全 文 ：第 23卷　第 1期 中　南　林　学　院　学　报 Vol. 23　 No. 1
　 2003年 2月 JOU RN AL OF CENT RAL SOUT H FO RESTRY UNIV ERSITY Feb. 2003　

[文章编号 ] 1000- 2502( 2003) 01- 0032- 05
大叶榉愈伤组织诱导与继代培养的影响因素
金晓玲 1 ,何　平 2
( 1.浙江师范大学环境与生命科学学院 ,浙江 金华 321004; 2.中南林学院 ,湖南株洲 412006)
[摘　要 ]　以大叶榉种子的子叶、胚轴、顶芽、嫩枝叶片和茎段等为外植体 ,对大叶榉进行愈伤组织诱导及继代培养研究 .结果表明:
不同外植体的愈伤组织诱导能力有差异 ,其诱导率按高低顺序排列依次为子叶、胚轴、叶片、茎段和顶芽 ;愈伤组织质地、颜色、生长速
度与基本培养基、外源激素有很大的关系 ,基本培养基以 WPM培养基最好 ;最佳诱导培养基不适合继代保存 ;在培养基中附加抗氧
化剂并调整激素种类 ,可较好地防止褐变现象 .
[关键词 ]　生物技术 ; 组织培养 ; 愈伤组织诱导 ; 继代培养 ; 大叶榉
[中图分类号 ]　 Q944. 6　　　　 [文献标识码 ]　 A
Study of Callus Induction and Subculture for Zelkova schneideriana
JIN Xiao-ling
1 , HE Ping
2
( 1. Zh ejiang Normal Univ ersi ty, Jinhua 321004, Zh ejiang, China;
2. Cent ral South Fores try Universi ty, Zh uzhou 412006, Hunan , China)
Abstract: To res earch the callus induction and su bcul tu re, w e use v ariou s explan ts of Zelkova schneideriana Hand. -Maz z. . Th e
result s sh ow that the callus inductivit ies for various ex plants are dif f erent , and f rom high to low is cotyledon, emb ryonic axe, tender
leaf , node s tem and top buds. Some basic features of the cal lus , such as texture, color and grow th rate, are clos ely related to th e
basic medium, hormone. It i s recommended that the explants be cul tured on W PM. It i s n ot sui table for cal lus subcul tu re to be kept
on th e ind uction medium because s erious b row ning is to be p roduced. By adding an oxidation-resis tan t active compound and ad jus ting
combinat ion of dif f erent ho rmone types , the b rowning disappears and cel ls are kept vigorous.
Key words: biotechnolog y; callus induction; subcu lture; ti ss ue cu lture; Zelkova sch neideriana Hand. -Mazz.
大叶榉 Zelkova schneideriana Hand. - Mazz又名血榉 ,为榆科榉属植物 ,全世界共 10种 ,我国仅 3种 .大
叶榉原产中国大陆 ,为亚热带落叶阔叶乔木 ,在海拔 200～ 1 100 m都有生长 ,在云南和西藏可达 1 800～ 2 800
m [1 ] .大叶榉花小 ,落花落果现象严重 ,且种子的结实率仅在 10%左右 .其已被列为国家二类保护植物 [ 2] .
大叶榉木材坚硬 ,密度大 ,有光泽 ,而且耐用 ,为阔叶树材之上品 .大叶榉还具有耐烟尘、抗有毒气体的特
点 ,而且具有很强的抗风能力 ,在营造优质的人工林中起着重要的作用 .然而 ,我国榉树资源缺乏 ,用材榉木主
要依靠进口 .植物组织细胞培养技术在农林生产上的应用越来越受到人们的重视 ,并在许多植物上已有不少成
功的报道 ,如柠檬、杜仲、枣树、苹果、槐树、杨树和梨等 [3～ 8 ] ,但对有关硬木树种这方面的研究报道很少 .开展榉
树组织培养研究 ,对加速优良榉树苗木的繁殖 ,制备人工种子 ,开展细胞融合和体细胞杂交等生物技术育种有
着极其重要的意义 ,为此 ,我们从 2000年开始 ,对大叶榉组织培养进行了较系统的研究 .本文报道了外植体的
来源、培养基的种类、激素的种类和浓度、光照等因素对大叶榉愈伤组织诱导和继代培养的影响 .
[收稿日期 ] 2002-07-18
[基金项目 ] 国家林业局高技术项目“榉树工厂化微繁及造林技术研究” ( 99- 14)的部分内容 .
