全 文 ：中国免咬学 杂志 ], 卿年第 6 卷第 6期
.
3 6 :毛 .
· 论著 · 肿瘤免疫学 ·
含有蓖麻毒素和阿霉素的双弹头免疫毒素的
构建及其杀伤活性
谢蜀生 赵 补 白爱林 龙振洲 (北京医科大学免疫学教研室 , 北京 10 0 0 8 3)
〔摘 要 〕 本文用化学偶联方法 , 将蓖麻毒素 ( R i c in ) 及阿霉素 ( A d r ia m y ic n , A d r ) 同时 偶
联到抗人膀肤癌单克隆抗体分子上 , 构建了第一个具有 “ 双单头 ” 的抗肿瘤导向药物 。 经间接免疫荧 光检
测 以及放射竞争结合试验证明 , 这个免疫毒素保持了原抗体活性的即 % 。 休 外杀伤试验的结果表明 , 这个
双单头免疫 毒素在 0 . I M 半乳糖存在的条件下 , 对膀肤癌细胞 B lu 一 87 的体外杀伤作用比单抗 一 阿 霉素强
3() O0 0倍 ; 比单抗 一 筐麻毒素强 10倍 。 对无关的人直肠癌 oL V o细胞无明显的杀伤作用 。
〔关键词 〕 免疫毒素 ; 阿霉素 ; 蓖麻毒素
用抗肿瘤单克隆抗体载体 , 将毒素或抗肿瘤药
物导向肿瘤靶细胞进行定向杀伤 , 是肿瘤治疗的新
方法 。 oF d s t a d 等发现 , 蓖麻毒素 ( R i e i n ) 与阿
霉素 ( ^ d r i a m y e i n , 下称 ^ d r ) 对小鼠白血病细
胞有 20 0() 倍的协同杀伤作用 〔 1 〕。 我们曾分别用柔
红霉索 ( D a u n o , 1: v e i n ) , 阿霉素 . 苯
丁酸氮芥 . 以及蓖麻毒素〔 2 · 3〕 与 单克 隆抗体
交联 , 构建了多种具有高度靶细 胞特异杀伤活性的
免疫毒素。 在这些研究的基础上 , 我们又成功地将
R i ic n 和 A d r 交联到同一个抗人膀肢癌单抗分子上 ,
构建了第一个具有 “ 双弹头” 的抗肿瘤免疫毒素 。
体外杀伤活性检测证明 , 这个免疫毒素对膀肤癌细
胞具有特异的强杀伤活性 。
材料与方法
一 、 细胞株
人膀肤癌细胞株 B l u 一 87 系北京医科大学泌尿
外科研究所免疫室建株 曰 〕。 人直肠癌 oL v o 细胞
株系加拿大 A l b e r t a 大学免疫学系 D i e n e : 教授赠
送 , 本室 液氮保存 。
二 、 单克隆抗体
BD I 一 1 系本室建立的 , 能稳定分泌抗人膀肤
癌单抗的杂交瘤细胞株 , 与人直肠癌助 v 。 细胞无
交叉反应 〔 5 〕。 1 一 5 x 10 “ 个BD I 一 1杂交瘤细
胞注射BA L B / c小鼠腹腔 , 制备腹水 , 经 40 %饱和
硫酸钱沉淀 , 以及介o t e i n ^ 一 eS p h o r o s e 4 B亲合层
析后 , 获得纯化的抗人膀肤癌单抗 ( 地G : ) , 浓缩
为 2 . S m g / m l 。
三 、 蓖麻毒素的制备与纯化
见文献 〔 6 〕 。
四 、 双弹头免疫 毒素的制备
(一 ) R i ic n 与异型双功能交联 剂 S P D R 美国
is g m a 公司产品 ) 按 l : 10 的克分子 比在室温下反
应 30分钟后 , 生成 R i e i n 一 P D P , 装 透析袋 , 对 p H
7
·
2 0
.
