全 文 ：收稿　2001-11-23　　　　修定　2002-01-25
元宝草愈伤组织诱导和器官分化
曾虹燕(湘潭大学化工学院 ,湖南湘潭 411105)
周朴华(湖南农业大学理学院 ,长沙 410128)
Callus Induction and Organogenesis of Hypericum sampsonii
ZENG Hong-Yan(College of Chemical Engineering , X iangtan University , Xiangtan , Hunan 411105)
ZHOU Pu-Hua(College of Natural Science , Hunan Agricultural University , Changsha 410128)
提要　在 2 , 4-D 1 或 2 mg·L-1的 MS 培养基上 , 愈伤组织极易诱导 , 生长速度快。在 6-BA 2 mg·L-1的 MS 培养基上带芽
愈伤组织继代培养能力强 ,繁殖系数高。带叶茎段在 BA或 KT 的诱导下 ,结节可直接产生不定芽 , 并分化成一圈成簇的丛
芽。
关键词　元宝草　组织培养　解剖学观察
　　元宝草系藤黄科金丝桃属的多年生药用草本
植物 , 是我国的特有种[ 1] 。它的药用价值引起了人
们的极大关注 , 对此类药用植物的需求量日增[ 2] 。
目前 , 其原料植物主要用同属的贯叶连翘(Hyper-
icum perforatum), 而对此属的其它种类资源还很
少研究开发。本文研究了元宝草愈伤组织的诱导
和器官分化 , 以期能为元宝草的开发和利用提供
参考 。
材料与方法
　　元宝草(Hypericum sampsonii)采自湖南长沙
郊区 。
取元宝草地上部分用自来水冲洗后 ,用 70%
的酒精浸泡 5 s ,再经 0.1%HgCl2 消毒 5 ～ 8 min ,
无菌水冲洗 4 ～ 5次后 ,在超净工作台上 ,将叶切成
0.7 cm×0.7 cm 方块 ,茎和结节切成 1.5 cm 长的
节段 ,分别接种在培养基中培养。愈伤组织诱导培
养基为:(1)MS+2 ,4-D 1 mg·L-1(单位下同);(2)
2 ,4-D 2;(3)MS+2 ,4-D 1+6-BA 0.2;(4)MS+2 ,
4-D 2+BA 0.2 。器官分化培养基为:(1)MS+6-
BA 1+KT 0.5;(2)MS+6-BA 2+KT 0.5;(3)MS
+KT 1+6-BA 0.5;(4)MS+K T 2+6-BA 0.5;
(5)MS+6-BA 2;(6)MS+KT 2。生根培养基为:
(1)MS+NAA 1+IAA 0.2;(2)MS+IAA 1+NAA
0.2;(3)MS+NAA 0.2;(4)MS+IAA 0.2;(5)MS
。所有培养基均含 30 g·L-1蔗糖 ,7 g·L-1琼脂 ,
pH 5.8 ,培养温度(25 ±2)℃,光照 12 h·d-1 ,用
300 lx 的弱光照诱导愈伤组织 , 1 000 lx 的强光照
诱导芽的分化和壮苗 。
石蜡切片时 ,培养材料以 FAA 固定液固定后 ,
用常规石蜡切片法制片 ,切片厚度 8 ～ 10μm ,苏木
精液染色 ,在Olympus显微镜下观察并摄影。
提取与测定总黄酮时 ,准确称取各种样品 2.5
g ,分别置于索氏提取器内用石油醚回流抽提至其
内石油醚无色(约 7 h),除脂 ,挥干石油醚 。再加入
200 ml甲醇水浴回流至无色(约 7 h),回收甲醇至
干 ,用甲醇溶解 ,并定容至 100 ml容量瓶中 ,作为
供试样液。分别准确吸取 1.0 ml各供试样液 ,置
于 25 m l容量瓶中 ,每个取 3份 ,分别加入 5%亚硝
酸钠溶液 0.3 ml ,摇匀 ,放置 6 min ,再加入 10%硝
酸铝溶液 0.3 ml , 摇匀 ,放置 6 min ,加入 1 mol·
L
-1
NaOH 溶液 4 ml ,然后分别用甲醇溶液稀释至
刻度 ,摇匀 ,放置 15 min ,以不加样品为空白对照 ,
用美国 BECKMAN 公司的 DU-60型紫外/可见分
光光度仪 ,在 500 nm 处测定吸收度 ,以溶液浓度
(A)为横坐标 ,吸收度(C)为纵坐标 ,输入计算机
的回归方程为:C =9.3690A -0.0373 , r =0.
