全 文 ：2010 年 7 月第 27 卷第 4 期
July 2010，Vol． 27，No． 4
收稿日期:2009 － 12 － 14
作者简介:安冉 (1985 －) ，男，2008 级硕士研究生
通讯作者:杨锦芬，女，博士，副研究员，Email:yangjf@ gzhtcm. edu. cn
基金项目:广东省重大科技专项 (编号:2007A032200001) ;广东省科技计划项目 (编号:2006B35605008)
基于 26S rDNA D1-D3 区序列分析的鸡血藤及其混淆品的分子鉴别
安 冉1， 杨锦芬2， 刘军民1， 翟 明1， 徐鸿华1
(1． 广州中医药大学中药学院，广东广州 510006;
2． 广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心，广东广州 510006)
摘要:【目的】利用 26S rDNA D1-D3 区序列差异鉴别鸡血藤及其混淆品。 【方法】使用改良十六烷基三甲基溴化铵
(CTAB)法提取鸡血藤及其混淆品的总 DNA，选择浓度较高的样品作为模板 DNA，对 26S rDNA D1-D3 区进行 PCR 扩增、
测序和序列比对分析。【结果】获得 26S rDNA D1-D3 区长约 700 bp的序列。比对结果显示，不同产地之间鸡血藤的序列一
致率为 96%和 100%，混淆品与正品比较的序列一致率为 80% ～96%。在 26S rDNA D1-D3 区 384 ～ 472 bp的位置有足够的
碱基差异位点用以区分鸡血藤及其混淆品。【结论】26S rDNA D1-D3 区序列可以应用于鉴别鸡血藤及其混淆品。
关键词:鸡血藤; 序列分析，DNA
中图分类号:R284. 1 文献标志码:A 文章编号:1007 － 3213 (2010)04 － 0403 － 04
鸡血藤为豆科植物密花豆 Spatholobus suberectus
Dunn. 的干燥藤茎，其性温，味苦、甘，归肝、肾
经，有补血、活血、通络的功效，用于治疗月经不
调、血虚萎黄、风湿痹痛等症［1］。商品鸡血藤药材
基源植物除 《中国药典》收载的密花豆外，还有
豆科、五味子科、木通科等共 6 个属 15 种和变种
的植物，如常春油麻藤、香花崖豆藤等［2］。由于商
品鸡血藤的来源复杂，临床中常出现混用现象。目
前，对鸡血藤类药材的鉴别，多以传统鉴别方法为
主，但这不足以简便、准确地鉴别其真伪。植物基
因的 26S rDNA D1-D3 区中包含一个序列变异快的
D2 区可用于鉴别不同的植物，两端又有保守区域
可供设计通用 PCR引物，且该区域具有长短适宜，
便于扩增、测序和比对的特点［3］，因此，本研究选
用 26S rDNA D1-D3 区对鸡血藤及其混淆品进行
DNA序列分析，旨在为鸡血藤种质评价与鉴定提
供分子鉴别的依据，现报道如下。
1 材料与方法
1. 1 药材 实验所用的鸡血藤及其混淆品 (见表
1)采自我国鸡血藤主产区:广东、广西省区的野
外及广州中医药大学三元里药圃，经广州中医药大
学徐鸿华教授鉴定并确定其拉丁学名。分别采集幼
嫩叶片，装于密封塑料袋内，用变色硅胶干燥，置
于 － 20℃冰箱保存，备用。
表 1 鸡血藤及其混淆品的产地来源
Table 1 Producing areas of Caulis
Spatholobi and its adulterants
编号 名称 科属 采集地
1 鸡血藤 Spatholobussuberectus Dunn．
豆科，密花
豆属
三元里药圃
2 鸡血藤 Spatholobussuberectus Dunn．
豆科，密花
豆属
深圳布吉
3 鸡血藤 Spatholobussuberectus Dunn．
豆科，密花
豆属
广西岑溪
4 香花崖豆藤 Millettiadielsiana Harms．
豆科，崖豆
藤属
广州从化
5 厚果鸡血藤 Millettiapachycarpa Benth．
豆科，崖豆
藤属
广东广州
6 常春油麻藤 Mucunasempervirens Hemsl．
豆科，黧豆
属
云南昆明
7 鱼藤 Derris trifoliata Lour． 豆科
，鱼藤
属
广东广州
1. 2 试剂及仪器 Tris 购自 Saland-chem Interna-
tional Inc，十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)和聚
乙烯吡咯烷酮 (PVP)均购自上海伯奥生物技术公
304
广州中医药大学学报
Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine
DOI:10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2010.04.013
2010 年第 27 卷
司，乙二胺四乙酸 (EDTA)购自天津福晨化学试
剂厂，PCR 试剂、DNA marker 购自大连宝生物技
术公司，PCR产物纯化试剂盒购自北京赛百盛基因
技术公司，引物由上海生工生物工程技术公司合