1 5 M P BS 透析过夜。
(二 ) 5 m g A d r 溶于双蒸水中 , 与等量顺鸟
头酸酥 ( C i s 一 ^ ) 反应生 成 A d r 一 C i s ^ , 立 且[l 与
R i e i n 一 P D P 混 合 , 并加 入 5 m g E D C I干粉 .
室温反应 17 小时后 , 用 eS p h a d e x G 25 凝胶过滤 ,
收集第一峰即为 A d 「一 C i s ^ 一 R i e i n 一 P D P 。
(三 ) 纯化的抗 人膀肤癌单抗与 s P D P按 1 :
10 的克分子比在室温 下反应 3 0分钟后 , 装透析袋 ,
对 p H 4 . 6 O . Z M 的酷酸盐缓冲液透析过夜 。 然后加
入 D T T ( S i g m a 公司 ) , 使终浓度达到 5 ( )m M , 室
温反应 3 ()分钟后 , 过 eS p h a d e x G 2 5牛主,去除 D T T .
收集蛋白峰 , 即为 A b 一 S H , 并立即与 A d r 一 C IS A
一 R i ic n 一 P D刊昆合 , 室温下反应 17 小时后 , 经 se .
p h a d e x G 15o柱 ( 2 . 5 x 75 e m ) 凝 胶过滤 . 按每
管 1 . 5 m l 收集 , 分别用紫外分光光度计测蛋白含
量 , 收集第一峰 , 即为 A b 一 R i ic n 一 A d r 双弹头免
疫毒素。 在上述制备过程中 , 在 R i ic n 中加入 , , , I -
R i e i n (用氯胺 T法制备 ) 2 5 () :门 , 相当于 5 x 10 ’
c pm
, 即可获得 , , ,琳记的双弹头免疫毒素 。
五 、 间接免疫荧光法
按文献 〔 7 〕方法 。
六 、 放射竞争结合试验
抗膀肤癌单抗与 , 2 , I (北京原子能所产品 )按敏
胺 T法制备竞争结合试验方法见文献 〔 8 〕 ,
七 、 免疫毒素的休外杀伤试验
按文献 f g 〕方法 。
杀伤率 二 实脸孔
c p m
对照 孔 c p m 1 0 0 %
免疫毒素与 BUI 一 。 7及助 v 。细胞反应 , 然后再用
F r c
一单抗小鼠珑G ( 51 g m a 公司 ) 作间接 免 疫
荧光测定 , 结果表明 , 免疫毒素与膀肤癌细胞的荧
光效价为 5 x l o , “ M , 与相同浓度的抗体相比无
明显差别 。 在这个浓度下 , 免疫毒素和抗体与直肠
癌助V O细胞均无荧光染色。 见表 1 。
用 , 2 , I一 A b与不同浓度的免疫毒素或未标记的
A b混合 , 在 0 . I M半孔糖存在的条件下 , 加入 1 . 5
x l o , 个 BUI 一 87细胞中 (终体积为 10 0 “ l ) , 分
别测定免疫毒素及未标记 A b与标记抗体与靶细胞的
竞争能力 , 结果表明 , 抑制 , 2 5 1一 A b与靶细胞结合
T a b
.
1
.
