全 文 ：药理
狼毒大戟二菇内醋对人癌细胞体外抑制作用的研究
中山医科大学(广州 1 50 89 )刘文菜 何风雷 阮子铸 顾 熊飞
中国科学院上海药物研究所 (上海 2仪刃31 )吴晓云 秦国伟
摘要 从狼毒大戟中分得的两个二枯内醋化合物 : 1 6- hy如x 坪鱿 ud oj 曲oli nd sB ( 化合物 工 )和 jol i ko n-
lid eB ( 化合物 n ),对人红白血病 5K 62 细胞及人鼻咽癌 CN EZ 细胞的抑制作用呈明显的量效关系 , 化合
物 I 的 I与与阿霉素相当。
关健词 狼毒大戟 抗癌活性 人癌细胞 阿霉素
狠毒大戟 ( 乙甲彻场她 户hce ~
s et ud
.
) 治
疗肺癌 、肝癌 、 胃癌等恶性肿瘤临床疗效显著 ,
未发现对心 、 肝 、 ’肾等造血系统的不 良反应 。 动
物实验证明 :该药的水 、醇粗提物对多种移植性
动物肿瘤 , 均具有显著的抑制作用和较低 的毒
性l[] ,但未见该药化学成分单体的抗癌活性报
道。 笔者曾报道分离得到菇类和葱醒类等多种
化合物 2[ 一 4〕 ,本文报道所分离的 2 种二菇类化
合物 16 一场dx1D 即seu doj of ik on l记e B (化合物 工 )和
」砒访 iol de B( 化合物 n ) , 对体外培养的人红 白
血病 5K 6 2 细胞及人鼻咽癌 C N ZE 细胞的生长
具 有 较 强 的 抑 制 作 用 , 16一场枷月甲哭记。 -
j砒 ioln ide B对这两种人癌细胞的 50 % 细胞增殖
抑制浓度 ( I与 )与阿霉素相当 。
1 材料和仪器
,
.
1 材料 狼毒大戟药材购 自上海市药材公
司 ,经上海医科大学王志伟教授鉴定 ;层析用硅
胶系青岛海洋化工厂产品 ;层析板为 Mhac e eyr -
N卿 1公司产品 ;阿霉素 (A D M )为深圳万乐药业
有限公 司产品 ; 唾 哇蓝 ( MT T )和 RP M I一 1翻 0 培
养液为 iS gn l a 公司产 品 ; DN A 一、 p R哪 e n t 儿 t
试剂为 亡ou l et : 公司产品 ; 9 6 孔培养板为 e o m i n g
公司产品 ;人红 白血病 5K 62 细胞及人鼻咽癌
侧EZ 细胞由中山医科大学肿瘤研究所提供 。
,
.
2 仪器 K泊fl er 显微熔点 仪 (温度计未校
正 ) ; P e kr in 一 Eln肥 r 59 B 型红外光谱仪 ; B rU e k e r
AMX召X )型 核磁共振仪 ; MA T一 71 1 型 质谱仪 ;
SHEL LA B 型 C仇 培养箱 ; D G 30 2 2 型酶联免
疫检测仪 ; 0 1抑叩 u s 相差显微镜 ; lE iet 型 流式细
中药材第 23 卷第 10 期 2以X) 年 10 月
胞仪 。
2 方法
2
.
1 二菇内醋抗癌化学成分的提取 、分 离和鉴
定 生药用 95 % 乙 醇冷提 , 再用石油 醚复提 ,
硅胶柱反复层析 ,石油醚 一丙酮混合溶剂梯度洗
脱 ,得化合物 工、 H 。 根据 光谱分析和理 化性
质 ,推断化合物的结构 。
2
.
2 生药水提液的制备 将生药 10 9 粉碎 ,
加蒸馏水浸泡 l h , 煮沸 l h 后过滤 。 滤渣加蒸
馏水煮沸 l h ,合并两次滤液 。 离心 , 取上清液 ,
配成 0 . 1 留 d 浓度 ,常压蒸气灭菌备用 。
2
.
3 人癌细胞的培养 人红白血病 5K 62 细胞
用含 巧% 小牛血清的 RP M I一 1砚0 培养液在 5 %
C仇 、 37 ℃条件下培养 , 离心后传代 。 人鼻咽癌
CNE Z 细胞用 10 % 小牛血清的 RP M I一 164 0 培养
液在 5% C仇 、 37 ℃条件下培养 , 用 0 . 25 % 胰蛋
白酶 ED T A 液消化传代 。
2
.