成，PTC-200 型 PCR 仪 (美国 Biorad 公司) ，DY-
CP-31 水平电泳仪 (北京六一仪器厂) ，Infinity
1000 /26M 凝胶成像及分析系统 (法国 Vilber
Lourmat公司)。
1. 3 总 DNA 的提取 采用 CTAB 法［4］并加以改
良。取 0. 1 g 样品，用灭菌纯水把叶片冲洗干净，
吸水纸吸去表面水分。加 800 μL CTAB 提取液，
石英砂适量。冰浴快速研磨 1 min，转入 2 mL离心
管。65℃温浴 20 ～ 40 min，间或轻摇离心管。将离
心管取出，冷却至室温，加入等体积的氯仿—异戊
醇 (体积比 24∶1)。将离心管上下颠倒几次，充分
混匀，10 000 r /min 离心 15 min。吸取上清液
400 μL，加入等体积的氯仿—异戊醇重复抽提 1
次，离心。取上清液 300 μL，加 0. 7 倍体积的冰
冻异丙醇，缓缓平转离心管，可见白色的 DNA 絮
状物，4℃冰箱放置 20 min ～ 2 h。10 000 r /min 离
心 15 min，弃上清液。用体积分数 70%乙醇 1 000
μL清洗沉淀 2 次，10 000 r /min 离心 5 min，倒出
乙醇。沉淀室温风干后，加 150 μL灭菌纯水溶解，
－ 20 ℃保存，用 10 g /L 的琼脂糖凝胶电泳检测
DNA质量。
1. 4 PCR 扩增及产物测序 引物选用 DUAN5
(5’-TAGTAACGGCGAGCGAAC-3’)、DUAN6 (5’-
GGCATAGTTCACCATCTTTC-3’)［3］分别做为上下游
引物扩增 26S rDNA D1-D3 区。PCR 反应总体积 50
μL，含 ExPCR buffer 5 μL，三磷酸碱基脱氧核苷
酸 (dNTPs) 3. 75 μL，DUAN5、DUAN6 各 1. 25
μL，Ex Taq 酶 0. 5μ L，模板 DNA 1. 5 μL (约 50
ng) ，灭菌水补足 50 μL。扩增程序为:94 ℃预变
性 2 min 后进入循环，94 ℃变性 30 s，60 ℃复性
30 s，72 ℃ 延伸 1 min，循环 29 次;72 ℃延伸 5
min，4 ℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，
回收目的片段，送广州英骏生物技术公司用上下游
引物进行双向测序。
1. 5 序列的同源性比对及提交 登陆 http: / /
blast. ncbi. nlm. nih. gov /Blast. cgi，对测序所得序列
进行 BLASTN (Nucleotide BLAST)同源搜索，确
定所获序列是否为 26S rDNA 基因序列。使用
Sequin软件向 GenBank 提交所测得的 7 个样品序
列，获得序列登记号。
1. 6 序列分析 采用 BLASTN 的两序列比对功能
(Align two sequences using BLAST) ，以鸡血藤样
品 1 的 26S rDNA D1-D3 序列为标准序列，分别与
之比对获得序列之间的一致率。用 DNAMAN 软件
对 7 个样品的序列进行多重比对，寻找差异位点，
并构建系统发生树。
2 结果与分析
2. 1 总 DNA的提取 如图 1 所示，从叶片中提取
到的 7 个样品的总 DNA浓度约为 30 ～ 50 ng /μL 。
1. 鸡血藤 1;2. 鸡血藤 2;3. 鸡血藤 3;4. 香花崖豆藤;
5. 常春油麻藤;6. 厚果鸡血藤;7. 鱼藤;
8. DNA Marker (250 bp DNA Ladder)
图 1 总 DNA电泳图
Figure 1 Electrophoregram of total DNA of Caulis
Spatholobi and its adulterants
2. 2 26S rDNA D1-D3 区扩增结果 如图 2 所示，
7 个样品 PCR 扩增后均得到长度约为 750 bp 的清
晰片段，与预期的 26S rDNA D1-D3 区 700 ～ 800 bp
的片段大小基本相符。
1. 鸡血藤 1;2. 鸡血藤 2;3. 鸡血藤 3;4. 香花崖豆藤;
5. 常春油麻藤;6. 厚果鸡血藤;7. 鱼藤;
8. DNA Marker (250 bp DNA Ladder)
图 2 PCR产物
Figure 2 PCR products of Caulis Spatholobi and its adulterants
404 广州中医药大学学报
第 3 期
2. 3 序列分析 对各样品的 PCR 产物测序结果进
行处理，得到鸡血藤及其混淆品的以 “TTAGTTA”
为始端和以“TGTG (A)AAGG”为末端的 698 ～
707 bp序列。对所得的 7 个样品序列进行 BLASTN
同源性搜索，结果显示，与已知的大豆 Glycine max
Merrill.的 26S rDNA 部分序列 (GenBank 登记号:
AY935814)均有较高的序列一致性 (见表 2) ，其
中最高达 97%，证明本实验扩增获得的序列为 26S
rDNA的部分序列。向 GenBank 提交鸡血藤及其混