[作者简介 ] 金晓玲 ( 1963- ) ,女 ,浙江东阳人 ,副教授 ,中南林学院在读博士 ;　何　平 ( 1957) ,男 ,湖南湘乡人 ,教授 ,博士 ,中南林学院
博士生导师 ,主要从事环境生态、生物技术、植物生理及森林旅游等方面的研究 ,现已调中国国际工程咨询公司 (地址: 北京市 ;邮编:
100044)工作 .
DOI : 10. 14067 /j . cnki . 1673 -923x . 2003. 01. 007
1　材料与方法
1. 1　材　料
供试材料有大叶榉种子的子叶、胚轴、成年树萌发的嫩枝 (春季和夏季 )、成年树秋冬季休眠枝水培萌发的
嫩枝 .种子和休眠枝采自华中农业大学植物标本园 ,成年树的当年萌发的嫩枝采自中南林学院植物标本园 .
1. 2　实验方法
于 2001年 4～ 6月份取成年树上生长的大叶榉幼嫩枝条 ; 11月至翌年 3月份取休眠枝水培的幼嫩枝条 .
11月初采集种子 ,部分放在室温保存 ,部分置于 4℃冰箱保存 .
先用中性洗衣粉将种子洗涤 ,流水冲洗彻底后 ,移到超净工作台面上 ,用 70%的酒精表面消毒约 2 min,转
入 0. 2% HgCl2溶液中浸 10 min,用无菌水冲洗 5～ 6次 ,每次 5～ 10 min.在无菌条件下 ,用解剖刀切开外种
皮 ,取出种子接种到 WPM培养基上 ,待种子萌发后 ,切取子叶和胚轴 ,接种在不同培养基上 .
幼嫩枝条的消毒过程除用 70%的酒精表面消毒 30 s, 0. 1% HgCl2浸 7 min外 ,其它操作与种子消毒相同 .
将顶芽、嫩叶切成 3 mm× 3 mm的小块、嫩茎切成 3 mm长的小段 ,分别接种到不同的培养基上 .基本培养基含
蔗糖 20 g· L- 1 ,琼脂粉 6 g· L- 1 ,用 HCI和 NaOH调 pH值至 5. 7～ 5. 8,于 121℃高温高压灭菌 20 min.培养
条件: ( 25± 2)℃ ,黑暗 .每周观察一次 , 1个月后统计愈伤组织诱导率 .继代培养: 每个继代周期为 4周 ,继代培
养基为 WPM+ 2. 0BA mg· L- 1+ 2. 0N AA mg· L- 1+ 20. 0 g· L- 1蔗糖+ 6. 0 g· L- 1琼脂 ,附加抗坏血酸
( Vc)、聚乙烯吡咯烷酮 ( PV P)、硝酸银和活性炭等抗氧化剂 .比较不同抗氧化剂对愈伤组织褐变的抑制情况 .
激素浓度单位除特别注明外 ,都为 mg· L- 1 .
表 1　基本培养基对愈伤组织诱导的影响
Table 1　 Ef fects of basic medium on the callus induct ion for stem
培养基 接种数
/个
愈　　伤　　组　　织
质地 出愈数 诱导率 颜色 生长
WPM 60 疏松 58 97% 淡黄色 快
M S 60 较紧密 42 70% 黄色 慢
1 /2M S 60 较紧密 24 40% 黄色 慢
B5 60 紧密 18 30% 黄色 慢
2　结果与分析
2. 1　基本培养基对愈伤组织诱导的影响
将 嫩茎 分 别接 种 在 W PM、 M S、
1 /2M S(大量元素减半 )、 B5等 4种基本培
养基上 ,附加 1. 0BA mg· L- 1+ 1. 0N AA
mg· L- 1 ,结果见表 1.由表 1可知 , WPM
(基本培养基 )诱导效果最好 , M S次之 , 1 /2M S和 B5的诱导效果较差 .分析这 4种培养基的无机物质成分发
现 ,大量元素的含量以 M S最高 , M S还含有较高的铵态氮 ,硝态氮 B5的含量最高 . WPM中含有较高的钙离
子 ,且不含 KI.由此看来 ,大叶榉子叶愈伤组织诱导及生长可能与培养基中无机盐含量 ,特别是钙离子的含量
有关 .
2. 2　外源激素对愈伤组织诱导的影响
取嫩枝上的嫩叶接种在不同种类、不同含量外源激素的 WPM培养基上 ,愈伤组织诱导情况如表 2所示 .
从实验结果看 ,大叶榉嫩叶愈伤组织的诱导必须依赖于植物激素 ,在不含激素的培养基中不能诱导愈伤组织的
形成 .而单独添加生长素和细胞分裂素 ,或生长素与细胞分裂素混合使用都可诱导愈伤组织的产生 .
