全 文 ：·生物技术· 北方园艺 2010(16):148～ 150
175(1):184-191.
[ 9] Thilo C F , Heidrun H , Barbara M , et al.Molecular cloning , substrate
specificith of the functionally expressed dihydroflavonol 4-reductaes f rom
Malus domest ica and Py rus communis cult ivars and the consequences for
flavonoid metabolism [ J] .Archives of Biochemistry and Biophysics , 2003 , 412:
223-230.
Construction of Expressing Vector Containing Chalcone
Synthase Gene from Lilium A`capulco
HE Feng-mei1 ,ZHU Yong-ping2
(1.College of Ho rticulture and Landscape, Yunnan Ag ricultural University , Kunming , Yunnan 650201;2.Colleg e of Agriculture and Biotech-
no logy , Yunnan Agricultural University , Kunming , Yunnan 650201)
Abstract:In this article , CHS1 cDNA ORF was cloned from flower petals of `Acapulco according to the Lilium `Acap-
ulco CHS1 cDNA sequences published by GenBank and inserted pBI121 expression vector , and then transferred into
competent cells of agrohacterium tumefaciens EHA105;The digestion test and colony PCR showed that the specific ex-
pression vector designated as pBI121-CHS1 was constructed successfully.It provides a basis for the research on color
transgene of Li lium Formolongi.
Keywords:lily;CHS;expression vector;pBI121;gene
第一作者简介:刘宝光(1972-),男 ,吉林省吉林人,硕士 ,工程师 ,
现从事林木遗传育种研究工作。E-mail:liubaoguang2005@yahoo.
com.cn。
收稿日期:2010-04-10
长白山野生梅花草组培快繁技术研究
刘 宝光1 , 田春雨2
(1.北华大学林学院 ,吉林吉林 132013;2.吉林市林业局林业总站,吉林吉林 132013)
摘 要:用长白山野生梅花草嫩叶为外植体 ,进行了组织培养研究 ,建立了无性繁殖体系。
结果表明:适于愈伤组织诱导培养基为改良 MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L ,愈伤组织诱导
率达65%;适于不定芽分化的培养基为改良MS+BA 1.0mg/L+KT 1.0mg/ L+NAA 0.3mg/L ,不定
分化效率达 11.2个/g;适于生根诱导的培养基为1/2MS+NAA 0.05 mg/ L+IBA 0.05 mg/L ,生
根达 97.2%;适于练苗的基质组合为 1/2珍珠岩+1/2蛭石 ,苗木成活过90%以上。
关键词:梅花草;组织培养;诱导
中图分类号:S 682.1+9 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2010)16-0148-03
梅花草是虎耳草科多年生草本植物 ,分布于我国东
北、华北 、西北 、日本 、北温带与亚寒带也有分布。长白
山野生梅花草高20 ～ 60 cm ,叶片圆形或心形 ,花单生顶
端 ,白色或黄色 ,花瓣数 5 ,形似梅花 ,花期 7 ～ 8 月[ 1] 。
