全 文 ：［收稿日期］ 20141127(001)
［基金项目］ 贵州省科技厅和贵阳中医学院联合资金项目(黔科合中药字［2011］LKZ7033 号)
［第一作者］ 卢启振，硕士，从事镇痛中药药效物质基础研究，Tel:18785122704，E-mail:1218917384@ qq． com
［通讯作者］ * 邓炜，教授，从事中药民族药药效物质基础研究，Tel:13885036019，E-mail:914214883@ qq． com
紫金莲醇提物 2 种萃取部位镇痛作用机制探讨
卢启振，黄聪，邓炜*
(贵阳中医学院，贵阳 550002)
［摘要］ 目的:探讨紫金莲醇提物 2 种萃取部位对甲醛致痛大鼠模型的镇痛作用及机制。方法:56 只 SD 大鼠随机分 6
组，每组 8 只，分别设为正常组，模型组，紫金莲醇提物乙酸乙酯部位高(乙高组 30 mg·kg －1)、低(乙低组 15 mg·kg －1)剂量组，
紫金莲醇提物正丁醇部位高(正高组，15 mg·kg －1)、低(正低组，8 mg·kg －1)剂量组。各给药组按剂量 ig大鼠，给药 7 d，每日 1
次。第 7 天末次给药 40 min后，除正常组外，其余各组大鼠左后足跖 sc 10%甲醛溶液 50 μL /只，建立大鼠甲醛致痛模型。观
察紫金莲 2 种活性部位对甲醛致痛模型大鼠痛行为的影响，生化法检测大鼠血清谷氨酸和 Ca2 +含量，免疫组化法检测大鼠脑
和脊髓 c-fos阳性细胞表达和 P物质(SP)含量。结果:与正常组比较，模型组大鼠表现出了典型的两时相痛行为学反应，且在
脑和脊髓中检测到了大量的 c-fos阳性细胞，P物质(SP)，升高血清谷氨酸及 Ca2 +含量有显著性差异(P ＜ 0. 05) ，表示造模成
功。与模型组比较，紫金莲乙低组(15 mg·kg －1)和正低组(8 mg·kg －1) ，对大鼠第一时相伤害反应疼痛有显著的抑制作用
(P ＜0. 05) ，使大鼠血清谷氨酸和脑 c-fos蛋白表达显著下降(P ＜ 0. 05) ，血清 Ca2 +含量显著升高(P ＜ 0. 05) ;紫金莲醇提物乙
高组(30 mg·kg －1)和正高组(15 mg·kg －1)显著降低大鼠脊髓 c-fos蛋白表达(P ＜ 0. 05) ;紫金莲醇提物乙高、乙低组和紫金莲
醇提物正高、正低组都能显著降低 SP在大鼠脑和脊髓中的表达(P ＜ 0. 05)。结论:紫金莲醇提物 2 种萃取部位对大鼠甲醛致
痛模型均有镇痛作用，其镇痛机制可能与抑制体内谷氨酸的升高，抑制细胞内 Ca2 +浓度升高及降低 c-fos，SP在中枢神经系统
内的表达有关。
［关键词］ 紫金莲;萃取部位;镇痛;机制
［中图分类号］ Ｒ285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2015)08-0141-04
［doi］ 10. 13422 / j． cnki． syfjx． 2015080141
Study on Analgesic Mechanisms in CNS with Extraction Part of National Medicine Ceratostigma
willmottianum LU Qi-zhen，HUANG Cong，DENG Wei* (Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，
Guiyang 550002，China)
［Abstract］ Objective:To study the analgesic mechanisms of two extraction part of Ceratostigma
willmottianum (CW) in rat pain model induced by formaldehyde． Method:Fifty-six SD rats were randomly
divided into 6 groups with 8 in each group，including normal group，model group，CW alcohol extracts ethyl
acetate part group (30，15 mg·kg －1) ，n-butanol part group (15，8 mg·kg －1)． Each group was given
corresponding drugs by intragastric injection，respectively，once a day for 7 days． At the 7th day，the animals were
fasted for 12 hours，and ig 40 min later，except normal group，the other groups were given subcutaneous injection
of 10% formaldehyde solution 50 μL for establishing the pain models． The impact of CW active site was observed
