全 文 ：收稿日期:2008-05-23;　修订日期:2008-11-09
基金项目:内蒙古医学院蒙药现代化研究重大项目(No.MX2005ZB010)
作者简介:常福厚(1962-),男(汉族),内蒙古四子王旗人 ,现任内蒙古医
学院药学院药理教研室教授 ,博士学位,主要从事生化与分子药理学研究
工作.
高效液相色谱法测定紫花高乌头中乌头碱的含量
常福厚 , 韩瑞兰 , 齐　君 , 范　蕾 , 王敏杰 , 尹　琴
(内蒙古医学院 ·药学院 ,内蒙古 呼和浩特　010059)
摘要:目的 测定紫花高乌头中乌头碱的含量 ,为蒙药紫花高乌头中乌头碱的含量提供检测方法 , 制定质控标准。方法
采用高效液相色谱法 , Kromasil(250 mm×4.6 mm, 5μm)色谱柱 , 甲醇-水-三乙胺 (71∶29∶0.1)为流动相 , 流速为 1.0
ml/min;检测波长 235 nm。结果 乌头碱浓度在 29.85 ～ 149.25 μg/ml范围之间与峰面积线性关系良好 , r=0.999 7。乌
头碱平均回收率为 96.52%, RSD=1.19%。结论 采用高效液相色谱法测定紫花高乌头中乌头碱的含量 ,具有分离效果
好 、简便 、结果准确等优点。
关键词:紫花高乌头;　乌头碱;　高效液相色谱法
中图分类号:R284.2;R291.2　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2009)05-1164-01
　　紫花高乌头为毛茛科植物紫花高乌头 Aconitumexcelsum
Rrichb.的全草 , 蒙药名为宝日 -泵嘎 , 收载于 《中华医学百科全
书》(蒙医分卷)《认药白晶鉴》《无误蒙药鉴》中 ,具有止咳 、清肺
之功效 , 主治流感 、肺感 、肺热 、瘟疫等作用 [ 1] , 其中乌头碱既是
其有效成分 , 也是其毒性成分。 《中国药典》 [ 2]采用比色法检查
乌头碱的含量 , 而本研究建立了以高效液相色谱测定紫花高乌头
中乌头碱含量的方法 ,以控制蒙药材紫花高乌头的质量。
1　器材
1.1　仪器 依利特 UV-230 +高效液相色谱仪(大连依利特分
析仪器有限公司):UV-230 +紫外 -可见检测器 、P230/P230p
高压恒流泵 、EC2000色谱工作站。
1.2　材料 紫花高乌头采自内蒙古赤峰市克什克腾旗大局子林
场 、赤峰市克什克腾旗红山子乡 、赤峰市宁城县 ,经内蒙古医学院
药学院生药学教研室庞秀生教授鉴定为毛茛科植物紫花高乌头
AconitumexcelsumRrichb.的全草。 方法学考察中均采用赤峰市
克什克腾旗大局子林场所采集到的样品。乌头碱对照品(中国
药品生物制品检定所提供 , 批号 110720 -200308);甲醇为色谱
纯 , 磷酸 、盐酸等试剂均为分析纯 ,水为双蒸水。
2　方法与结果
2.1　色谱条件 色谱柱为 Kromasil(250 mm×4.6 mm, 5 μm),
流动相为甲醇-水-三乙胺 (71∶29∶0.1);流速为 1.0ml/min;检
测波长 235nm;进样量 20μl。以此条件 ,乌头碱能与其它成分达
到较好分离效果。结果见图 1 ～ 2。
2.2　对照品溶液的配制 取乌头碱对照品 5.9 mg, 精密称定 ,置
10 ml容量瓶中 , 然后加甲醇至刻度 , 摇匀 , 即得(每毫升中含乌
头碱 0.597 mg)。
2.3　供试品溶液的制备 取本品 10 g, 过 60目筛 , 精密称定 ,加
氨试液 4 ml,苯 50ml, 超声 30 min,用酸水(2%盐酸)萃取两次 ,
20 ml/次 , 酸水调 pH值为 9, 用氯仿萃取 2次 , 20 ml/次 , 合并氯
仿液 , 低温减压挥干 , 残渣用甲醇溶解 , 定容至 10 ml容量瓶中 ,
摇匀 , 即得。
2.4　标准曲线的制备 精密吸取 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 ml对照
品溶液分别置于 10 ml容量瓶中 , 加甲醇至刻度 , 摇匀。 分别吸
取 20μl注入高效液相色谱仪 , 记录峰面积。以对照品溶液浓度
为横坐标 , 对照品峰面积为纵坐标 ,进行线性回归 ,标准线性回归
方程为 Y=18.269X-25.583, r=0.999 7。实验表明 , 乌头碱浓
度在 29.85 ～ 149.25 μg/ml范围内呈良好的线性关系。
2.5　精密度实验 取供试品溶液 , 重复进样 5次 , 记录峰面积并