I n d i r e e t i m m u n o f l u o r e s e e n e e a s s a y o f t h e
b i n d i n R ac t i
v i t y o f B D I
-一 R i e i n 一 A d r i a m y 一
值-
结 果
一 、 双弹头免疫毒素的化学组成
双弹头免疫毒素 ^ b 一 R i e i n 一 ^ d滋 se p h a d -
e x G 15 0 凝 胶层析后获得二个蛋白峰 , 见图 1 。 其
中第一峰中 30 一 3 9管 (相当于 45 一 59 m l 洗脱液 )
中收集的免疫毒素 , 分别测定其O认。 。 的吸收值及
放射活性 , 按 T h 。巾 e 的方法 〔10 〕钊算 出 A b和 iR -
ic n 的含量 , 并计算出 A :b R i ic n 的克分子比为 1 :
1
。 在O D’ , ` 测得双弹头免疫毒素的光吸收值 , 在
标准曲线上查得其中 A d r 含量 , 经测算得每个免疫
毒素分子上交联有 2 . 5 个 A d汾子 。 这样这个双弹
头免疫 毒素中 A b : R i e i n : A d r 为 l : 1 : 2 . 5 。
c 1n t o B I U
_ s ,
d i】u t i o n
aS m
p l e 10 1
:
10 0 1
:
10 0 0 1
:
10 0 0 0
B D L 一 ( M e A b )
B D I
-一 R i e i n 一
A d r ( I T )
珊 扭 升
栅 附 拼 朴
ǎ,01x.巴。)下考自,吕一勺,加.f相县l.jl’we刀we移
口
、 厂飞
八一。人。介.舀,.:0nl气:O阅)-0吧.石V
件. e 。裁 u o J 《 . 、 ) . 的 ’ 。 o
F i 9 1
.
P u r i f i e a t i o n o f B D I
_一 R i e i n 一 A d r i a m y e i n
o n S e p h a d e x G 1 50
.
T h e e l u a t e w a s m o n i t o r e d
s 伴 e h r o p h o t o m e t r i e a l l y a t 2 8 0 nr ( . 一 . )
a n d b y r a d i o a e t i v i t y ( O … O ) d e r i v e d
f r o m t h e . 2 , I一 R I C i n .
二 、 双弹头免疫毒素的靶细胞结合特性
在 0 . I M半乳糖存在的条件下 , 用不同浓度的
T h e o r i g i an l
e o n e e n t r a t l o sn o f B D I 一 1 a n d B D I一
一 R i e i n 一 dA
r a r e 1 m g / m l e o n t o i n i n g o
.
l M g a l ` , 。 t o s e
50 %所斋的 B D L , 单抗的浓度为 2 n M , 所需 B D IL
一 iR ic n 一 A dr 双弹头免疫 毒素的浓度为 2 . sn M ,说
明 B D L : 与 R i ic n和 A d r偶联后 , 其靶细胞结合活性
有较好的保存 , 其差别用间接荧光法不能检出 ,用放
射竞争结合试验检测 , 活性保留为原抗体的 70 %左
右 。 见图 5 。
三 、 双弹头免疫毒素对靶细胞的强杀伤作用
在本文的研究中 , 我们分别制备了 B D L : -
R ic in 和 BD L I 一 A d r 单弹头免疫毒素 , 并将它们
与双弹头免疫毒素 B D L一 iR ic n 一 A d时 靶 细 胞
的杀伤作用进行 了比较 。 结果表明 , 在 O . I M半乳
糖存在的条件下 , 双弹头导向药物对人膀耽癌细 胞
B IU
一 , , 的杀伤能力比 B D L I 一 R i ic n强 10倍 , 接近
R ic in 对靶细胞的杀伤 , 而比 BD L一 A d r的杀 伤
作用强近 30 00 0 倍 。 对人直肠癌细胞 oL V o则无 明
显的杀伤作用 。 见图 2 、 3 、 4 。
B /T
1 0 0
卜 8 !已困 .0留号ó万叫1 0目11二` 0次
.。。1 .ù .工ó二
(丈 )二总砧,ó,弓0幼. =幻i抽
减
。工.--0ō
O
n j
, H
一
l q盯世。 e o几坛〕 . “ 0 . ( 议 o ` C o . 有协 1 ) 卜 一 _ ` _ _
F i 9 2
.
C y t o t o x i e e f f e e t o f B D I
-一 R i e i n 一 A d r i a m y e i n
( x 一 冰 ) , B D I _ , 一 R i e i n ( . 一 . ) a n d R i e i n ( O
一 O ) o n B I U _。 , b l a d d e r e a n e e r e e l l s .
2 10 50 25 0 12 50
C o m ep
t i t o r C o cn
e n t , t i o n ( n m )
F i 9 5
.