and serum glutamate and Ca2 + were detected with biochemical kit，and the expression of c-fos and substance P
(SP)was assayed with immunohistochemeistry (IHC)． Ｒesult:Compared with normal group，model group
showed a typical pain behavior，amounts of c-fos and SP were detected in the brain and spinal cord，and raised
serum glutamic acid concentration，Ca2 + content with significant difference (P ＜ 0. 05)，meaning that the pain
model of rats induced by formaldehyde was successful． Compared with model group，the low dose of ethyl acetate
part of CW alcohol extract (15 mg·kg －1)and n-butanol part (8 mg·kg －1) can obvious inhibition to the first
phase damage response (P ＜ 0. 05) ，make serum glutamic content，brain c-fos protein expression decreased
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significantly (P ＜ 0. 05) ，serum Ca2 + increased significantly (P ＜ 0. 05) ;the high dose of two parts decreased
the expression of c-fos in spinal dorsal cord significantly (P ＜ 0. 05) ;both of high and low dose of CW alcohol
extracts ethyl acetate and n-butanol part decreased the expression of SP significantly (P ＜ 0. 05) in central
nervous system (CNS)． Conclusion:Two extraction parts of CW alcohol extract have exact analgesic action in
rat pain model induced by formaldehyde， and its analgesic mechanisms may be related to inhibiting the
intracellular Ca2 + concentration and glutamate content in the body，reducing the expression of c-fos and SP
in CNS．
［Key words］ Ceratostigma willmottianum;extraction part;analgesic;mechanisms
紫金莲为贵州苗族、侗族等民族常用药，多用来
治疗疼痛症，有活血止痛，化瘀生新功效。前期实验
已证明紫金莲醇提物有良好的镇痛抗炎作用，且临
床所用剂量安全无毒［1］。后续实验发现紫金莲醇
提物的乙酸乙酯部位和正丁醇部位有较高的镇痛活
性，而其镇痛机制尚未见文献报道，故本文对紫金莲
2 种萃取部位的镇痛机制进行探讨。
1 材料
1. 1 动物 SD大鼠，雌雄各半，体重(280 ± 20)g，
SPF级。由中国人民解放军第三军医大学实验动物
中心提供，合格证号 SCXK-(军)2012-0003。
1. 2 药物 紫金莲药材采自贵州威宁县，经贵阳中
医学院孙庆文副教授鉴定为蓝雪科植物紫金莲
(Ceratostigma willmottianum，CW)。药材干燥打粉，
取粗粉 1 700 g，加入 75%乙醇回流提取 3 次，每次 1
h，回收乙醇，得醇提浓缩液 1 000 mL。依次用石油
醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，浓缩干燥，分别得
到乙酸乙酯和正丁醇干浸膏 49. 7，25. 2 g，其得膏率
分别为 2. 92%，1. 48%(1 mg乙酸乙酯或正丁醇提取
物分别相当于紫金莲生药材34，67 mg)。结合前期实
验结果，确定紫金莲乙酸乙酯、正丁醇提取物对大鼠
甲醛致痛实验的剂量高剂量组分别为 30，15 mg·kg －1
(分别相当于紫金莲生药材1 020，1 005 mg·kg －1) ，低
剂量组则分别减半。
1. 3 试剂 大鼠谷氨酸测试盒(南京建成生物工