计算 , 结果乌头碱的平均含量为 0.069 5 mg/g, RSD为 0.86%。
图 1　乌头碱对照品 HPLC图谱
图 2　紫花高乌头 HPLC图谱
2.6　稳定性实验 取紫花高乌头供试品溶液在 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9
h分别进样 20μl,记录峰面积 , 结果 RSD为 1.43%,表明乌头碱
在 9 h内保持稳定。
2.7　重复性实验 取赤峰市克什克腾旗大局子林场供试品 5份 ,
各约 1 g, 精密称定 ,分别按样品提取方法提取 、测定 ,结果乌头碱
品均含量为 0.067 1 mg/g, RSD为 1.78%。
2.8　加样回收率实验 取赤峰市克什克腾旗大局子林场供试品
5份 , 各约 5 g, 精密称定 , 分别加入乌头碱标准品溶液(0.351
mg/ml)1 ml,按供试品溶液的方法处理并测定含量 ,计算加样回
收率。结果见表 1。乌头碱平均回收率为 96.52%, RSD为
1.19%。结果表明本方法准确可靠。
表 1　样品中乌头碱含量加样回收实验结果
取样量
/g
样品中含量
/mg
加入量
/mg
实测含量
/mg
回收率
(%)
平均回收
率(%)
RSD
(%)
4.955 0.347 0.351 0.675 96.01
5.072 0.362 0.351 0.701 96.58
5.063 0.341 0.351 0.694 98.29 96.52 1.19
5.068 0.354 0.351 0.688 95.16
5.037 0.350 0.351 0.683 96.58
2.9　样品含量测定 取 3个批次的样品各两份 ,每份约 10 g, 精
密称定 ,按 “ 2.3”项下操作 , 取 20 μl注入高效色谱仪 ,以色谱条
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 5期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.5
件测定 , 计算乌头碱的含量。结果见表 2。
表 2　样品含量测定结果 mg· g-1
供试品来源 含量
1 2
平均
含量
赤峰市克什克腾旗大局子林场 0.064 0.064 0.064
赤峰市克什克腾旗红山子乡 0.074 0.070 0.072
赤峰市宁城县 0.069 0.072 0.071
3　讨论
中药成分的提取多采用冷浸渗流法 、煎煮法 、有机溶剂加热
回流提取法 , 但提取的效果不尽相同。曾采用苯加氨试液浸泡 ,
放置过夜的方法 , 对紫花高乌头进行提取 , 但效果不甚理想。本
实验采用在碱性条件下用苯超声提取 ,提取液滤过后低温减压挥
干。残渣加甲醇溶解后进行色谱分析的方法 ,本法与上述其它方
法比较提取较完全 ,而且操作简便。同时 , 采用超声提取即防止
成分遇热易分解 ,又大大提高了提取效率。有作者曾对紫花高乌
头根中的二萜生物碱进行了提取与鉴定 [ 3, 4] ,而采用高效液相色
谱法对紫花高乌头中的乌头碱进行测定 ,尚未见报道。本研究同
时建立了蒙药材紫花高乌头的质量控制标准。实验结果显示 , 采
用高效液相色谱法测定乌头碱的含量 ,结果准确 , 重复性好 ,为蒙
医药的临床应用提供了更为有效的检测方法。
参考文献:
[ 1 ] 　王　晋 ,乔俊缠 ,任常胜 ,等.蒙药紫花高乌头微量元素的含量测定
[ J] .中国民族医药杂志, 2001, 7(3):34.
[ 2 ] 　国家药典委员会.中国药典 , Ⅰ 部 [ S] .北京:化学工业出版社 ,
2005:189.
[ 3 ] 　张树祥 ,贾世山.蒙药紫花高乌头根中二萜生物碱的分离与鉴定
[ J] .中草药 , 1999, 30(9):641.
[ 4 ] 　张树祥 ,贾世山.蒙药紫花高乌头根中新二萜生物碱的分离和鉴
定 [ J] .药学学报 , 1999, 34(10):762.
收稿日期:2008-04-30;　修订日期:2008-07-30　
基金项目:浙江中医药大学学生科研基金资助项目(No.2008A05)
作者简介:冯蓉洁(1986-),女(汉族),浙江宁波人 ,现为浙江中医药大学
药学院学生 ,主要从事新药产品开发研究工作.
＊通讯作者简介:吴巧凤(1963-),女(汉族),浙江浦江人 ,现任浙江中医药
大学教授,硕士研究生导师,学士学位,主要从事天然产物研究与开发工作.