常生于湿草甸子 、林下潮湿地及水沟旁。梅花草花艳丽
且具有浓郁香味 ,可用于湿地 、水景园或室内观赏 ,在国
外早有园林应用 ,观赏价值较高[ 2] 。全草入药 ,具清热
凉血 ,解毒消肿 ,化痰止咳功效。长白山野生梅花草分
布海拔较高 ,种子细小 ,采摘和调制困难 ,并且种子发芽
率低 ,苗生长缓慢 ,苗期长 ,播种繁殖困难。通过组织培
养可以缩短长白山野生梅花草的育种周期 ,加快优良品
系的驯化 、选育进程 ,提高苗木品质 ,快速满足生产实际
的需要 ,为生产经营部门创造较好的经济效益。
1 材料与方法
1.1 试验材料
外植体来自于从吉林省白河林业局采挖回的梅花
草盆栽植株。
1.2 试验方法
1.2.1 外植体处理 外植体均来自越冬后在室内萌发
出的幼嫩叶片 ,外植体分上 、中、下部 ,剪切规格为0.25 ～
0.64 cm2 ,外植体材料表面消毒:用软毛刷刷洗叶片后 ,
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在流水下冲洗 30 min ,然后在超净工作台上用 75%酒精
消毒 30 s ,用无菌水冲洗1次 ,放入 1%次氯酸钠溶液消
毒10 min ,无菌水冲洗 5次 ,待用。
1.2.2 试验设计 愈伤组织诱导试验:以改良的 MS为
基本培养基 ,对外植体部位和附加激素 BA 、NAA进行
三因素三水平 L9(33)的正交设计(表1),试验中每个处
理接种20瓶 ,每瓶接种1个外植体 ,叶正面向上水平放
置 ,15 d后调查统计诱导率。不定芽诱导试验:采用的
基本培养基为改良 MS 培养基 ,对附加激素 BA 、KT 和
NAA进行三因素三水平的正交设计(表 2),试验中每个
处理接种 10瓶 ,愈伤组织块半陷入培养基中 ,15 d后调
查统计诱导率和苗木质量。生根试验:生根以1/2MS为
基本培养基 ,对NAA 、IBA浓度进行筛选。3次重复 ,随
机区组设计 ,10 d后对生根率 、生根数和根长进行调查
统计 ,移栽:以蛭石 、珍珠岩和 1/2珍珠岩+1/2蛭石为
练苗基质 ,也采用 3次重复随机区组设计 ,25 d后通过
调查苗木成活率对基质进行筛选。上述培养基中均附
加2%蔗糖和 0.56%琼脂 ,pH 值用 NaOH 和 HCl调至
5.8。培养温度为(24±2)℃,光照培养 ,光暗周期为 16
h/8 h ,光强度为46～ 48μmol·m-2 ·s-1 。
表 1 愈伤组织诱导正交设计
水平 因素外植体部位 BA/mg·L-1 NAA/mg·L-1
1 叶片上部 0.5 0.1
2 叶片中部 1.0 0.5
3 叶片下部 2.0 1.0
表 2 不定芽诱导正交设计
水平 因素
BA/ mg·L-1 KT/ mg·L-1 NAA/mg·L-1
1 0.5 0.5 0.1
2 1.0 1.0 0.3
3 2.0 2.0 0.5
2 结果与分析
2.1 不同生长调节物质和外植体部位对愈伤组织诱导
的影响
分别以幼嫩叶片的上 、中 、下部为外植体接种到愈
伤组织诱导培养基上 ,5 d后叶片边缘开始膨大 ,10 d后
在叶片边缘和叶脉处开始出现少量白色或淡黄色的愈
伤组织 ,其质地松软 ,此后愈伤组织生长迅速 ,颜色也逐
渐变为淡黄绿色。外植体的不同部位(F=33.769;S=
0.029)对愈伤组织诱导的影响达到了显著水平 ,BA(F=
0.538;S=0.650)和 NAA(F=1.923;S=0.342)对愈伤
组织诱导的影响不显著。对愈伤组织诱导的影响 ,外植
体部位>NAA>BA(表 3),通过对外植体部位和 BA 、
NAA不同浓度对愈伤组织诱导影响的综合分析可知 ,
利用叶片下部 ,当 BA浓度为 1.0 mg/L 、NAA 浓度为
0.5 mg/L时适宜梅花草的愈伤组织诱导。试验证明其
组合的愈伤组织诱导率可达 65%,高于其它的试验组合
诱导率 ,并且愈伤组织的生长增殖速度也高于其它试验
组合 ,可以确定处理 6适宜于梅花草愈伤组织诱导。
表 3 愈伤组织诱导 L9(33)正交实验及试验结果
处理 因素外植体部位 BA NAA 诱导率/ %
1 3(叶下部) 3(2.0) 1(0.1) 45.0
2 1(叶上部) 2(1.0) 3(1.0) 20.0
3 3(叶下部) 1(0.5) 3(1.0) 60.0
4 1(叶上部) 3(2.0) 2(0.5) 20.0
5 2(叶中部) 3(2.0) 3(1.0) 30.0
6 3(叶下部) 2(1.0) 2(0.5) 65.0
