
0.30
2012 年
3 月采集
9.27
4.50
13.58
0.96
8.88
9.67
6.99
53.85
7.87
13.24
20.95
11.12
13.53
66.71
14.15
5.86
26.03
27.41
14.25
87.70
208.25
0.26
2012 年
1 月采集
6.82
3.43
10.09
1.32
6.87
7.12
5.45
41.10
6.79
10.64
17.42
7.09
7.70
49.64
10.96
3.93
18.18
16.72
11.74
61.53
152.27
0.27
2011 年
12月采集
7.70
3.53
11.86
0.88
7.43
8.16
6.04
45.6
6.79
10.14
17.55
8.15
9.95
52.58
11.07
5.00
21.56
16.50
13.50
67.63
165.82
0.27
氨基酸种类
Thr*
Val*
Met*
Ile*
Leu*
Phe*
Lys*
小计 *
Ser
Gly
Tyr
Arg
Cys
小计
Ala
His
Glu
Pro
Asp
小计
总氨基酸
必需氨基酸 /氨
基酸总量（E/T）
表 5 不同生长期续断菊样品中氨基酸测定结果 （mg/g）
注：“*”为必需氨基酸。
续断菊的正常生长，产量较低。综合考虑，3月下旬续断菊的
长势良好，氨基酸营养价值较高，适于采集食用。
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（上接第 100页）
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