在含 2, 4-D的 W PM培养基中 ,愈伤组织诱导率普遍较高 .接种 5 d后 ,外植体开始膨大 , 10 d左右在切口
处产生愈伤组织 , 15 d左右整个叶子表面长满愈伤组织 .单独或混合使用 2, 4-D,所形成的愈伤组织质地普遍
较松软 ,呈海绵状 ,生长较快 .当 2, 4-D的体积质量高于 4. 0 mg· L- 1时 ,愈伤组织的诱导率下降 ,形成的愈伤
组织成水浸状 (见图 1- ( 1) ) ,颜色加深并易褐化 .
在含 BA或 BA与 NAA、 KT、 ZT、 IBA等配合使用时 ,出现愈伤组织的时间比含 2, 4-D的要迟 2～ 3 d,形
成的愈伤组织质地也较致密 , (见图 1- ( 2) ) .随着 BA的体积质量增大 ( 8. 0 mg· L- 1 ) ,形成的愈伤组织的质
地变得更加致密 ,且褐化现象加重 .
33第 1期 金晓玲等: 大叶榉愈伤组织诱导与继代培养的影响因素
表 2　不同种类、不同含量外源激素对嫩叶愈伤组织诱导的影响
Table 2　 Ef fects of various hormones concentration on the callus induction for browse
激素及含量
/ (mg· L- 1 )
愈　伤　组　织
质地 诱导率 颜色 芽 根†
激素及含量
/( mg· L- 1 )
愈　伤　组　织
质地 诱导率 颜色 芽 根†
2, 4-D0. 1 疏松 100% 淡黄色 - - BA1. 0+ K T1. 0 较致密 52% 黄褐色 + -
2, 4-D1. 0 疏松 83% 淡黄色 - + BA1. 0+ ZT1. 0 较致密 63% 黄褐色 + -
2, 4-D4. 0 疏松 ,水浸状 85% 黄褐色 - - BA1. 0+ IBA1. 0 较疏松 55% 黄褐色 - +
2, 4-D1. 0+ N AA0. 1 较疏松 70% 淡黄色 - - BA0. 5+ 2, 4-D1. 0 疏松 100% 淡黄色 - -
2, 4-D2. 0+ N AA0. 1 较疏松 75% 淡黄色 - - BA0. 5+ 2, 4-D2. 0 疏松 ,水浸状 90% 黄褐色 - -
BA0. 1 较致密 52% 白色 - - BA2. 0+ 2, 4-D2. 0 疏松 86% 黄褐色 - -
BA1. 0 较致密 80% 白色 + - KT0. 5+ BA0. 2+ 较致密 62% 白色 - -
BA3. 0 致密 86% 淡黄色 + - N AA0. 5
BA8. 0 致密 40% 黄色 - - 0 - 0% - - -
　† 　+ 表示少数 , - 表示没有
表 3　不同外植体愈伤组织诱导情况比较
Table 3　 Comparisons of the cllus induction for dif ferent explant culture after 30 days
激素及含量
/( mg· L- 1 )外植体
愈　伤　组　织
接种数 出愈数 诱导率
激素及含量
/( mg· L- 1 ) 外植体
愈　伤　组　织
接种数 出愈数 诱导率
BA 1. 0 子叶 30 25 83 BA2. 0+
N AA1. 0
子叶 30 27 90胚轴 30 28 93 胚轴 30 25 83叶片 48 30 62 叶片 48 34 70顶芽 25 12 48 顶芽 25 17 68茎段 48 24 50 茎段 48 33 69
BA 3. 0 子叶 30 29 97 BA0. 5+
2, 4-D1. 0
子叶 30 29 97胚轴 30 27 90 胚轴 30 22 73叶片 48 27 56 叶片 48 48 100顶芽 25 20 80 顶芽 25 15 60茎段 48 32 67 茎段 48 44 92