淆品的 7 个 26S rDNA 部分序列，获得相应的序列
登记号 (见表 3)。
以鸡血藤样品 1 的 26S rDNA D1-D3 区序列作
为标准序列，其他序列与之比对的结果显示，不同
产地鸡血藤之间的序列一致率为 96%或 100%，4
种混淆品与正品鸡血藤的序列一致率为 80% ～
96% (见表 2)。7 个样品序列多重比对的结果检
测到较多的碱基差异位点，其中差异位点较集中的
区域位于 384 ～ 472 bp (见表 3) ，这些差异位点足
以区分鸡血藤正品及其混淆品。
表 2 序列比对
Table 2 Sequence comparison of Caulis
Spatholobi and its adulterants p一致 /%
样品
与大豆序列
(AY935814)比较
与鸡血藤样
品 1 序列比较
鸡血藤 1 96 —
鸡血藤 2 97 96
鸡血藤 3 96 100
香花崖豆藤 88 80
常春油麻藤 95 88
厚果鸡血藤 95 95
鱼藤 79 96
表 3 基因差异位点
Table 3 Gene different sites of Caulis Spatholobi and its adulterants
样品
差 异 位 点
3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
8 8 8 9 9 9 9 9 9 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 6 6 6 6 7 7
4 6 8 0 1 3 5 6 9 0 1 4 7 8 2 3 4 6 7 9 0 1 5 7 0 6 7 8 0 2 3 4 5 3 7 1 2 6 7 1 2
GenBank
序列
登记号
鸡血藤 1 A G C A G G C G C C G A C G C G G G C C G G G C G T G A G T G G C C C C G T G G T GU129914
鸡血藤 2 － － T － － － － － － － － G － － － － A A － T C － － － － － － － － － － － － － － － － － － － C GU129915
鸡血藤 3 － － C － － － － － － － － A － － － － － G － C G － － － － － － － － － － － － － － － － － － － T GU129913
香花崖豆藤 － － T C － － － － － － － G T － － － － A － C C A — A C A G A － － － G — G － C A － C GU129916
常春油麻藤 － － － － － A － － － － － A － － － － － G － T － － － T － － － － － － － － － － T － － － T － T GU129911
厚果鸡血藤 － － － － － A － － － － － － － － － － － A － T － － － T － － － － － C － － － － T － － － T － C GU129912
鱼藤 G A － T A － T A T T A — A T A — T A T － A － A － － － － － C T － T T － N － － A T GU129917
2. 4 亲缘关系分析 以 7 个样品的 26S rDNA D1-
D3 区序列构建系统发育树，结果如图 3 所示。厚
果鸡血藤与不同属的常春油麻藤的亲缘关系较近，
而与同属植物香花崖豆藤的亲缘关系反而较远。不
同产地鸡血藤之间的遗传距离明显小于鸡血藤与混
淆品之间的遗传距离，即属内 (密花豆属)遗传
距离明显小于属间 (密花豆属与崖豆藤属、黧豆
属、鱼藤属)遗传距离。
图 3 基于 26S rDNA D1-D3 区构建的系统发育树
Figure 3 Construction of phylogenetic tree of Caulis
Spatholobi and its adulterants based on
26S rDNA D1-D3 region
504安 冉，等． 基于 26S rDNA D1-D3 区序列分析的鸡血藤及其混淆品的分子鉴别
2010 年第 27 卷
3 讨论
Kuzoff等［5］的研究表明，26S rDNA 序列存在
D1-D12 共 12 个高变异的扩展区可用于鉴别不同的
植物，扩展区的两端又存在变异较慢的保守区域可
供设计通用 PCR引物。本研究选用 26S rDNA序列
中最具有代表性的 26S rDNA D1-D3 区域，尝试运
用 26S rDNA D1-D3 区的序列分析从分子角度建立
一种可以准确、快速地鉴别鸡血藤及其混淆品的方
法。
本研究结果显示鸡血藤及其混淆品在 26S
rDNA D1-D3 区域的碱基序列具有较高的保守性
(正品鸡血藤与混淆品的序列一致率高达 80% ～
96%)的同时，又存在较多的碱基差异位点，特别
是在 384 ～ 472 bp 的区域 (D2 区)内存在足够的
差异位点可区分不同种属的样品。表明不同产地鸡