9985 ,计算其总黄酮的含量 。
实验结果
1　元宝草组培物与其自然株中总黄酮含量的比较
　　从表1可知 ,元宝草自然植株中总黄酮的含量
231植物生理学通讯　第 38 卷 第 3 期 , 2002年 6月
DOI :10.13592/j.cnki.ppj.2002.03.007
表 1　不同来源元宝草中的总黄酮含量
n=3　
样品 总黄酮含量/%
试管苗 5.368
带芽愈伤组织 5.868
花前植株 4.368
花期植株 4.505
果实 4.527
为 4.368%,带芽点的愈伤组织中的总黄酮含量高
出前者 1.540%,为 5.868%。
2　不同生长调节物质配比对愈伤组织诱导的效应
　　外植体在附加有 2 , 4-D 的 MS 培养基上均能
诱导出愈伤组织(图 1-a),诱导率 100%。在附加
有 2 ,4-D+6-BA的 MS复合培养基上培养 ,诱导率
也为 100%,但时间推迟 4 ～ 6 d ,愈伤组织较致密 ,
少数愈伤组织出现芽点。
3　不同生长调节物质配比对外植体及愈伤组织不
定芽的诱导效应
　　茎 、叶外植体接种在器官分化培养基上均未长
出不定芽 , 仅在伤口处产生一些松散颗粒状愈伤
组织。而带叶的节段在结节处周围一圈产生芽状
突起 , 并发育成丛芽(图 1-b)。叶和茎段来源的愈
伤组织分化芽的能力非常强 , 在分化培养基上均
能再生出大量的不定芽(图 1-c)。带芽的愈伤组织
在 6-BA 2 mg·L-1+MS培养基上的继代增殖能力
旺盛 , 每 20 ～ 25 d继代 1次 , 其增殖能力可保持 2
年半不衰减 , 且不出现玻璃化苗(图 1-d)。此外 ,
带芽的愈伤组织中的总黄酮含量比自然植株的高。
愈伤组织的小苗需转管培养才能成苗(图 1-e)。
4　组培苗的生根
　　待不定芽长至 2 cm 左右(图 1-e)的小苗时 ,切
下小苗转入生根培养基中 , 25 d后统计结果(表 2)
表明:在 NAA 0.2 mg·L-1+IAA 1 mg·L-1+MS
和NAA 1 mg·L-1 +IAA 0.2 mg·L-1 +MS 的生
长调节物质组合中 ,并不能诱导小苗产生不定根;
在含有 IAA 0.2 mg·L-1的 MS 培养基上 ,生根率
仅有 14.7%;含有 NAA 0.2 mg·L-1的 MS 培养基
中生根率为 28.2%;无生长调节物质的生根率极
高 ,达 100%,并可长成完整植株 。从不定根分化
看 ,不同组合的诱导效应有显著差异 ,无生长调节
物质的生根效果最好 ,所以不经过生根培养基而直
接用无生长调节物质培养基生根(图 1-f 、g 、h),且
移栽后试管苗极易成活。
表 2　生长调节物质对元宝草试管苗生根的影响
生长调节物质组合/
mg·L-1
接入苗数/
个
生根苗数/
个
生根率/
%
MS 145 145 100
MS+NAA 1+IAA 0.2 146 0 0
MS+NAA 0.2 149 42 28.2
MS+NAA 0.2+IAA 1 142 0 0
MS+IAA 0.2 144 21 14.7
　　每一种浓度下小苗接种数为 145株左右 , 25 d后观察结果。
5　愈伤组织和带叶茎段结节处不定芽发生的解剖
学观察
　　当分化培养基上叶和茎段的愈伤组织及带叶