A n t i ob d y
a e t i v i t y o f B D I
一 : 一 R i e i n 一 Ad r i a m
-
y e i n i m m u on t
o x i n B i n d i n g a e t i v i t y o f I T
( O… O ) a s s e s s e d 1n a e o m pe t i v e b i dn i n g
a s s a y w a s e o m p a r e d t o M e A b ( . 一 . ) .
讨 论
目前为止 , 用抗肿雌{单克隆抗体作 载体进行的导
向药物的研究中 , 都是将抗体与毒素 , 或抗肿瘤药
物进行化学交联 , 制备成所谓的 “ 单弹头” 导 向药
物 。 不同的药物之间作用的协同现象早已被人们所
认识 。 oF d st a d 等发现 蓖麻毒素与阿 霉 素对肿
瘤细胞有强杀伤协同作用 , 在此 启发下 , 我们成功
地将蓖麻毒素当阿霉素与同一个抗人膀肤癌单抗分
子交联 , 构建了第一个具有二个协同杀伤分子的免
疫毒素 。 在蓖麻毒素分子中 , 先引入一个二硫毗吮
基团 , 形成 R ic in 一 PD P, 然后再与阿霉素交联 成
“ 双弹头 A d r 一 R i e i n 一 PD P ; 这个分子中的二
硫毗吮基可以很容易地与 A b 一 S H结合形成 A b -
R i ic n 一 A d叔弹头免疫毒素 。在本文的研究中 A d r
先通过顺 鸟头酸与 R i ic n交联 , 可使 A d r在内化到
靶细胞里后 , 更易于从免疫毒素分子 上解离出来 ,
提高其杀伤作用 l[ 月 。
活性检测表明 , 这个双弹头免疫毒素保留了大
部份抗体活性 。 结构研究表明这个免疫毒素中 , A b
: R i e i n : A d r 为 1 : 1 : 2 5 。 由于 R i e i n 分子中
赖氨酸含量较少 (其 ￡ 一 氨纂是偶联活性基团 ) ,
所以交联的 A d r 分子只有 2 . 5 个 / iR ic n , 但已表
现了明显的协同作用。 有报告 , 为提高 A d r与抗体
的交联 比例 , 在抗体与A d r 之间引入一个中性大分
ǎ一。.ogj次)uo,-巴R亡uol
目勺卜·吕t
0 10
一 , , 10 ` 之 10 一曰 1 0 -二 10
R k i . C o n c o n l. t i o . (M )
F i 9 3
.
C g t o t o x i e e f f e e * o f B D I
一 : 一 R i e i n 一 A d r i a m y e i n
o n B I U
~ . , b! a d d e r C a n e e r ce l 15 ( x 一 x ) a n d
L o v o e o l o n e a n e e r c e l l s (八一△ )
` - - ~ -一刊卜- ~ ,
\\ \0S
.
l
.t
se.
es
产1.,匀吕飞谬)`uo目.民`o:ō曰P卜
火 0 [0 二 1 0 1 冲 1 0 二 砚O · 。 1 0 . 1 0 , 10 , 1 0
M o A b C o甩. n t . 一。一 吃M )
F l 9 4
.
