全 文 ：4 讨论
千百年来，人们日出而作，日落而息，形成了鲜明的昼夜节
律。正常节律一旦与外环境授时因子失去同步，其峰值、相位、振
幅等均会出现紊乱，影响人的生理和心理活动［5］。体温变化与活
动 －休息的关系密切，正常的体温节律是保证睡眠 －觉醒节律运
行的必要生理措施。时间生物学中常把体温节律作为人体的主
要标志性节律，并把体温与睡眠节律的关系作为判断人体节律是
否同步的主要依据［6］。
神阙为任脉腧穴，能调补脾胃，益气养血，强身固肾。该穴有
着对药物透皮吸收快，且易于定位、操作，不影响机体活动的优
势［7］。大蒜具有解毒、健胃和杀虫的作用，在现代药理研究中发
现大蒜具有抗菌消炎，抗癌、降低血糖、血压、血脂、抗血小板聚集
和预防动脉粥样硬化、减肥、延缓衰老、抗氧化及提高机体免疫力
等作用［8］。基于传统的穴位贴敷方法的优势和大蒜的现代药理
作用，我们在本实验中将大蒜制成药膏来整复昼夜节律。松果体
通过分泌褪黑素对体温节律的调节起了重要的作用［9］，但是外源
性褪黑素不能使体温或活动度的昼夜节律消失，而只是改变昼夜
节律的参数［10］。哺乳动物(绝大多数是恒温动物)的体温在适应
自然的过程中表现出一定的波动性，如人的体温一般在黎明前最
低，这与本实验的结果相似。通过睡眠剥夺，B 组和 C 组虽然还
都有近似节律性，但是 B组的峰值、峰相位和振幅较 A 组和 C 组
均有比较大的漂移，均数最高值出现在子时，其振幅更降低了
接近 2 倍，有节律紊乱的趋势，而 C组的各项指标则与 A 组非常
接近，节律比较明显。结果表明大蒜膏有防止睡眠剥夺所致昼夜
节律紊乱的趋势，可以在一定程度上整复昼夜节律。
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收稿日期:2009-11-13; 修订日期:2010-05-16
基金项目:天然产物研究与利用湖北省重点实验室(三峡大学)开放基金
(No． 2008NP06)
作者简介:张亚雄(1955-) ，女(汉族) ，湖北宜昌人，现任三峡大学化学与
生命科学学院教授，主要从事微生物菌种筛选与生物制药研究工作．
蛇菰内生菌的抑菌作用及活性有效成分分析
张亚雄，涂 璇，胡 滨，邓义熹，喻 晨
(湖北省天然产物研究与利用重点实验室，三峡大学化学与生命科学学院，湖北 宜昌 443002)
摘要:目的 研究蛇菰内生菌的活性有效成分抑菌作用。方法 通过对分离纯化的 49 株筒鞘蛇菰内生真菌进行纯化液体
发酵，发酵液经乙酸乙酯和正丁醇萃取，并对乙酸乙酯相、正丁醇相和水相分别采用牛津杯法研究蛇菰内生菌发酵液对
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌的抑菌作用。结果 有 18 株蛇菰内生菌发酵液对细菌有抑菌作用。
抑菌活性物在乙酸乙酯相中。通过薄层色谱和化学反应得出乙酸乙酯相中物质有黄酮类和甾体类。结论 分离得到的
18 株蛇菰内生菌发酵液乙酸乙酯萃取相的黄酮类和甾体类有抑菌作用。
关键词:筒鞘蛇菰; 内生菌; 抑菌作用
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2010． 10． 039
中图分类号:R284． 1 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2010)10-2509-02
筒鞘蛇菰 Balanophora involucrata Hook． f． 又名鹿仙草，为蛇
菰科蛇菰属草本寄生植物，是我国传统道地中药材，具有凉血止
血、清热解毒的功能，主治肺热咳嗽、吐血、肠风下血、风热癍疹、
腰痛、疔疮肿毒等，民间也用于治疗肝炎、肿瘤等疾病，为传统民
族用药，我国有丰富的资源。分离的蛇菰内生菌并对其代谢产
物进行研究，以期从微生物角度寻找其活性化合物，为研制新药
开辟新的思路。本课题以分布于神农架地区的思茅蛇菰为研究
对象进行其内生真菌的活性成分分离纯化筛选，并对蛇菰内生菌
的代谢产物进行抑菌研究，以期寻找有效活性化合物。
1 材料
1． 1 供试植物及菌株 筒鞘蛇菰 Balanophora involucrata Hook．
f．，采自湖北省神农架。
1． 2 抑菌指示菌株 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大
肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、绿脓杆
菌(Pseudomonas aeruginosa)。
2 方法
从蛇菰中分离出 49 株内生真菌经纯化扩大后，经发酵培养，
得到发酵液。取发酵浓缩液对枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、
绿脓杆菌、大肠杆菌进行抑菌测试。筛选出最佳抑制细菌的内生
真菌，对相应菌株扩大摇瓶培养，用醋酸乙酯和正丁醇对此菌株
发酵液进行萃取，分别用醋酸乙酯相、正丁醇相和水相浸膏对以
上 4 种细菌进行抑菌测试，筛选出有效抑菌活性物质存在于何相
中，并对有效抑菌活性物质作简要分析。
2． 1 发酵培养基 PDA 培养基:土豆 200 g，蔗糖 20 g，水 1 000
ml，pH自然。
2． 2 发酵浓缩液的制备 将菌种接于摇瓶后于 28℃，100 ～ 110 r /
min的摇床中培养 5 ～ 9 d，待发酵液清澈并有大量菌落生长后取
出。加入 1 ～2 ml 甲醇，用电动搅拌器在适当转速下对发酵液进
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2010 VOL ． 21 NO． 10 时珍国医国药 2010 年第 21 卷第 10 期
行搅拌破碎。用 32层纱布过滤，于 45℃下浓缩至 50 ml左右。然
后在 5 000 r /min离心机中离心 20 min，取上清液，冰箱保存备用。
2． 3 发酵浓缩液的抑菌实验 采用牛津杯法。用混菌法或涂布
法在每平皿加 0． 1 ml菌悬液，室温，吸附 1 h，然后在上面均匀放
置 4 个直径为 6 mm 的无菌不锈钢牛津杯。其内加离心发酵浓
缩液 200 μl;于 37℃恒温培养 12 h后，观察并记录抑菌圈的有无
及其直径大小(每平皿 4 个牛津杯对称 2 种浓缩液，求直径的平
均值)。筛选出最佳抑菌内生菌株。
2． 4 发酵液经乙酸乙酯、正丁醇后的抑菌实验 对最佳抑菌内生
菌株扩大培养，其发酵液用乙酸乙酯、正丁醇萃取浓缩后，将乙酸
乙酯相、正丁醇相、水相浸膏于真空干燥葙干燥，然后配成浓度为
10 －2，10 －3，10 －4 g /ml和 10 －5 g /ml 样液。依据牛津杯法进行抑
菌试验，两个抑菌圈直径的平均值即为最小抑菌浓度(MIC)。
2． 5 抑菌活性化合物薄层色谱分离 将溶于三氯甲烷中的样品
在硅胶薄板上点板后于层析缸内垂直展开，展开剂为氯仿和甲醇
的配比液。然后用 5%的磷钼酸溶液进行显色。
2． 6 化学鉴定反应
2． 6． 1 盐酸 －镁粉反应［1］ 鉴定黄酮类。将样品溶于 1． 0 ml甲
醇或乙醇中，加入少量镁粉振摇，滴加几滴浓盐酸，1 ～ 2 min 内
(必要时微热)即可显色。多数黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及其醇类
化合物显橙红至紫红色。
2． 6． 2 salkowski 反应［2］ 鉴定甾体皂苷类。将样品溶于三氯甲
烷中，加入适量浓硫酸，分层后，上层三氯甲烷显血红色或青色。
下层浓硫酸显绿色荧光。
3 结果
3． 1 筒鞘蛇菰内生菌发酵浓缩液对细菌的体外抑菌作用 以牛
津杯法对 4 种细菌做抑菌实验。实验结果见表 1，共有 20 种发酵
液对细菌有抑菌作用。其中 SG003 在发酵过程中颜色发生变
红，根据颜色由红至淡黄色变化分别命名为 SG003A，SG003B，
SG003C，SG003D。
表 1 筒鞘蛇菰内生菌发酵浓缩液对细菌的抑菌效果
菌种编号
抑菌效果
枯草芽胞杆菌 金黄色葡萄球菌* 绿脓杆菌 大肠杆菌
SG003A － + + + － + + +
SG003B － + + + + + + + +
SG003C － + + + + + + +
SG011 + + + + － + +
SG016 + + － － + + +
SG018 + + + + + +
SG019 + + － － －
SG022 + + + － +
SG023 + + + + + － + +
SG024 － － + －
SG025 + + － + + + + +
SG030 － － + +
SG033 + + － － －