茎段有芽点产生时 , 分别将它们固定在 FAA 固定
液中 , 按常规石蜡切片法制片 。从切片上可以观察
到:愈伤组织外层产生芽原基(图 2-a箭头所示);
茎段在含 2 , 4-D 2 mg·L-1 +6-BA 0.2 mg·L-1的
MS培养基上诱导的愈伤组织 , 由于有 6-BA , 在愈
伤组织外层也产生芽原基 , 芽原基伸长成小芽 , 其
基部形成腋芽原基(图 2-b箭头所示), 来源于愈伤
组织的芽分化属于外起源;从切片纵切面看 , 带叶
茎段结节处的分化培养产生的不定芽 , 主要来自
叶隙细胞启动分裂形成的胚性细胞团 , 由胚性细
胞发育为芽原基(图 2-c箭头所示), 以后在带叶茎
段的结节处形成一圈丛芽(图 1-b)。这是元宝草离
体培养中由外植体上直接产生不定芽 ———器官发
生型的一个典型特征 , 它可能与枝 和枝隙的物
质运输分配十分活跃有关 。
讨　　论
　　前人[ 3～ 5]报道 ,金丝桃属植物贯叶连翘和多蕊
金丝桃(H .hookerianum)在含有 IAA 、NAA 和
2 ,4-D的培养基中均可诱导产生愈伤组织;由
NAA 、2 , 4-D和 6-BA 可诱导产生愈伤组织和不定
芽;在含 NAA 、IBA 和不加生长调节物质的 MS 培
养基上可长根 ,继而形成植株。本文采用的同属植
物元宝草得到的结果与已有报道有些差异 。本文
232 植物生理学通讯　第 38 卷 第 3 期 , 2002年 6月
图 1　组织培养中不同生长阶段的元宝草
　　a:叶 、茎段愈伤组织;b:结节处的丛芽;c:丛芽增殖;d:带芽愈伤组织继代培养;e:试管小苗(2～ 3 cm);f:试管小苗(3～ 8 cm);g:田间生
长的试管苗(18～ 22 cm);h:试管苗开花结果(80～ 100 cm)。
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图 2　愈伤组织形成和器官发生的组织学观察
a:愈伤组织芽分化;b:茎段产生的芽分化;c:带叶茎段结节处芽分化。
结果表明 ,2 ,4-D虽能诱导愈伤组织生成 ,但不能诱
导产生不定芽;NAA 和 IAA 组合诱导不定根的能
力较差;6-BA 浓度在 2 mg·L -1时 ,就能很好地诱
导不定芽的分化;不加生长调节物质也可产生大量
的不定根 。由此看来 ,元宝草 、多蕊金丝桃和贯叶
连翘的组织培养是有差别的 ,这可能是种间差异造
成。总之 ,元宝草与多蕊金丝桃和贯叶连翘一样 ,
极容易形成愈伤组织 ,且生长速度快 ,其愈伤组织
和带叶的节段都可以产生不定芽而形成再生植株 ,
并且繁殖系数很高。叶腋深处的薄壁组织在生长
调节物质的诱导下 ,均能产生愈伤组织并分化成一
圈成簇的丛芽 ,这是元宝草能从外植体上产生带有
器官型不定芽的典型特征 ,也是元宝草结节脱分化
和再分化所独有的。
参考文献
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分册).北京:科学出版社 , 1990.1～ 72
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234 植物生理学通讯　第 38 卷 第 3 期 , 2002年 6月