7 2(叶中部) 2(1.0) 1(0.1) 25.0
8 2(叶中部) 1(0.5) 2(0.5) 25.0
9 1(叶上部) 1(0.5) 1(0.1) 15.0
y 1 55.0 80.0 50.0
y 2 80.0 110.0 110.0
y 3 115.0 60.0 90.0
极差(R) 60.0 50.0 60.0
表 4 不定芽诱导 L9(33)正交实验及试验结果
处理 因素
BA KT NAA
诱导量/个·g-1
1 3(2.0) 3(2.0) 1(0.1) 2.2
2 1(0.5) 2(1.0) 3(0.5) 6.4
3 3(2.0) 1(0.5) 3(0.5) 3.5
4 1(0.5) 3(2.0) 2(0.3) 7.5
5 2(1.0) 3(2.0) 3(0.5) 6.9
6 3(2.0) 2(1.0) 2(0.3) 5.3
7 2(1.0) 2(1.0) 1(0.1) 6.5
8 2(1.0) 1(0.5) 2(0.3) 7.5
9 1(0.5) 1(0.5) 1(0.1) 5.7
y 1 19.6 16.7 14.4
y 2 20.9 18.2 20.3
y 3 11.0 16.6 16.8
极差(R) 9.9 1.6 5.9
2.2 不同生长调节物质对不定芽分化诱导的影响
愈伤组织接种到芽分化诱导培养基上 ,7 d开始出
现肉眼可辨的绿色芽点 , 10 d芽点开始分化为幼芽 ,并
不断长大。生长调节物质 BA(F=32.399;S=0.030)对
不定芽诱导的影响达到了显著水平 ,KT(F=0.899;S=
0.527)和 NAA(F=9.854;S=0.092)对不定芽诱导的影
响不显著 ,生长调节物质对不定芽分化诱导影响的强弱
表现为:BA >NAA >KT(表 4)。通过对 BA 、KT 和
NAA不同浓度对不定芽诱导影响的综合分析可知 ,BA
浓为度 1.0 mg/ L、KT 浓度为 1.0 mg/L 、NAA浓度为
0.3 mg/L 时适宜梅花草的不定芽分化诱导。试验证明
其组合的不定芽诱导可达 11.2个/g ,高于其它的正交
实验组合 ,并且幼苗的生长速度也高于其它实验组合 ,
20 d可长到 2 ～ 3 cm。
2.3 不同培养基生根效果比较
将生长健壮的 1.5 ～ 2.5 cm 小苗转接到生根培养
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基上 ,10 d开始统计生根状况。由表 5可知 ,培养基对
生根率(F=23.295;S =0.000)和生根条数(F=5.597;
S=0.003)的影响均达到了显著水平 , 对根长(F =
1.637;S=0.205)的影响不显著 ,通过 LSD多重比较可
知A3培养基益于提高苗木的生根率和提高生根条数 ,
其诱导的生根率可达97.2%,生根条数可达8.3条。虽
然A3培养基在根长生长方面不具有优势 ,但NAA浓度
高于 0.1 mg/L 时常在根干结合的部位有愈伤组织生
成 ,不利于苗木成活 ,因此综合看A3培养基适合根长的
生长 ,根长达0.83 cm(表5)。结果表明 ,NAA有益于提
高生根率和生根条数 ,IBA有益于根长的生长。
表 5 不同激素组合对生根效果的影响
编号 培养基/mg·L-1
生根率
/ %
生根条
数/条
根长
/ cm
A1 1/2MS+NAA 0.05 87.4±2.2 b 6.5±1.3 abc 0.45±0.20
A2 1/2MS+IBA 0.05 68.4±5.3 d 3.4±2.1 bc 0.56±0.13
A3 1/2MS+NAA 0.05+IBA 0.05 97.2±1.4 a 8.3±0.9 a 0.83±0.15
A4 1/ 2MS+NAA 0.1 85.1±3.1 b 5.1±1.1 abc 0.57±0.14
A5 1/2MS+IBA 0.1 76.9±4.5 c 4.2±1.9 bc 0.81±0.23
A6 1/ 2MS+NAA 0.1+IBA 0.05 90.4±3.6 b 5.7±0.6 abc 0.85±0.25
A7 1/ 2MS+NAA 0.05+IBA 0.1 89.3±2.7 b 6.8±0.5 ab 0.83±0.21
A8 1/2MS+NAA 0.1+IBA 0.1 87.5±3.0 b 3.1±2.1 c 0.87±0.31
注:小写字母代表 P<0.05的差异显著性。
2.4 不同基质对移栽效果的影响
将温室消毒后 ,第 1天将生根苗封口膜揭开一半 ,