4 人癌细胞抑 制率 ( % )及半数抑制 浓度
( I嘶% )的测定 阿霉素用生理盐水配制 ,过滤
除菌 。 化合物 工、 fl 以 D M SO 溶解后用培养基
配成系列稀释液 。 取对数生长期细胞调 成 0 . 8
x l护/ 而 ,移人 % 孔培养板 中 , 每孔 180 川 , 5%
C仇 培养箱 37 ℃预培养 Z h 。 加人 20 川不同浓
度的阿霉素或被试物 。 每组 4 个复孔 ,培养 72
h 后加人 0 . 5% MTT 20 风 , 继续培养 4 h , 离心
( 2X( X) rp m
,
IO un )
。 弃去上清液 ,每孔加 DMOS
150 川 ,微振荡使紫色甲脸溶解 。 用酶联免疫检
测仪测定 570 mn 的吸光度 。 计算细胞增殖抑
制率 , 再按 lB is s 法计算 I与 。
.
62 3
.
DOI : 10. 13863 /j . i ssn1001 -4454. 2000. 10. 015
分大部解片碎崩胞或缩细固见核可礼并少,ō尸减乱紊著显构密浆结度胞细
2
.
5 抗癌化学成分对人癌细胞形 态和周期的
影响 在细胞浓度为 l x l护 / d 的 5K 62 细胞
培养瓶中 ,加人化合物 工 , 37 ℃ 培养 72 h 后 , 在
相差 显微镜下 观察细 胞形态 的 变化 。 再用
0
.
01 m o l/ L 的磷酸盐缓冲液 ( P BS )洗涤 ,离心弃
去上清液 , 不断震 荡下滴加 1 而 70 % 乙醇固
定 , 4℃保存 24 h 后离心 , 弃去乙 醇 , 用 PB S 洗
涤 , 加人 ND A . Per p R e昭e n t ` t 试剂 ,染色 30 而 n
后用流式细胞仪在波长 4 8 ln 处检测 。 用鸡
红细胞作为标准并调至通道数为 10 士 2 , 记数
巧仪旧个细胞 。 测 出组方图用 M u l tic yc le 流式细
胞仪细胞专用软件 ( hP oen 议 n ow srS t~ 公司 )
处理 ,得 出细胞周期各时相的 ND A 相对含量和
百分数 。
3 结果
3
.
1 雍毒大软水提液时人癌细胞的抑制作用
狼毒大戟 的水提液对 NC ZE 和 5K 62 人癌细胞
作用 48 h 时 , 均有较强 的抑 制作用 , 且有 明显
的剂量效应关系 (见表 1 ) 。
表 1 狼毒大戟水提液对人癌细胞的抑制作用
浓度 c( 拼岁耐 ) 50 1田 乃 O , X) 10〕 〕 5。刃
抑制率 (% ) CN及 21 . 43 26 . 19 40 . 18 印 05 97 . 62
K钻 2 2 . 3 5 28 .汉 50 . 5 9 7 4 . 12 7 . 65
3
.
2 狼毒大软二菇内醋对人癌细胞的抑制作
用 单体化合物 1 6一 h yd or柳 eS u doj o dl oln ide B和
olj k i
n o l ide B 对体外培养的 CN E Z 和 5K 62 人癌
细胞均有很强的抑制作用 (见表 2) 。
表 2 狼毒大戟二菇内醋对人痛细胞
的抑制作用 ( IC由小岁而 )
CN皿 细胞 肠砚细胞药物 — —作用 48 h 作用 72 h 作用 48 h 作用 7 h2
表 3
药物浓度
1-6 h尹介创叮p史 u d oj o吸in浦 d eB
对 E万印 细胞形态的改变
5K 62 细胞形态
O 细胞密度大 , 圆形 ,周边界限清晰 , 胞浆内无明显颗粒状物 ,有肿瘤细胞的凝聚现象
5 解耐 细胞线粒体肿胀明显 ,少数细胞周边不整齐 , 胞膜不同程度崩解 , 核皱缩 , 少数细胞体积缩小
10 留耐 细胞密度减少 , 多数细胞周边不整齐 , 核变少 ,少数细胞体积变大
so 解 d
1
.