SG037 + + + + + + + + + + +
SG038 + + + + + － + +
SG039 + + － + +
SG040 + + － － +
SG045 + + － － +
SG047 + + + + + + + + + + + +
SG049 + + + + － + + +
“ －”代表无抑菌圈;“ +”代表抑菌圈为 1． 000 ～ 1． 500 cm范围内;“ + +”代
表抑菌圈为 1． 500 ～ 2． 000 cm 范围内;“ + + +”代表抑菌圈为 2． 000 ～ 2． 500 cm
范围内;“* ”指在 12 h后生长不明显，其抑菌效果为 24 h所做记录
3． 2 筒鞘蛇菰内生菌发酵浓缩液萃取物对 4 种细菌的抑菌作用
由表 1 看出 SG047 抑菌作用最佳，其扩大培养的发酵液用乙酸乙
酯、正丁醇萃取浓缩后，将乙酸乙酯相、正丁醇相、水相浸膏，定量
测量对细菌的最小抑菌浓度(MIC)。得到乙酸乙酯相对 4 种细
菌有明显抑菌作用，而正丁醇相、水相无抑菌现象。乙酸乙酯相
抑菌结果见表 2。
表 2 显示，乙酸乙酯相浸膏对大肠杆菌的 MIC 为 10 －5 g /ml，
对绿脓杆菌、枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌的 MIC均为 10 －4 g /
ml。
3． 3 筒鞘蛇菰内生菌 SG047 萃取后乙酸乙酯萃取相浸膏抑菌实
验照片 将乙酸乙酯萃取相浸膏稀释成 10 －2，10 －3，10 －4，10 －5(g /
ml) ，空白组采用等体积纯乙酸乙酯。图 1 为筒鞘蛇菰 SG047 乙
酸乙酯萃取相浸膏对细菌抑菌实验照片，其中左图为对大肠杆菌
的抑菌作用，右图为枯草芽孢杆菌的抑菌作用。
表 2 筒鞘蛇菰内生菌 SG047 萃取后其乙酸乙酯
相抑菌试验及最小抑菌浓度(MIC)
稀释
倍数
抑菌圈平均直径 /mm
大肠杆菌
(12 h)G －
绿脓杆菌
(12 h)G －
枯草芽胞杆菌
(12 h)G +
金黄色葡萄球菌
(48 h)G +
10 － 2 24． 46 27． 39 25． 35 33． 42
10 － 3 19． 21 21． 65 20． 12 26． 60
10 － 4 12． 46 12． 42 11． 96 14． 81
10 － 5 12． 04 － － －
空白 － － － －
图 1 筒鞘蛇菰内生菌 SG047 乙酸乙酯萃取浸
膏对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌作用
3． 4 薄层色谱 对乙酸乙酯相进行薄层色谱检测，展开剂三氯甲
烷∶ 甲醇按照 90:13 进行展开时。效果最佳。硅胶薄板上有 4
个点，即至少有 4 中成分。依次从下到上，通过测量得出 4 个点
的 Rf值非别为:0． 167，0． 433，0． 617，0． 783。
3． 5 化学鉴定反应 图 2 为盐酸 －镁粉反应和 salkowski 反应。
通过观察颜色可以推出乙酸乙酯相中含有黄酮、黄酮醇、二羟黄
酮及其醇类化合物和甾体皂苷类物质。
图 2 筒鞘蛇菰内生菌 SG047 萃取后其
乙酸乙酯萃取相浸膏化学鉴定反应
4 结果
对 49 种内生菌发酵产物的抑菌实验可以得出，18 株内生真
菌发酵产物对细菌有一定的抑菌作用。其中 SG047 对 4 种细菌
均有较强的抑菌效果。SG047 扩大培养的发酵液经萃取后的抑
菌试验可以看到，其有效抑菌活性物质在醋酸乙酯相中。其中醋
酸乙酯相浸膏对大肠杆菌的 MIC为 10 －5 g /ml，对绿脓杆菌、枯草
芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌的 MIC均为 104 g /ml。通过盐酸 －镁
粉反应和 salkowski 反应。得出蛇菰内生菌 SG047 菌株发酵液的
醋酸乙酯相中含有黄酮、黄酮醇或二羟黄酮及其醇类化合物和甾
体皂苷类物质。
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时珍国医国药 2010 年第 21 卷第 10 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2010 VOL． 21 NO． 10