全 文 ：Caspase － 3 参与白花败酱草皂苷诱导 Hela细胞凋亡
张 涛 田黎明 朱贵明 任继秋 张 宇 田丽华 (佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)
〔摘 要〕 目的 研究白花败酱草总皂苷对人宫颈癌 Hela细胞的抑制作用及其机制。方法 采用 MTT法观察白花败酱草水提液和总皂苷对
Hela细胞生长增殖的抑制作用;光镜和透射电镜观察总皂苷和水提物诱导 Hela细胞发生凋亡的情况;观察总皂苷和水提物对 Hela细胞半胱天冬酶
(Caspase-3)活性的影响。结果 白花败酱草总皂苷在体外剂量依赖性地抑制 Hela细胞的增殖，诱导细胞的凋亡，并通过对凋亡关键酶 Caspase-3 的
激活，实现其促进 Hela细胞凋亡的作用，达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。结论 Caspase-3 参与白花败酱草皂苷诱导 Hela细胞凋亡的作用。
〔关键词〕 白花败酱草;皂苷;细胞凋亡;Caspase-3
〔中图分类号〕 R737. 33 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202(2012)11-2321-03;doi:10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2012. 11. 050
基金项目:黑龙江省自然科学基金项目(No. D2007-77)
通讯作者:田黎明(1962-) ，男，硕士，教授，主要从事药物抗肿瘤研究。
第一作者:张 涛(1964-) ，女，博士，教授，主要从事植物药抗衰老与抗
肿瘤研究。
白花败酱草是败酱科草本植物的根茎及带根全草，在中国
的华东、华中、华南及西南各地均有分布，是一种常用植物药。
白花败酱草具有清热利湿、解毒排脓、活血化瘀、清心安神、改
善肝功能、抑菌和抗病毒等作用。关于黄花败酱体内抗肿瘤，
体外诱导人乳腺癌(MCF-7)细胞凋亡的作用曾有报道〔1〕，但白
花败酱草及其总皂苷在抗肿瘤方面的作用，较少报道〔2〕。
1 材料与方法
1. 1 细胞株与主要试剂 人宫颈癌 Hela 细胞株由哈尔滨医
科大学微生物教研室赠送;RPMI-1640 干粉培养基(美国 Gibco
公司) ;新生牛血清(杭州四季青公司) ;AB8 大孔吸附树脂购
于天津南开大学化工厂。
1. 2 方法
1. 2. 1 实验药材与处理 白花败酱草购于秦皇岛市民乐医药
公司，由安国市昌达中药材饮片有限公司提供。
1. 2. 1. 1 白花败酱草水提物的制备〔3〕 白花败酱草粉碎后加
适量水，浸泡 3 h，煮沸提取 60 min，收集药液，经旋转蒸发仪
50℃减压回收得白花败酱草水提液，真空干燥箱 55℃干燥，得
败酱草水提物固体干粉。
1. 2. 1. 2 白花败酱草总皂苷的制备 取干燥的白花败酱草
4 kg，粉碎，按 1∶ 10 用 70%食用酒精浸泡 4 h，加热回流提取 2
次，合并滤液减压回收乙醇，得白花败酱草乙醇粗提物。此粗
提物加入石油醚脱脂，用 AB8 大孔吸附树脂层析分离总皂苷。
白花败酱草醇提物上层析柱后用蒸馏水洗脱至洗脱液中无糖
为止(Molish反应阴性)。再分别用 30%、50%和 70%乙醇洗
脱，收集洗脱液，至各洗脱液 Liberman-Burchard反应阴性为止。
洗脱液减压回收乙醇，真空干燥得淡黄色粗提物，终重量为
25. 2 g，白花败酱草总皂苷的提取率约为 0. 63%。皂苷鉴定 ∶
取少量干燥提取物，与浓硫酸-醋酐(1∶ 20)反应显蓝绿色，证明
提取物为甾体皂苷〔3〕。
1. 2. 2 细胞培养 Hela 细胞培养于含 10% 新生牛血清的
RPMI-1640培养液，置于 37℃，50 ml /L CO2、饱和湿度恒温培养
箱中孵育，每 2 ～ 3 d传代。
1. 2. 3 指标检测
1. 2. 3. 1 噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖抑制作用 水提物终
浓度分别为 0. 20，0. 40，0. 80，1. 20 mg /ml;皂苷终浓度分别为
0. 05，0. 10，0. 15，0. 20 mg /ml。另设未加药物只加细胞的对照