9%
, 加 16一 h y dor x邓 S e u doj ol k in ol id e B 后 , 细 胞
的 “ 亚 G , 峰 ” 为 7 . 5% , 提示 16一场d I’O x yP s eu do -
j
o lk ion l ide B 能诱导 5K 6 2 细胞 凋亡 。 加人 16 -
h yd m
x yP s e u doj ol k i
n o lid e B 后 , G , 期 细 胞 从
57
.
4%下 降到 4 6 . 3% ; S 期细胞从 38 . 2% 上升
到 45 . 7% ; q / M 期细胞从 4 . 4 % 上升到 8 . 0% ,
表明 16一 hdy or x yP s e u d oj o l ki n o l id e B 可抑制细胞周
期的 q / M , 阻断 q / M 期进人 G , 期 。
4 讨论
16
~
h y d or 扔币 s e u d oj o lk i n o l ide B 是狼毒大戟对
NC EZ 和 5K 62 人癌细胞具有较强抑制作用的有
效成分 , 从狼毒大戟低极性溶剂提取部分已分
得的多种化学成分 ,经生物活性初步筛选证实 :
这些单体化合物除具有抗癌活性外 , 尚具有镇
静 、镇痛和提高机体免疫机制 的作用 。 故狼毒
大戟的化学成分和生物活性的研究尚须深人进
行 。
注 :本研究系广东省中医药管理局基金资助项 目 (卯 539)
参 考 文 献
345
A DM 1
.
7 8 2
.
2 1 6
.以 4 . 5 3
子今h y钾理卿面 一 3 . 15 3 .犯 加 . 35 9 . 13
j滋ioln ide B 以 · ~ 、 一 ~ . ~
j砒 ioln ide B 62 . 59 > 1田 n . 70 > 10
3
.
3 16
一咧功习甲阳 u doj o ld oln 记e B 时 5K 62 细胞形 态和周期 的影响 用倒置相差显微镜观察其
对 K 562 细胞形态的改变 (见表 3 ) 。
在 DN A 组方 图中 , 未 加 16一 h yd拍卿 s e ud 。 -
olj ik
n o il de B 的 5K 62 细 胞 的 “ 亚 G ,峰 . ” 本 底 为
卢本芳 ,等 . 哈尔滨医科大学学报 , 1986 , ( l) : 90
W
e n 乙 U u( 刘文粱 ) , et al . Cih n es Che 而c al 敏 estr ,
1卯6 , 7 ( 10 ) : 9 17
坏g-n C a o aM , et al . Phyt oc he 而 st yr , 19 7 , 4 (4) “ 6 3
刘文染 ,等 . 中药材 , 19 7 , 20 ( 7 ) : 35 1
U e ln l l r a Dia su ke
,
et al
.
T e t
r
ah 。山℃ n 此 t t e r , 1卯2( 5) : 13 87
( 19 9
一 11 一 2 9收稿
2X( X) 一 03 一 17 修回 )
62 4 中药材第 23 卷第 or 期 2X( X) 年 or 月
So t山 e s血 及争肋角沁为`加洲勿协 戏抚几珍朋记 e La c o t ne sI nl l i bio ty rE 场C e t
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玩 W e面 , eH eF ngl e i , R u an Z iy o咫 , cu 兀。 n gfe i
( SnU Y
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v e rS l ty of M威 C己 反 ie n e e s , uG缨 hz o u 51 X() 89 )
W d 兀即犯m , iQ n G u o w e i
( Sh田 lgh ia Ins it tuet of M a t e ir a
,
ich ~ cA
a d e m y of 冤cen es 习团妙 ia Z仪刃 3 1 )
A阮。习 c t nI iht s aP per ,腼 id t e rF犯 no ide acl t~ -16 hy (ha x耳能duoj o lik n o lid e B an d jo dl no idl e B * er iso la tde 介o l l l uE -咖泌奴户c he iar an etS du . hT ey s h o w de 1 1】l ib iot yr e任加 t on 11t im 田 1 t tm犯 r ce ls 场d l het 5K 62 e e l 田 ld CN砍 ce U an d 51 9浦c ant
山汾 d RC t r e la t i0 1妈 11 ip .饭 I与 v al u e s of 16~ hy dr o x押忱 U doj o lk in o il de B on het wot h~ ~
c
els we er ~
ot
hat
of DA M
’ 5 .