第2天全部揭开 ,并适时用喷雾器喷淋叶面 ,间隔时间
逐渐加长 ,练苗3 d后 ,取出并洗净根部的培养基。分别
移植到盛有蛭石 、珍珠岩和 1/2珍珠岩+1/2蛭石基质
的育苗盘中 ,基质用 0.5‰的 K2MnO 4 溶液淋透后再用
清水冲淋3遍 ,喷1/4MS营养液。将育苗盘移入在温室
内搭建的小拱棚内 ,小拱棚距育苗盘10～ 15 cm高 ,保持
湿度 80%,适当遮荫 ,5 d后逐步撤去拱棚膜 , 8 d后取
出 ,15 d移入培养土中 ,常规管理。基质对苗木成活率
(F=19.176;S=0.009)影响达到了显著水下 ,通过 LSD
多重比较可知 B3基质组合效果较好 ,其练苗成活率达
90%以上(表 6)。
表 6 不同基质对练苗成活的影响
编号 基质 成活率/ %
B1 蛭石 68.6±3.2 b
B2 珍珠岩 75.2±4.5 b
B3 1/2珍珠岩+1/2蛭石 90.5±3.1 a
3 小结
长白山野生梅花草组织培养过程中用于愈伤组织
诱导的叶部位是下部 ,适宜愈伤组织诱导的培养基为:
改良 MS+BA 1.0 mg/ L+NAA 0.5 mg/L;适于不定芽
分化的培养基为 ,改良 MS +BA 1.0 mg/ L+KT 1.0
mg/L+NAA 0.3 mg/L。适于生根诱导的培养基为:
1/2MS+NAA 0.05 mg/L+IBA 0.05 mg/L。适于练苗
的基质组合为:1/2珍珠岩+1/2蛭石。
参考文献
[ 1] 高文由,富国栋.长白山西南坡野生经济植物志[M] .吉林:吉林省林
业斟察设计院印刷 ,1984:244-245.
[ 2] 贾瑞冬,郝喜龙 ,牛林龙 ,等.梅花草的组织培养和快速繁殖[ J] .植物
生理学通迅, 2005 , 41(6):798.
Study on Tissue Culture and Rapid Propagation of Changbai
Mountain Wild Parnassia palustris L.
LIU Bao-guang1 , T IAN Chun-yu2
(1.Cutting-and-culturing Forest Innovation Center of Jilin Province , Forest College of Beihua University , Jilin , Jilin 132013;2.Forestry Central
Station of Jilin City Forestry Bureau , Jilin , Jilin 132013)
Abstract:Using tender leaf of changbai mountain wild Parnassia palustris L.as explants the tissue culture was studied.
The vegetative propagation system was successful established.The improved MS medium supplemented with BA 1.0
mg/ L , NAA 0.5 mg/L w as suitable for callus induction and the rate w as 65%.The improved MS medium supplemen-
ted with BA 1.0 mg/ L , KT 1.0 mg/L and NAA 0.3 mg/ L was suitable for adventitious bud differentiation induction
and the rate w as 11.2/g.The 1/2MS medium supplemented with NAA 0.05 mg/L , IBA 0.05 mg/L was suitable for
root induction and the rate was 97.2%.The substrate of half perlite with half vermiculite was suitable for practice shoots
and the rate w as 90%.
Keywords:Parnassia palustris L.;tissue culture;induction
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