C g t o t o x i e e f f e e t o f B D I
_一 R i e i n 一 A d r i a m y e i n
( 火 一 又 ) a n d B D I- 一 A d r i a m y e i n (▲一 盛 .o n
B I U
_ 。 : b】a d d e r C a n e e r ce l l s
中国免疫学杂志 9 1洲年第 6卷第 6期
子 .如人血消白蛋白 s ( HA ) 或右旋糖配等 〔 `“ 〕
这样可使抗体 一 阿霉毒素的偶联比例提高 5 一 0 1倍 ,
杀伤靶细胞的能力提高 10 0 倍 。 本文的研究实际上
是在抗体与 A d r 之间引入一个杀伤分子 R IC i n , 虽
然 A d r 的交联比例没有增加 , 但杀伤靶细胞的能力
却增强了 30 00 0 倍。 由于蓖麻毒素是通过阻断蛋 白
质合成杀伤靶细胞的 , 而阿霉素则破坏 D N A 的模
板功能 , 阻断 D N A合成来杀伤靶细胞 , 通过这二种
途径作用于靶细胞可能是双弹头免疫毒素杀伤能力
增强的机制之一 。 显然 , 这种由全分子 R ic in 与抗
肿瘤药物构建的双弹头免疫毒素在体外净化骨做方
面有更好的优越性 。 另有报道阿霉素具有破坏细胞
膜结构的作用曰 3 〕 。 因此它与R i ic n A链组成的双
弹头免疫毒素 , 有可能起到帮助 A 链进入胞浆的作
用 , 从而提高 A链免疫毒素的杀伤能力 。 此外 , 一
个抗体分子交联二种不同的抗肿瘤药物也可以部份
地克服肿瘤细 胞对某种药物的耐药性 。
总之 , 本 文 研 究 的 意义在于第 一 次提 出
了在一个抗体分子上偶联二种杀伤分子的设想 , 并
用含有阿霉素和蓖麻毒素的双弹头免疫毒素成功地
证明了这种免疫毒素确有强的杀伤作用。 类似本文
的研究国内外尚未见报告 。 我们认为 , 本文的研究
有可能导致产生一类新的免疫毒素出现 。
参考文献
1
. 小 y s t e i n F o d s t a d , e t a l . C a n e e r R e s 19 8 0 . 4〔) : 3 7 3 5 .
2
.
X i e s h u s h e n g
, e t a l
.
T r a n s p l a n t a t i o n l 9 8 7 . 4 4
:
7 7 0
.
3
. 谢蜀生 , 等 。 中国免疫学杂志 19 8 9 ; 5 , 2 0 6 .
4
. 俞莉章 , 等 。 中国泌尿外科杂志 19 8 9 ; 1:0 13 1 .
5
. 马爱红 , 等 。 中国泌尿外科杂志 19 90 ; 1 1 : 怕 5 .
6
. 许针奥 , 等 。 北京 医科大学学报 19 5 9 : 24 : l礴7 .
7
.
M i s h e l !
.
B B, e t a l
.
S e l e c t e d M e t h o d s i n e e i l u ! a r
l m m u n o l o g y 1 98 0书 P 2 6 9
.
章谷生 , 等 。 单克隆抗体在医学中的应用 。
上海人民出版社出版 . 19 87 ; 3P 93 .
P i e t e r s z G A
, e t a l
1 0
,
T h o r 冈 P E , e r a l .
.
C a n c e r R e s 19 8 8
:
4 8
:
44 6 9
.
I m m u n o l o g i e a 】 R e v 19月2 ; 6 2
: 1 1 9
.
1 1
.
D i e n e r E
, e t a l
12
.
G a r n e t r M C
, e t
13
,
T r i t t o n T R
, e t
.
5 : 1e n e e 19 8 6
`
2 3 1
:
14 8
.
a 1
.
C a n e e r R e s 19 86 . 4 6
:
24 0 7
.
a 】 . & : i e n e e 19 82 , 2 1 7 : 24 8 .
〔19 90年 s 月收稿〕
(编辑 徐 杰 )
肿瘤浸润性淋巴细胞在 IL 一 2 培养前后的
免疫学特性比较
曹雪涛 孔宪涛 杨用坤 徐志工 叶天星
(第二军医大学免疫学教研室 , 上海 2 0 0 4 33)
〔摘 要〕 本实验观察到 , 从瘤体中新鲜分离到的 、 未经 IL 一 2培养的肿瘤浸润性淋巴细胞 ( T IL )
分泌 IL 一 2 、 I FN 一 r 、 淋巴毒素 ( L T ) 的能力及其 N K 活性均显著低下 , 此种免疫功能低下状态可能与
T IL 在肿瘤微环境中受到肿瘤细 胞释放的免疫抑制物质的作用有关而不是由于分离操作过程所致 。 经几一 2
体外培养后 , T IL 分泌上述三种抗癌淋巴因子的能力和 N K 活性均显著提高 , 这表明 I L一 2可以解除 T IL 的
免疫 抑状态 、 使其免疫功能显著增强 , 也证明了 IL 一2激活的 T IL 除了能通过细胞间识别接触的方式直接
杀伤肿瘤细胞外 , 还可通过分泌抗癌淋巴因子而间接杀伤肿瘤细胞。
〔关键词 〕 肿瘤浸润性淋巴细胞 ; 白细胞介素 2 ; 免疫干扰素 ; 淋巴毒素 ; N K 活性
C h n JI m m u n19 9 0
.