血藤之间的变异性小于鸡血藤与其混淆品之间的变
异性，即种内变异性小于种间变异性，借此可以区
分鸡血藤与其混淆品。
由于本研究材料的采集还不够广泛，加上物种
本身的遗传多样性，这可能是造成系统发育树中表
现的亲缘关系与传统分类法不完全一致 (本文系
统发育树显示，厚果鸡血藤与不同属的常春油麻藤
的亲缘关系较近，而与同属植物香花崖豆藤的亲缘
关系反而较远)的原因。
(致谢:本研究获得广州中医药大学中药资源科学与工
程研究中心詹若挺教授和黄琼林研究生的大力支持和帮助，
特此致谢!)
参考文献:
［1］国家药典委员会． 中华人民共和国药典 (一部) ［M］． 北京:
人民卫生出版社，2005:134．
［2］陈道峰，徐国钧，徐珞珊，等． 中药鸡血藤的原植物调查与
商品鉴定 ［J］． 中草药，1993，24 (1) :34．
［3］段中岗，陈蔚文． 中药材 DNA条形码研究 ［R］． 广州中医药
大学博士后出站研究工作报告，2008:65 － 66，77．
［4］段中岗，黄琼林，杨锦芬，等． 适合中药材 DNA 条形码分析
的 DNA提取方法的研究 ［J］． 中药新药与临床药理，2009，
20 (5) :480．
［5］ Kuzoff P K，Sweere J A，Soltis D E，et al． The phylogenetic
potential of entire 26S rDNA sequences in plants ［J］． Molecular
Biology and Evolution，1998，15:251．
Molecular Identification of Caulis Spatholobi and Its Adulterants Based
on Sequence Analysis of 26S rDNA D1-D3 Region
AN Ran1， YANG Jinfen2， LIU Junmin1， ZHAI Ming1， XU Honghua1
(1． School of Chinese Herbal Medicine，Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510006 Guangdong，China;
2． Research Center of Chinese Medicinal Resource Science and Engineering，Guangzhou University of TCM，
Guangzhou 510006 Guangdong，China)
Abstract:Objective To identify Caulis Spatholobi and its adulterants through the sequence differences of 26S
rDNA D1-D3 region． Methods The total DNA of Caulis Spatholobi and its adulterants were extracted by modified
method of cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB)． The DNA samples with high concentration were chosen as
the template and were used to proceed PCR amplification of 26S rDNA D1-D3 region． The PCR products were
sequenced and the sequences of different samples were analyzed． Results We obtained 700 bp fragments of 26S
rDNA D1-D3 region． The concordance rate was 96% and 100% in the sequence identity at 26S rDNA D1-D3
region of Caulis Spatholobi from different habitats，and was 80% ～ 96% in the sequence identity of Caulis
Spatholobi and its adulterants． There were enough different bases of 384 ～ 472 bp in 26S rDNA D1-D3 region to
identify Caulis Spatholobi from its adulterants． Conclusion The sequence of 26S rDNA D1-D3 region can be used
to identify Caulis Spatholobi and its adulterants．
Key words:CAULIS SPATHOLOBI; SEQUENCE ANALYSIS，DNA
604 广州中医药大学学报