程研究所，批号 20140630) ，大鼠血清钙试剂盒(南
京建成生物工程研究所，批号 20140610) ，PV-6001
兔二步法检测试剂盒(北京博奥森生物技术有限公
司，批号 K143310B) ，ZLI-9032 DAB显色试剂盒(北
京博奥森生物技术有限公司，批号 14138A10)。
1. 4 仪器 ELx808IU 型自动酶标读数仪(美国
BLoTek公司)，752 型紫外-可见分光光度计(上海
菁华科技仪器有限公司) ，LD4-2 型低速离心机(北
京医用离心机厂)，LEICA DM 1000 型彩色摄像机
(日本 JVC公司)。
2 方法
2. 1 大鼠甲醛致痛实验［2］ SD 大鼠随机分为 6
组，每组 8 只，分别为正常组，模型组(给予等容积
蒸馏水)，紫金莲醇提物乙酸乙酯部位高、低剂量
组(简称乙高、乙低组) ，紫金莲醇提物正丁醇部位
高、低剂量组(简称正高、正低组)。按剂量大鼠 ig
给药 7 d，每日 1 次。第 7 天末次给药 40 min 后，
于大鼠左后足跖皮下注射 10%甲醛溶液 50 μL /
只，以抬足、抽缩等行为学表现作为大鼠疼痛反
应，记录抽缩次数。以注射甲醛溶液完毕开始计
时，0 ～ 5 min为第Ⅰ相反应时间，间隔 15 min 为静
止期，以 20 ～ 40 min作为第Ⅱ相反应时间，统计各
组大鼠在第 I 相和第Ⅱ相反应期内左后足抽缩
次数。
2. 2 对大鼠血清 Ca2 +和谷氨酸的影响 各组大鼠
给药 7 d，于末次给药后给大鼠左后足注射甲醛溶液
致痛计时完毕，股动脉取血，分离血清。分别测定各
组大鼠血清 Ca2 +和谷氨酸的含量。
2. 3 对大鼠中枢 c-fos 蛋白和 P 物质(SP)表达的
影响 连续给药 1 周，于大鼠左后足注射甲醛致痛
计时完毕，处死大鼠，于冰面迅速取大鼠全脑和脊髓
腰段，用 10%中性甲醛溶液快速固定、脱水、包埋、
切片;按要求进行 DAB 显色，应用免疫组织化学标
记法检测 c-fos蛋白和 P物质 SP表达。在大鼠中脑
导水管周围灰质区域和同侧脊髓背角腰膨大区，以
胞核染成深棕色，胞浆未染色，神经细胞无形态轮廓
显示，低倍和高倍镜下与背景区分明确，为c-fos蛋白
阳性表达;以胞浆中沉积棕褐色或深棕色颗粒，定位
于细胞质，而胞核未染色，为 SP 阳性表达。每组取
5 张切片，随机选取 10 个视野 400 倍镜下观察大鼠
脑和脊髓阳性表达区域，计数 240 个切片中阳性细
胞数，取均值进行统计分析［3］。
2. 4 统计学分析 实验数据均以 珋x ± s 表示，采用
统计软件 SPSS 17. 0 进行方差分析，组间比较采用 t
检验，P ＜ 0. 05 为有统计学意义。
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3 结果
3. 1 对甲醛致痛模型大鼠行为学反应及其血清
Ca2 +及谷氨酸的影响 正常组大鼠均未见到抽缩
足等行为学表现，模型组和各给药组均出现注射足
抽缩等痛行为学反应。各给药组大鼠第Ⅰ时相左后
足总抽缩次数与模型组比较均有所减少，乙低组、正
低组有显著性差异(P ＜ 0. 05);而在第Ⅱ时相，各给
药组与模型组比较均无显著性差异。大鼠甲醛引起
的疼痛是一种比较局限的紧张性疼痛，常用于鉴定
中枢作用药物，本实验结果提示紫金莲醇提物乙酸
乙酯、正丁醇部位的小剂量皆有明显的中枢镇痛作
用，且主要抑制急性痛反应，持续时间较短。而且与
模型组比较，乙高组、乙低组、正低组在降低血清谷
氨酸浓度和升高血清 Ca2 +含量方面，均具有显著差
异性(P ＜ 0. 05) ，与大鼠行为学实验结果基本吻合。
提示紫金莲醇提物乙酸乙酯、正丁醇部位小剂量的
中枢镇痛作用，与降低血清谷氨酸浓度及钙拮抗作
用有关。见表 1。
3. 2 对甲醛致痛模型大鼠 c-fos蛋白和 SP表达的影
响 正常组大鼠的脑和脊髓中均未见到 c-fos蛋白和
SP物质表达。与模型组比较，各给药组降低甲醛刺
激模型大鼠脑和脊髓 c-fos蛋白和 SP 表达均具有显
著性差异(P ＜ 0. 05)。紫金莲醇提物乙酸乙酯部位
和正丁醇部位的低剂量明显降低脑 c-fos 蛋白表达;
而乙酸乙酯部位和正丁醇部位的高剂量在降低脊髓 c-
fos蛋白表达较明显。同时紫金莲醇提物乙酸乙酯和
正丁醇部位高、低剂量都能显著降低 SP在脑和脊髓中
的表达(P ＜0. 05)。提示紫金莲醇提物正丁醇部位和
乙酸乙酯部位皆能明显抑制模型大鼠脑和脊髓 c-fos
蛋白和 SP的表达，发挥中枢镇痛作用。见表 2。
表 1 紫金莲 2 种萃取部位对甲醛致痛模型大鼠行为学反应及其血清 Ca2 +，谷氨酸的影响(珋x ± s，n = 8)
Table 1 Impact of CW extraction part to pain behavior caused by formaldehyde and serum Ca2 +，glutamate in rats(珋x ± s，n = 8)
组别 剂量 /mg·kg －1 第 I相缩足数 /次 谷氨酸 /μmol·L －1 Ca2 +含量 /mmol·L －1
正常 － － 80． 2 ± 15． 0 0． 5 ± 0． 0