紫苏提取物抗氧化活性及酚性成分的研究
冯蓉洁 , 吕佩惠 , 盛振华 , 吴巧凤＊
(浙江中医药大学药学院 ,浙江 杭州　310053)
摘要:目的 研究紫苏体外抗氧化活性。方法 在测定紫苏各酚性成分含量基础上 , 采用体外抗氧化实验 ,研究其 DPPH
清除能力 、总还原力和抗脂质体氧化能力。结果 75%乙醇和 50%丙酮提取物具有良好的抗氧化活性;紫苏提取物中总
黄酮 、原花色素含量与其抗氧化能力之间呈正相关。结论 紫苏有显著的抗氧化活性 , 呈一定的量 -效关系。其抗氧化
活性可能与黄酮类化合物有关。紫苏提取物可作为一种良好的天然抗氧化剂应用于临床。
关键词:紫苏;　总黄酮;　原花色素;　抗氧化活性
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2009)05-1165-03
　　紫苏为唇形科紫苏属 Perillafrutescens(L.)Britt.一年生草
本植物 , 是传统的药食两用中药 , 在江浙各地均有种植 , 资源丰
富 , 价格低廉。其主要含有紫苏苷 、原花色素 、紫苏素 、木犀草素
和芹黄素等多酚类化合物 , 具有抗炎 、镇痛 、抗衰老 、清除和抑制
自由基等作用 [ 1] 。有研究表明 , 紫苏叶中含有丰富的黄酮类化
合物 , 具有清除自由基 、抗衰老作用;紫苏的水溶性色素亦具有一
定的抗氧化活性 [ 2 ～ 3] 。目前国内外研究主要集中在紫苏籽挥发
油成分上 , 对紫苏尤其是紫苏的酚性成分研究较少。本文通过体
外抗氧化实验 , 确定紫苏有效部位抗氧化活性及酚性成分组成 ,
为其临床应用及各种成分的抗氧化药理作用研究提供理论依据。
1　仪器及试剂
1.1　仪器 BS224S精密电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限
公司), TU-1900双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪
器有限公司), KQ-250DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器
有限公司)。
1.2　试剂和材料 紫苏采自浙江杭州 , 经浙江中医药大学资源鉴
定教研室姚振生教授鉴定为唇形科紫苏属植物 Perilafrutescens
(L.)Britt.,粉碎后过 40目筛。芦丁(批号 100080-20030)、儿
茶素(批号 877-200001)、没食子酸(批号 110831 -200302),均
购自中国药品生物制品检定所;大豆卵磷脂(批号 2075523)、DP-
PH(批号 095K1452), 均购自 sigma公司。其他试剂均为分析纯。
2　方法与结果
2.1　供试品溶液的制备 取 5 g紫苏药材粉末 ,分别按表 1加入
20倍量提取溶剂 , 70℃水浴提取 2次 , 1 h/次 , 合并滤液 , 浓缩至
干 , 临用前配成所需浓度 , 作为供试品溶液。
2.2　紫苏酚性物质的含量测定 [ 4 ～ 6] 采用 FeCl3 -K3Fe(CN)6比
色法 , 以没食子酸为标样制作标准曲线 , 测定紫苏中总酚酸含量;
采用香草醛 /硫酸比色法 , 以儿茶素为标样制作标准曲线 ,测定其
原花色素含量;采用碱式铝盐比色法 ,以芦丁为标样制作标准曲
线 , 测定其总黄酮含量。
2.3　抗氧化活性实验 [ 7 ～ 9]
2.3.1　清除自由基活力 取提取物适量 , 加入 25 μg/ml的 DPPH
甲醇溶液 3.5 ml, 快速混匀 , 30 min后测定在 516 nm处的吸光
度。计算 DPPH清除 率:清除率 (%)=(1 - [ DPPH] t/[ DPPH] t=0)×100%。
其中 [ DPPH] t表示 30 min时体系的吸光度;[ DPPH] t=0表
示 0时刻体系的吸光度。
2.3.2　还原力测定 取提取物适量 , 加入磷酸缓冲液(0.2 mol/
L, pH6.6)2.5 ml及 1%铁氰化钾溶液 1.5 ml, 50℃保温 20 min
后 , 加入 10%三氯乙酸 1.5ml, 混匀后取 2.5ml, 加入蒸馏水 2.5
ml及 0.1%三氯化铁 0.3 ml。在 700 nm处测定反应液吸光度
值。吸光度值越大 ,表示还原力越强。
2.3.3　脂质体氧化法 将大豆卵磷脂分散于去离子水中 , 20 kHz
超声波处理 30min,周围以冰水冷却 , 制得大豆磷脂浓度为 0.8%
的人工脂质体。取 20 ml脂质体 ,加入提取物 ,以 10mmol乙酸铜
20 μl催化氧化反应 ,混匀后放置于回转式恒温水浴振荡器上 , 于
暗处 37℃、100 r/min进行开口氧化实验 ,每隔一定时间测定共轭
二烯氢过氧化物及丙二醛生成量。
共轭二烯氢过氧化物(CD)的测定:取 1 ml氧化液 , 溶于 3
ml甲醇 ,于 234nm处测定其吸光度 , 以摩尔消光系数 ε=26 000
L· mol-1· cm-1计算脂质体体系中共轭二烯氢过氧化物的生成
量(mmol/kg卵磷脂)。
丙二醛(MDA)的测定:取 1.5 ml氧化液 , 加入 1 mlMDA溶
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.5 时珍国医国药 2009年第 20卷第 5期