BA1. 0+
NAA1. 0
子叶 30 26 87 2, 4-D1. 0 子叶 30 30 100胚轴 30 30 100 胚轴 30 27 90叶片 48 46 96 叶片 48 40 83顶芽 25 8 32 顶芽 25 9 35茎段 48 16 33 茎段 48 35 71
2, 4-D 2. 0 子叶 30 28 93 2, 4-D2. 0 顶芽 25 0 0胚轴 30 21 70 茎段 48 34 71叶片 48 48 85
图 1　不同外植体诱导的愈伤组织
Fig. 1　 The callus induction from diff erent explants
( 1)嫩叶在 WPM+ 1. 0 mg· L- 1 2, 4- D上形成的愈伤组织 ;
( 2)嫩叶在 WPM+ 1. 0 mg· L- 1BA上形成的愈伤组织 ;
( 3)子叶在 WPM+ 3. 0 mg· L- 1BA上形成的愈伤组织 ;
( 4)顶芽在 WPM+ 1. 0 mg· L- 1BA上形成的愈伤组织 ;
( 5)胚轴在 WPM+ 2. 0 mg· L- 1BA+ 1. 0 mg· L- 1NAA上形成的愈伤组织 ;
( 6)茎段嫩叶在 W PM+ 0. 5 mg· L- 1BA+ 1. 0 mg· L- 1 2, 4- D上形成的愈伤组织
2. 3　不同器官对愈伤组织
诱导的影响
　　将大叶榉的子叶、胚轴、
嫩枝的叶片、顶芽和茎段等
外植体接种在附加不同激素
的 WPM培养基上 ,结果见
表 3.从表 3可以看出 ,不同
的外植体 ,愈伤组织诱导存
在较大的差异 ,但总的趋势
相同 .诱导率按大小顺序排
列为:子叶≥胚轴≥叶片≥
茎段≥顶芽 .这说明大叶榉
外植体脱分化难易程度与其
生理状况有关 .从表 3还可
以发现 ,不同外植体诱导愈
伤组织的最适激素配比也不同 .子叶愈
伤组织的诱导率普遍较高 ,在 2, 4-D1. 0
中可达 100% ,但此种愈伤组织水浸状
比 较 严 重 , 而 且 较 易 褐 化 , 在
3. 0 mg· L- 1 BA中形成的愈伤组织生
长较快 ,颜色为白色 ,也较松散 ,诱导率
也可达 97% (见图 1- ( 3) ) ;胚轴在
BA2. 0+ N AA1. 0的培养基中生长最
好 ,诱导率也达 100% (见图 1- ( 5) ) ;叶
片和茎段的最佳激素配比为 BA0. 5+
2, 4-D1. 0,愈伤组织诱导率分别达
100%和 92% (见图 1- ( 2) , ( 6) ) ;实验
初步认为 , BA3. 0的激素配比较适合顶
芽的愈伤组织诱导 (见图 1- ( 4) ) .
在实验过程中还发现 ,愈伤组织诱
导率与采样的季节有关 ,秋冬季休眠芽
水培产生的嫩枝和早春季刚萌发的嫩枝
34 中　南　林　学　院　学　报 第 23卷
上的叶片和茎段比春末夏初的嫩枝上的叶片和茎段的愈伤组织诱导率要高 ,而且生长也更快 .
2. 4　光对愈伤组织诱导的影响
实验设黑暗、 1 500 lux和 3 000 lux光照 14 h3组 ,将子叶、胚轴、嫩枝叶片和茎段等外植体接种在 W PM
+ BA0. 5+ 2, 4-D1. 0的培养基上 .结果发现 ,在黑暗条件下 ,子叶、胚轴、嫩枝叶片和茎段的愈伤组织诱导率均
达 90%以上 ,没有发现枯死现象 ;愈伤组织生长以胚轴最快 ,茎段最慢 ;胚轴和叶片的颜色为白色 ,茎段的颜色
为浅黄色 ,子叶为淡黄绿色 .光照对愈伤组织的诱导率有一定的影响 .弱的光照条件下 ( 1 500 lux ) ,愈伤组织的
色泽也没有太大的变化 ;强的光照条件下 ( 3 000 lux ) ,愈伤组织的色泽有较大的变化 ,胚轴和叶片的愈伤组织
颜色为浅黄色 ,茎段的为黄色和黄绿色 ,子叶的为绿色或深绿色 ,而且愈伤组织褐变情况加重 .