组，每个浓度设三个复孔，诱导 48 h。细胞生长抑制率 =(1 －
实验组平均 OD值 /对照组平均 OD 值)× 100%。根据各组药
物对细胞的抑制率，运用 SPSS10. 0 软件计算出药物半数抑制
浓度(IC50)。
1. 2. 3. 2 光镜观察 Hela 细胞凋亡的形态学特征 皂苷
0. 15 mg /ml，水提物 1. 20 mg /ml，阴性对照组培养 48 h后，磷酸
盐缓冲液(PBS)漂洗，4%多聚甲醛固定，4℃过夜。苏木素-伊
红(H-E)染色，光镜观察拍照。
1. 2. 3. 3 电镜观察 Hela 细胞超微结构的变化 用皂苷
0. 15 mg /ml处理 Hela细胞 48 h和 72 h后，树脂包埋，烘烤 24 h
固化成硬块，切成超薄切片(50 nm) ，醋酸铀-枸橼酸铅双重染
色后，透射电镜观察细胞超微结构。
1. 2. 3. 4 Hela 细胞 Caspase-3 活性的检测 皂苷终浓度为
0. 15、0. 20 mg /ml，水提物终浓度为 0. 80、1. 20 mg /ml，每个浓
度设 3 个复孔，同时设阴性对照，按试剂盒说明书操作，酶标仪
测定 OD405值，通过计算 OD 给药组 /OD 阴性对照的倍数来确
定各组 Caspase-3 的活化程度。
1. 3 统计学方法 应用 SAS9. 13 软件分析，实验数据以 x ± s
表示，组间差异的显著性先方差分析，再采用 Dunnett检验。
2 结 果
2. 1 白花败酱草皂苷和水提物对 Hela 细胞生长的抑制作用
总皂苷和水提取物的 IC50 值分别是 59. 2 μg /ml 和
199. 9 μg /ml。根据美国国家癌症中心(NCI)标准:IC50 ≤
230 μg /ml可作为抗肿瘤药物，说明白花败酱草总皂苷和水提
物对 Hela细胞有明显的细胞毒作用。见表 1，表 2。
2. 2 白花败酱草总皂苷诱导 Hela细胞的形态学变化
2. 2. 1 HE染色光镜观察结果 光镜下可见对照组的 Hela 细
·1232·张 涛等 Caspase-3 参与白花败酱草皂苷诱导 Hela细胞凋亡的实验研究 第 11 期
胞生长良好，细胞呈多边形，细胞质多，胞核染色质疏松，染色
较淡;皂苷 0. 15 mg /ml 及水提物 1. 20 mg /ml 诱导 Hela 细胞
48 h后，细胞生长受到不同程度的抑制，出现胞体变圆，胞质起
泡，染色质凝集深染等。见图 1。
表 1 白花败酱草总皂苷对 Hela细胞生长的抑制作用
组别 浓度(mg /ml) OD值(x ± s) 抑制率(%)
对照组 0 0. 897 ± 0. 016
皂苷组 0. 05 0. 556 ± 0. 0261) 42. 95
0. 10 0. 352 ± 0. 0411) 68. 63
0. 15 0. 219 ± 0. 0151) 85. 39
0. 20 0. 208 ± 0. 0321) 86. 78
与对照组比较:1)P ＜ 0. 01
表 2 白花败酱草水提物对 Hela细胞生长的抑制作用
组别 浓度(mg /ml) OD值(x ± s) 抑制率(%)
对照组 0 0. 703 ± 0. 036
水提物组 0. 20 0. 608 ± 0. 0321) 15. 83
0. 40 0. 451 ± 0. 0282) 42. 00
0. 80 0. 335 ± 0. 0412) 61. 33
1. 20 0. 368 ± 0. 0272) 55. 83
与对照组比较:1)P ＜ 0. 05，2)P ＜ 0. 01
图 1 HE染色光镜观察结果(×100)
2. 2. 2 电镜观察结果 电镜下可见对照组 Hela 细胞膜表面
有较多微绒毛，染色质疏松，核仁明显。皂苷 0. 15 mg /ml 诱导
Hela细胞 48 h和 72 h后，可见细胞变小，细胞膜表面微绒毛消
失，出现早期细胞凋亡的染色体边集，细胞质中空泡化明显，可
见含致密染色质和细胞膜的凋亡小体。见图 2 。
图 2 电镜观察 Hela细胞形态(TME，×6 000)
2. 3 败酱草皂苷和水提物对 Hela细胞 Caspase-3 活性的影响
用白花败酱草总皂苷和水提物诱导 Hela 细胞 48 h 后，各诱
导组 Caspase-3 活性比对照 组 均 有 显 著 增 高，总 皂 苷