6 ( 6) :3 2 6
i m m u
n
t
ze dm i e e we re , i g n i f i e a n t一y h 一 g h e r t h a n t h a t f r o m t h e e o n t r o l l m i e e . T h e r e , u l t 、
v e r i f i e d t h a 犷 e h or n i e C . j e j u n i i n fe e t i o n i n t h e g u t e o u l d i n d u e e a b n o r m a l
.
e h
r o n i e
m u e o s a l 一m m u n e r e s P o n 里 w h i e h I e d t o P e r t u r b a t i o n o f t h e s y s t e m i e im m u n e , y , t e m ,
r e s u 1t i n g a u t o i m m
u n i t y o r a u t o i m m u
n e , y n d r
o
m
卜
K e 夕 甲 o r d s : A u t o . m m u n e s y n d r o m e , C h r o n i e m u e o s a l i m m u n e r e , v o n s e , A u t o i m m u n i r y ,
V a e e i n e o f C
.
j e j u n i
,
P
o l y e l o n a l a e t i
v a t i o n
,
Im m u n o c o m p l e x g l o nr e
r u l o
-
n e P h r i t i s
( 0 r i梦 i ” a l a 尸r i e l e s e e P a g e 3 5 3 )
C o n s t r u e t l o n a n d e y t o t o x l e i t y o f t肋 一 k l l l i n g 一 a g e n t ’ lm m u n o t o x 奋n e o n t a 诬n i n g R l e l n
a n d A d r 扭a . y e 奋n
X i e S h u s h e n 梦 , e r a l . D e 刀a r r m e ” r o f I m 爪 u n o ot 梦v , B e i j i雌 9 M e d i e a l U n i o e r s i r 夕,
B e i j i ” 梦 10 00 8 3 , C h i n a
T h e , y n e r g i , t i e e fT e e t o f e o m b i n a r i o n , o f k川 i n g a g e n t , o n t u m o r e e l ls h a s Io n g b e e n r e e o g -
n i z e d
.
Fdo , r a d e t a l
, r e P o r t e d t h a t t h e e o m b i n a t i o n , o f R ie i n a
n d A d ir a m y e i n h a v e a s t r o gn
.
, yn e r g i s t i e e f f e e t o n t h e L 12 1 0 l e u k e m i a e e l l s
.
I n t h i ,
r e P o r t
, a n o v e l im m u n o t o x i n e o n t a i n
-
i n g R i e i n a n d A d r i a m y e i n
,
B D I
一
1 一 R i e i n 一 A d r i a m y e i n
,
w a , d e s e r i b e d
. :
R i e i n a n d A d
r一a m y
-
e 1 n w e er e h e m i e a l l y e o u P l e d o n t o o n e m o n o e l o n a l a n t i b o d y m o le e u l e a g a i n s t h u m a n b l
-
a d d e r e a n e e r
,
B D I 一 l
.
t o e o n s t r u e t t h e t w o 一 k i l li n g 一 a g e n t e o n t a i n i n g i m m u n o t o x i n
.
T h e
er , u l t s o f i n d i r e e t im m u n o f l u o r e s e e n e e t e s t a n d e o m P e t i t o n b i n d i g a s s a y s h o w e d t h a t t h e
er t e n t i o n o f 7 0 % o r t h e a n t i b
o
d y b i n d i n g a e t i v i t y i n t h i s i m m u n o t o x i n w a , o b t a i n e d
.