2. 5　抗氧化剂在愈伤组织继代培养中的作用
表 4　不同抗氧化剂控制褐变效果的比较
Table 4　 Comparisons of the eff ects of various oxidation-resistant
active compounds on inhibit ing browning
抗氧化剂
种　类 体积质量
/ ( mg· L- 1)
愈　　伤　　组　　织
接种时鲜质量
/g
30 d质量
/ g
褐变等级†
抗坏血酸 ( Vc) 1. 0 0. 52 2. 24 3
5. 0 0. 56 2. 87 2
10. 0 0. 55 2. 31 2
聚乙烯吡咯烷酮 ( PV P) 1 000 0. 53 2. 96 2
2 000 0. 57 3. 02 2
5 000 0. 52 2. 58 3
硝酸银 ( Ag NO3) 5. 0 0. 54 3. 33 1
10. 0 0. 58 3. 21 1
15. 0 0. 53 2. 15 2
活性炭 2 000 0. 56 1. 02 4
10 000 0. 57 0. 89 4
对照 - 0. 50 1. 54 3
　† 　 0级:外观鲜艳、淡黄色 ; 1级:暗黄色 ,轻度褐变 ; 2级:黄褐色 ,褐变 ; 3级: 褐
色 ,严重褐变 ; 4级:黑色
　　以大叶榉胚轴为外植体诱导产生的愈
伤组织 ,在不同激素配比的 W PM培养基
中进行继代培养 ,继代周期为一个月 .随着
继代的进行 ,发现愈伤组织开始出现不同
程度的褐变 ,其中以体积质量较大的 2, 4-
D(≥ 4. 0)最为严重 .许多研究认为 ,愈伤
组织的褐变是由于培养物含有丰富的多酚
类化合物在多酚氧化酶的作用下氧化的结
果 [9 ] .在培养基中加入抗氧化剂或活性炭 ,
对防止某些植物的培养物发生褐变具有一
定的效果 .为此 ,将愈伤组织继代在附加不
同种类和体积质量的抗氧化剂或活性炭的
WPM+ BA2. 0+ N AA1. 0培养基上 ,结
果见表 4.由表 4可知 , 2 000 mg· L- 1聚
乙烯吡咯烷酮 ( PV P)和 ( 5, 10) mg· L- 1
硝酸银 ( AgNO3 )具有良好的抑制愈伤组
织褐变的作用 .抗坏血酸 (V c)也具有一定的抑制作用 ,活性炭的效果最差 .
3　讨　论
植物组织培养再生苗木有两条途径:一条途径是 ,外植体通过器官发生途径直接诱导形成不定芽或侧芽 ,
再通过诱导生根而成苗 [ 10] ;另一途径是 ,外植体先脱分化诱导愈伤组织 ,然后由愈伤组织分化形成再生植
株 [11 ] .在大叶榉愈伤组织的诱导中发现 ,外植体的来源、培养基的种类、激素的种类和体积质量、光照等因素都
直接影响着愈伤组织的数量和质量 ,而愈伤组织的数量和质量又直接影响不定芽、不定根的分化和增殖速度 .
在黑暗条件下 ,叶片和茎段在含 2, 4-D( 0. 5, 1. 0)的培养基中 ,形成愈伤组织的同时有根的形成 .而在 BA
( 1. 0, 3. 0)的培养基中 ,随着愈伤组织继代次数的增加 ,愈伤组织往往伴有丛生芽和不定芽的形成 .在 BA与
KT、 ZT、 IBA的组合中也偶有不定芽的形成 .
愈伤组织诱导率与外植体来源和生理状态有关 ,本实验中顶芽的诱导率较低 ,可能与顶芽消毒比较困难和
接种时污染率较高有关 .
木本植物愈伤组织的继代培养中有较严重的褐化现象 [12 ] ,我们在大叶榉的组织培养中也遇到了同样的问
题 ,因此 ,控制褐化对成功培养相当重要 .在培养基中加入抗氧化剂 ,对抑制大叶榉愈伤组织继代培养过程中的
褐化现象有较明显的作用 .在所用的几种抗氧化剂中 ,以 AgNO3最好 .继代过程还发现 ,愈伤组织随继代时间
的延长 ,培养基的激素配比必须作相应的调整 ,这样才能使愈伤组织保持旺盛的生长状态 .一种简便易行的防
止褐化的方法是: 及时转移培养的材料 ,继代培养的周期不要超过 4周 .
35第 1期 金晓玲等: 大叶榉愈伤组织诱导与继代培养的影响因素
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[本文编辑:胡曼辉 ]
(上接第 19页 )
隔离区或不连续区 ,从而使非线性地理变异可能变得更不普遍和明显 .可见趋势面分析是研究种源的地理变异
的有力工具之一 .它能够更清晰地区划种源变异区 ,减少人为因素干扰 ,能为种源区划提供有力的技术支持 .
与多项式趋势面相比 ,傅里叶趋势面具有更高的拟合精度和更好的拟合效果 .多项式趋势面一般仅能反映
出大范围的地理变异趋势 ,而傅里叶趋势面能够表现出样本种源点的细节变化 .当然拟合效果的好坏还取决于
参试种源的数量和分布的均匀代表性 .
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[本文编辑:邱德勇 ]
36 中　南　林　学　院　学　报 第 23卷