0. 15 mg /ml和水提物 1. 2 mg /ml 激活 Caspase-3 活性分别是对
照组的 3. 70 和 2. 42 倍。见表 3，表 4。
表 3 败酱草总皂苷对 Hela细胞 Caspase-3 活性的影响
组别 浓度(mg /ml) OD值(x ± s) OD皂苷组 /OD对照组
对照组 0 0. 207 ± 0. 052 －
皂苷组 0. 15 0. 765 ± 0. 0611) 3. 70
0. 20 0. 639 ± 0. 0581) 3. 64
与对照细比较:(1)P ＜ 0. 01;下表同
表 4 败酱草水提物对 Hela细胞 Caspase-3 活性的影响
组别 浓度(μg /ml) OD值(x ± s) OD水提组 /OD对照组
对照组 0 0. 207 ± 0. 052 －
水提物组 120 0. 501 ± 0. 0461) 2. 42
160 0. 336 ± 0. 0381) 1. 62
3 讨 论
有研究表明多种皂苷具有明显的抗肿瘤活性〔4，5〕，本实验
白花败酱草总皂苷和水提物对 Hela细胞生长均有明显的抑制
作用，表明 Hela细胞对白花败酱草皂苷的抑制作用敏感，初步
确定皂苷是白花败酱草有效的抗肿瘤活性成分。
诱导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤治疗的新靶点。细胞凋亡
时具有典型的形态和生化特征〔6〕。细胞凋亡受多种基因调控，
并与 Caspases家 族 和 Bcl-2 家 族 密 切相关〔7〕。Caspases 为
半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶的简称，是一组具有相似氨基酸顺
序和二级结构的半胱氨酸蛋白酶，参与细胞因子成熟、细胞生
长和分化，还与细胞凋亡密切相关。Caspases 级联反应在凋亡
通路中处于重要地位，尤其 Caspase-3 是其中的中心环节，
Caspase-3 被认为是细胞凋亡过程中最关键的效应蛋白酶，而
Caspase-3 催化一些底物的降解是导致染色质浓缩的关键步
骤〔8〕。本实验表明白花败酱草总皂苷通过诱导 Hela 细胞的凋
亡，达到其抑制肿瘤细胞生长和增殖的作用;白花败酱草总皂
苷和水提物诱导 Hela 细胞凋亡的同时，各诱导组细胞中
Caspase-3 活性也比对照组明显增高，说明 Caspase-3 参与白花
败酱草皂苷诱导 Hela 细胞凋亡的作用，有关白花败酱草皂苷
诱导肿瘤细胞凋亡是否通过线粒体或内质网途径，尚待进一步
研究。
4 参考文献
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〔2012-01-05 收稿 2012-02-28 修回〕
(编辑 袁左鸣)
益气活血法改善缺血性脑卒中急性期大鼠微循环障碍的机制
邱 乐 王新生 刘 擎1 (解放军 458 医院，广东 广州 510602)
〔摘 要〕 目的 探讨内皮素(ET)、5-羟色胺(5-HT)、D-D 二聚体(D-Dimer)、血栓烷素 A2(TXA2)、前列环素 I2(PGI2)、热休克蛋白 70
(HSP70)mRNA在缺血性脑卒中急性期(AIS)微循环障碍中的作用机制。方法 选用健康老年 SD大鼠，采用多因素复合方法复制气虚血瘀证动物
模型，颈总动脉结扎并改良线栓法复制脑缺血动物模型。将 60 只 SD大鼠随机取 15 只做假手术组;余行 AIS模型制备，术后 45 只随机取 15 只做模
型组，余 30 只为治疗组。治疗组予腹腔注射黄芪注射液及灯盏细辛注射液，假手术组与模型组腹腔注射等量生理盐水;每日 1 次，疗程 4 d。各组大
鼠均于治疗前、治疗后 0、12、24、48、72、96 h作大鼠神经功能 ZeaLonga评分，并于治疗前后检测 ET、5-HT、D-Dimer、TXA2、PGI2、HSP70 mRNA 水平。
结果 治疗组 24、48、72、96 h ZeaLonga评分与模型组同一时点评分差异有统计学意义(P ＜ 0. 05)。模型组治疗后的 5-HT、TXA2、HSP70 mRNA水平
与治疗前比较差异均有统计学意义(P ＜ 0. 05) ，治疗组治疗后的各指标水平与治疗前比较差异均有统计学意义(P ＜ 0. 05) ;治疗后治疗组的 ET、D-