模型 － 34． 0 ± 10． 82) 295． 1 ± 12． 52) 1． 2 ± 0． 12)
CWZ乙酸乙酯部位 30 21． 7 ± 9． 6 185． 9 ± 15． 43) 1． 3 ± 0． 13)
15 17． 0 ± 6． 73) 176． 2 ± 10． 33) 1． 3 ± 0． 03)
CW正丁醇部位 15 22． 2 ± 10． 2 207． 1 ± 18． 8 1． 2 ± 0． 0
8 17． 6 ± 7． 33) 100． 9 ± 9． 13) 1． 3 ± 0． 03)
注:与正常组比较1)P ＜ 0. 05，2)P ＜ 0. 01;与模型组比较3)P ＜ 0. 05，4)P ＜ 0. 01 (表 2 同)。
表 2 紫金莲 2 种萃取部位对甲醛致痛模型大鼠 c-fos蛋白和 SP表达的影响(珋x ± s，n = 8)
Table 2 Impact of CW extraction part to expression of c-fos and SP caused by formaldehyde in pain model of rats(珋x ± s，n = 8)
组别 剂量 /mg·kg －1
c-fos阳性细胞数 /个 SP阳性细胞数 /个
脑 脊髓 脑 脊髓
正常 － － － － －
模型 － 51. 9 ± 3. 42) 27. 8 ± 5. 72) 31. 1 ± 3. 22) 24. 5 ± 6. 12)
CWZ乙酸乙酯部位 30 27. 9 ± 7. 73) 19. 5 ± 5. 33) 14. 1 ± 4. 53) 11. 3 ± 1. 83)
15 21. 6 ± 5. 43) 19. 6 ± 6. 43) 12. 3 ± 3. 63) 16. 6 ± 4. 13)
CW正丁醇部位 15 22. 8 ± 7. 93) 19. 3 ± 6. 23) 12. 0 ± 4. 13) 16. 3 ± 4. 83)
8 18. 5 ± 6. 13) 23. 9 ± 8. 5 11. 0 ± 2. 43) 16. 9 ± 3. 63)
4 讨论
疼痛是多种疾病的伴随症状，可造成器官组织
损害及功能障碍。组织损伤刺激是急慢性疼痛中最
常见的原因。民族药紫金莲是贵州少数民族常用来
治疗疼痛症的药物，以紫金莲为主药的通迪胶囊为
中药镇痛制剂，具有镇痛疗效好、没有依赖性、应用
范围广的特点［4］。但紫金莲的镇痛作用及机制未
见报道，本研究在前期紫金莲镇痛活性部位筛选的
基础上，针对大鼠甲醛致痛模型，初步探讨紫金莲活
性部位的镇痛作用机制。
由 Dubuisson等［5］创立的甲醛疼痛模型主要用
于鉴定中枢作用药物，其速发型应答反应所导致的
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疼痛行为，第Ⅰ时相为急性疼痛期，直接刺激神经末
梢初级疼痛感受器，由直接的化学刺激通过 Aδ 纤
维介导信息传入引起;第Ⅱ时相为强直期，是由逐渐
减弱的外周疼痛感受器传入刺激、局部组织不断活
化和释放炎性介质使中枢致敏所致［6］。本实验中
观察到甲醛致大鼠后足抽搐和抬腿等行为反应，具
有典型的两时相和间歇期。紫金莲 2 个活性部位在
低剂量时有明显的短时程中枢镇痛作用。谷氨酸参
与脊髓水平伤害性信息传递和痛觉过敏形成，阻碍
以谷氨酸为媒介的神经冲动传递，阻滞痛觉信号传
导，抑制痛觉中枢产生兴奋，起到中枢镇痛作用［7］。
紫金莲醇提物乙酸乙酯部位和正丁醇部位低剂量有
明显降低血清谷氨酸浓度作用。在痛觉调控中，通
过控制细胞外钙离子内流，产生钙拮抗作用，进而抑
制神经冲动传导，使痛觉感受器不能兴奋而发挥镇
痛作用［2］。紫金莲醇提物乙酸乙酯部位低剂量和
正丁醇部位低剂量能显著升高血清 Ca2 +含量，减少
细胞外 Ca2 +内流。其对大鼠甲醛致足痛的镇痛机
制可能与与降低血清谷氨酸浓度和拮抗 Ca2 +内流
作用有关。
c-fos原癌基因是刺激作用下最早的反应基因，
正常情况下细胞内 c-fos很少表达，外周伤害性刺激
可诱导中枢系统 c-fos 基因表达 fos 蛋白，是疼痛在
分子水平的标志，特别是在脊髓中的表达已作为疼
痛的一项客观指标，其在中枢神经系统内的表达与
痛觉调控密切相关［2，8］。实验证实紫金莲醇提物乙
酸乙酯及正丁醇部位的高剂量能明显降低甲醛致痛
模型大鼠 c-fos蛋白在脊髓中的表达，而其低剂量则
在降低脑中 c-fos蛋白表达较为明显。SP 广泛分布
于中枢、外周神经系统的初级传入神经纤维内，在脊
髓水平参与痛觉调控，大剂量 SP可直接兴奋感觉神
经元，导致持久性疼痛和痛觉过敏［9］。同时在 SP
的作用下，脊髓星形胶质细胞的 c-fos表达明显。实
验证实紫金莲醇提物乙酸乙酸和正丁醇部位各剂
量，均能明显降低甲醛致痛模型大鼠脑和脊髓中 P
物质的表达。因此提示紫金莲的镇痛作用机制可能
与降低中枢神经系统 c-fos蛋白和 P物质表达有关。
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［责任编辑 聂淑琴］
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