T h e i n v i t r o e y t o t o x i c i t y a , s a y i n d i e a t e d t h a t t h e im m u n o t o x i n i n t h e P er s e n e e o f 0
.
I M
g a l a e t o肥 i , 3 0 . 0 0 0 t i m e s m o r e e y t o t o x i e t h a n B D I一 1一 A d r i a m y e i n e o n j u s a t e a n d 1 0 t i m e s
m o r e e y t o t o x i e t h a n B D I
一
1
一
R i e i n im m u n o t o x i n i n t h e b l a d d e r e a n e e r 一 , P e e i f i e k i l l i n g ,
b u t h a s n o e y t o t o x i e e f f e e t o n t h e LO V O e o l o n e a r e i n o m a e e l l ,
.
T h i , t w o
一
k i ! I i n g
一 a g e n t
e o n t a i n i n g i m m u n o t o x i n m a y l e a d t o t h e d e v e l o P m e n t o f a n e w k i n d o f 一m m u n o t o x i n s
w h i e h h a v e s t or n g e y t o t o x i c a e t i v i t y t o t a r g e t e e l l s
.
K e 夕 甲 o r d s : Im m u n o t o x i n , R i e i n , A d r i a m y e i n
( 0 r i g i n a l a r r i e l e s e e 刀 a 尸e 3 6 3 )
H P L C 一 E C D a s s a y e e n t r a l m o n o a m 诬n e t r a n , m l t t e r s a n d k l n e t i e e h a n g e o f e e n t r a l
m o n o a m 奋n e t ar n s m . t t e污 d u r i n g i m m u n o l o g i e a l r e , P o n , e
y a n多 J i n 梦 P i n 多 , Y a n 多 G u i了 h e n . I 功 m u n o l o 梦夕 D e 尸a r r m e n r o . f N o r m a ” B e , h u n e
U n i o e r对 r y o f M e d i e a l S c e i月 c e , C h a n梦 c h u ” 1 3 0 0 6 1 , C h i陀 a
A ar P i d a n d s im P l e e h r o m a t o g r a P h i e P r o e e d u er u s i n g H P L C 一 E C D i s d 。笙 r i b e d fo r
5 1m u l t a n e o u s d e t e mr i
n a t i o n o f N E
.
E
.
D A
.
5
一
H T w i t h t h e i
r P r o e u 污o r a m in o a e i d ( T y r .
T r p ) a n d t h e i r m a i n m e t a b o l i t e s ( H V A
.
5 一 H IA A )
. 口 s i n g t h i , a , a y , e i g h t s u b s t r a t e , a r e
m e a s u r e d i n e o r t e x
,
d i e n e e P h a l o n a n d b r a i n st e m o f m i e e d u i n g im m u n o l o g ie a l r e s P o n se
e h a l t e n g e d b y S R B 6 3 d a y s a f t e r e h a l l e n g e d
, t h e D A H V A i n e o r t e x
,
N E i n d i e n e e
-
P h a l o n d e e 允 a s e o b v i o u s l y ( P < 0 . 05 ) , a n d 5 d a y s a f t e r e h a l l e n g e d , 5 一 H T i n d i e n e e P -
h a l o n a n d s
一
H IA A i n b r a i n
, t e m i
n e r e a se s i g n i f i e a n t l y ( p < 0
.
0 5 )
,
w h i e h s u p p o r t s
t h e h y P o t h e s i s t h a t im m u n o l o g i e a l r es P o n s e m a y a e t o n m e t a b o l i s m
o
f e e
n t r a l m o n o
a
m i
n e
t段 n s m i t t e r s .
K e 夕 甲 0 r d s : R e v e r , e P h a s e i o n 一 P a i r H P L C
t ar n s m i t t e r s
,
Im m u n o l o g i e a l
E I e e t r o e h e m i e a l d e t e e t i o n
,
M o n o a m i n e
r e S P 0 n s e
( 0 r i梦 i n a l a r r i e l e s e e p a 尸 e 3 7 (1 )