K e y w or ds 云叩hD br 她户亡触而朋 etS du ; iD t e耳祀 no ide 城ot nes ; Iihn ih ot yr t tm l o r e拓沈 t ; H山 n an tr n n o r ce ls ; A DM
黄茂注射液对小鼠骨髓细胞增殖周期的影响
华西医科大学 (成都 61 (X科 l) 祝晓玲
成都中医药大学 (成都 61 0 75 ) 祝彼得
提要 采用骨髓细胞体外培养以及流式细胞仪等实验血液学方法 ,研究黄蔑注射液 ( A加n )对正常
和贫血小鼠骨髓细胞增殖周期的影响 ,终浓度为 4D 矛喇而 的 A扮1 以及终浓度为 气40 子州耐 、 中以均止g /耐 的
AM I加人培养体系中可分别促进正常或贫血小鼠骨髓细胞进人增殖活跃期 ( P < 0 . 05 ) ,提示一定浓度的
A五n 可 以增强小鼠的造血功能 。
关键词 黄蔑注射液 骨髓细胞 细胞周期 造血 小鼠
我国本草曾记载黄蔑可治一切气衰血虚之
证〔` 〕 ,临床应用以黄蔑为主要成分的中药方剂
治疗贫血 、 白细胞减少等疾病 ,疗效良好〔卜 4〕 ,
骨髓是造血的主要器官 ,本文运用骨髓细胞体
外培养和流式细胞仪检测技术 , 研究和探讨了
黄蔑注射液对正常和贫血小 鼠骨髓细胞增殖周
期的影响 , 以期为阐明黄蔑 的药理作用机制提
供实验依据 。
1 材料与方法
,
.
, 动物 8 一 12 周 龄 BALB / 。 纯系雄性小
鼠 ,体重 1 8 一 2 9 ,华西医科大学实验动物中心
提供 。
1
.
2 药品 与 试 剂 黄茂 注射液 (击 t r 口召。 l。
砒励 ar ~ 。 inj ec iot
n , A M )I
: 成都地奥九乱制药
厂产品 , 批号 : 970 8仅拓 , 20 岁 10 1l lF 安瓶 , ( 1 而
相当于原生药 2 9 ) , 用生理盐水配制成不 同浓
度置 4℃冰箱中贮藏备用 ; RP M I一 1麟 0 培养基 :
美国 GI B c o 公司产品 , 三蒸水配制 , PH 为 7 . 2
` 中药材第 23 卷第 10 期 2仪刃年 10 月
一 7 . ;4 马血清 : 美 国 GI B C O 公 司产品 ; NR A 酶 、
碘化丙吮荧光染液 : 美 国 sI GM A 公司产品 。
1
.
3 主要仪器 二氧化碳培养箱 , 流式细胞
仪 :美 国 B ec otn iD ck i sn on ,型号 FA 任沁ial b u r o
1
.
4 实验方法 常规制备骨髓细胞 (场en ~
wID ce ls
,
BM )C 和 贫血小 鼠模型〔5 一 6〕 ; 动物 分
组 :正常和贫血小 鼠各 9 只 , 分别随机分为三
组 ,每组三只 ,取每组小鼠骨髓细胞混匀制成单
细胞悬液 ; A M I 对正常小鼠骨髓细胞增殖周期
影响的测定 : 按 l x l护 个 BM C / d 种植于含
20 % 马血清的 RP M I一 164 0 培养液中 , 实验 I 一 W
组分别加人 o . l d 不 同药物浓度的 A M I (加人
培养体系的终浓度分别为 礴以刃 拜酬而月仪b 上岁
以 、 40 拼岁而 、 4 “ g/ 以 ) ,对照组加人等量 164 0 培
养液 ,置 37 ℃ , 含 5% COZ 培养箱 中培养 12 小
时 ,测定前 P BS 洗涤两次 , 加 RN A 酶工作液和
碘化丙吮荧光染液染色 30 分钟 , 上流式细胞仪
分析 ,每例样品测定 3 x l口 个 细胞 , 经计算机
·
6 25
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