Dimer、TXA2、HSP70 mRNA水平与模型组比较差异均有统计学意义(P ＜ 0. 05) ，治疗后治疗组 D-Dimer 水平与假手术组的差异无统计学意义(P ＞
0. 05)。结论 益气活血法能够改善 AIS的整体神经功能评分;ET、5-HT、D-Dimer、TXA2、PGI2、HSP70 mRNA高表达是 AIS微循环障碍的重要机制与
指标。益气活血法能够通过调整各微循环指标的表达，尤其下调 D-Dimer的高表达，改善 AIS微循环，并促进整体神经功能的恢复。
〔关键词〕 缺血性脑卒中急性期;大鼠;益气活血法;微循环
〔中图分类号〕 R743 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202(2012)11-2323-03;doi:10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2012. 11. 051
1 广州中医药大学
通讯作者:刘 擎(1986-) ，男，在读博士，主要从事脑血管疾病研究。
第一作者:邱 乐(1974-) ，女，主治医师，主要从事老年病研究。
中风分为出血性中风和缺血性中风。在我国，约 85%的缺
血性中风急性发作(acute ischemic stroke，AIS)具有发病率高、
死亡率高、致残率高、复发率高以及并发症多的特点。有研究
表明 AIS患者气虚血瘀证达 73%，故益气活血法是 AIS的重要
治疗方法，尤以黄芪注射液和灯盏细辛注射液为临床常用药
物。本研究通过复制 AIS大鼠模型，研究黄芪注射液和灯盏细
辛注射液对改善 AIS大鼠微循环的作用机制，为指导 AIS 的临
床治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1. 1 材料 健康老年 SD 大鼠 60 只，体质量(270 ± 30)g(广
州中医药大学实验动物中心提供)。治疗用药:①黄芪注射液
〔10 ml /支(相当于原药材 20 g) ，国药准字 Z33020179，正大青
春宝药业有限公司〕;②灯盏细辛注射液(10 ml /支，国药准字
Z53021569，云南生物谷灯盏花药业有限公司)。
1. 2 方法
1. 2. 1 动物分组 将 60 只 SD大鼠随机取 15 只做假手术组;
余行 AIS模型制备，术后 45 只随机取 15 只做模型组，余 30 只
为治疗组。
1. 2. 2 模型制作 采用多因素复合方法复制气虚血瘀证动物
模型，颈总动脉结扎并改良线栓法复制脑缺血动物模型。
1. 2. 2. 1 气虚血瘀模型 参照文献〔1〕，采用饥饿、冷水疲劳游
泳结合高脂饮食的方法造模。①饥饿:先测得大鼠正常饮食
量，仅按正常饮食量 60%喂养。②冷水疲劳游泳:将大鼠每日
于水温(10 ± 0. 2)℃、深 30 cm 水桶中，棒打促使其持续游泳，
至疲劳开始下沉时捞出，自然风干，不采取保暖措施。③高脂
饮食:上述步骤处理后，再予脂肪乳灌胃，剂量按大鼠体重系数
折算，予 10 ml /kg灌胃，1 次 /d。以上方法持续 7 d。造模成功
标准:精神萎靡，倦怠嗜睡，毛发无光泽或结穗或稀疏脱落，稀
便，舌淡或紫暗，眼球暗红，四肢或尾部出现瘀点瘀斑等。
1. 2. 2. 2 大鼠局灶性脑梗死模型 参照文献〔2，3〕，采用颈总动
脉结扎并改良线栓法造模。所有造模大鼠术前均禁食 1 d，予腹
腔内注射 20%乌拉坦(900 mg /kg)麻醉，仰卧位固定大鼠，颈部
常规备皮消毒后，沿颈部正中切开，钝性分离胸锁乳突肌与胸骨
舌骨肌，暴露并分离右侧颈总动脉与迷走神经，于近颈内外动脉
分叉处结扎颈外动脉。夹闭颈总动脉、颈内动脉。近颈总动脉
分叉约 5 mm处针刺破入并将栓线插入颈总动脉，松开微动脉
夹，将插线插入颈内动脉，进线深度(19 ± 0. 5)mm。将栓线与颈
总动脉结扎固定，消毒术区，缝合筋膜、皮肤。外用甲硝唑粉预
防感染。假手术组除不插栓线外，其余手术步骤同模型组。造
模成功的标准:苏醒后左上肢屈曲，行走时向左侧旋转或左侧肢
体瘫痪，或伴右侧 Horner征。不符合标准的动物剔除。
·3232·邱 乐等 益气活血法改善缺血性脑卒中急性期大鼠微循环障碍的机制 第 11 期