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高效液相色谱法测定濒危野生中华补血草中槲皮素和木犀草素的含量



全 文 :[3] 袁恒杰.丹参素药理作用研究新进展[J].中国医院药学杂志,
2006,26(5):604-606.
[4] 肖衍宇,陈志鹏,平其能,等.磷酸川芎嗪理化性质及生物学
性质的考察[J].中国医院药学杂志,2009,29(21):1810-
1814.
[5] 夏祖猛,王利胜,赖宝林,等.芎冰微乳在新西兰兔体内的药
动学研究[J].中国实验方剂学杂志,2011,11(17):119-121.
[6] 晏亦林,刘宏伟,周莉玲,等.磷酸川芎嗪鼻用pH敏感型原位
凝胶大鼠血液和脑部药动学研究[J].中国药学杂志,2012,
47(2):119-122.
[7] 罗红梅,马云淑,黄金娥,等.丁香等3种挥发油对磷酸川芎嗪
贴剂的促渗作用[J].中国医院药学杂志,2013,33(13):
1032-35.
[8] 李纪伟,信艳艳.丹参素川芎嗪注射液的临床应用研究[J].
哈尔滨医药,2011,31(2):133-135.
[9] 文九芳,张先平,赵业清.丹参素川芎嗪注射液治疗脑梗死的
Meta分析[J].现代中西医结合杂志,2012,21(10):1043-
1045.
[10]殷令,尹新洁.丹参川芎嗪治疗急性脑梗死的临床观察[J].中
国医院药学杂志,2008,28(19):1703-1704.
[11]江骥,胡蓓,李晓明,等.人体内川芎嗪药代动力学参数的稳
定同位素法测定[J].中国药学杂志,1994,29(7):416-418.
[12]黄鹏,李新华,张红,等.磷酸川芎嗪滴丸在健康人体的药代
动力学和生物等效性[J].中国临床药理学杂志,2005,21
(6):445-448.
[13]PengWang,Xin Jin,Meiling Qi,et al.Liquid chromatogra-
phy-mass spectrometry method for determination of tetram-
ethylpyrazine and its metabolite in dog plasma[J].Journal of
Chromatography B,2004,(813):263-268.
[14]任平,黄熙,张莉,等.麻醉犬心房内注射复方川芎汤后血清
中川芎嗪药时曲线双峰与血流动力学效应的关系[J].第四军
医大学学报,2000,21(7):157-160.
[15]李孝栋,李素云,张丽红,等.吸光度-波长曲线下面积和药物
浓度的线性关系及其在中药药动学中的应用[J].福建中医药
大学学报,2012,22(6):26-30.
[16]况晓东,李新华,熊玉卿.川芎嗪在大鼠肝微粒体系统中的代
谢研究[J].中国中药杂志,2006,31(23):1971-1975.
[17]肖衍宇,陈志鹏,平其能,等.冰片对川芎嗪促吸收作用的研
究[J].药学学报,2009,44(8):915-921.
[18]刘晓磊,唐靖,宋娟,等.川芎嗪对大鼠灌服环孢素A药代动
力学的影响[J].药学学报,2006,41(9):882-887.
[收稿日期]2013-02-28
[基金项目]国家自然科学基金项目(编号:81102817);江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室项目(编号:JLCBE09021);盐城师范
学院自然科学基金项目(编号:09YCKL010);盐城师范学院博士科研启动基金资助项目 [作者简介]喻樊,男,博士,讲师,研究方向:药剂学
与分析,电话:86-515-88258773,E-mail:pharmyufan@163.com
高效液相色谱法测定濒危野生中华补血草中槲皮素和木犀草素的含量
喻樊1,2,汤新慧2,杨小兰1  (1.江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室,江苏 盐城224002;2.药学院,盐城师
范学院,江苏 盐城224051)
[摘要] 目的:建立 HPLC法测定濒危野生药用植物中华补血草中槲皮素和木犀草素含量的方法,为中华补血草的质量控制
提供理论依据。方法:采用高效液相色谱法同时测定中华补血草中槲皮素和木犀草素的含量。色谱柱:TURNER Kromasil TM
C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇:0.2%磷酸溶液(55∶45)进行等度洗脱,流速为1 ml·min
-1,检测波长为360
nm。结果:槲皮素在浓度0.92~92μg·ml
-1范围内有良好的线形关系,相关系数r为0.999 6,平均加样回收率为98.87%,
RSD为1.68%(n=6)。木犀草素在0.412~41.2μg·ml
-1范围内有良好的线形关系,相关系数r为0.999 8,平均加样回收率
为99.33%,RSD为1.89%(n=6)。结论:方法简便可行、灵敏准确,可作为我国沿海野生中华补血草质量评价的方法之一,该
研究对于保存中华补血草野生品种相关资料,具有重要意义。
[关键词] 中华补血草;槲皮素;木犀草素;黄酮;高效液相色谱法
[中图分类号]R927.2 [文献标识码]A [文章编号]1001-5213(2014)02-0102-04 DOI:10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2014.02.06
Content determination of quercetin and luteolin in Limonium sinense(Girard)Kuntze by HPLC
YU Fan1,2,TANG Xin-hui 2,YANG Xiao-lan1(1.Jiangsu Provincial Key Laboratory of Coastal Wetland Bioresources
and Environmental Protection,Jiangsu Yancheng 224002,China;2.Pharmacy colege,Yancheng Teachers University,Jiang-
su Yancheng 224051,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To establish a determination method for the contents of quercetin and luteolin in Limonium sinense
(Girard)Kuntze by HPLC.METHODS TURNER Kromasil TMC18column(250×4.6 mm,5μm)was used,the mobile phase
was consisted of methanol:0.2%phosphoric acid(55∶45),the flow rate was 1 ml·min-1 and the detection wavelength was set
at 360 nm.Column temperature was 30℃.RESULTS Quercetin was linear over the concentration range of 0.92-92μg·ml
-1
(r=0.999 6),the average result of recovery was 98.87%and RSD was 1.68% (n=6).Luteolin was linear over the concen-
tration range of 0.412-41.2μg·ml
-1(r=0.999 8),the average result of recovery was 99.33%and RSD was 1.89% (n=6).
·201· 中国医院药学杂志2014年1月第34卷第2期Chin Hosp Pharm J,Jan 2014,Vol 34,No.2
CONCLUSION The proposed method is simple,highly sensitive,precise,accurate and can be used for reliable quantitation
and evaluation of Limonium sinense(Girard)Kuntze.
KEY WORDS:Limonium sinense(Girard)Kuntze;quercetin;luteolin;flavonoids;HPLC
  中华补血草Limonium sinense(Girard)Kuntze
为蓝雪科补血草属植物,又名匙叶草、盐云草、海菠
菜、海赤芍,是多年生泌盐草本药用植物[1]。由于濒
临灭绝,2001被列为中华人民共和国植物保护品
种[2]。中华补血草各部位均可入药,民间常用根治
疗肝癌,用叶治疗胃溃疡和胃癌,用花治宫颈癌及各
种出血,全草入药,有清热解毒、止血散瘀、祛风消
炎、抗癌、抗衰老的功效[3]。研究表明,黄酮为中华
补血草主要有效成分之一,由于槲皮素具有抗氧化、
抗癌、抗突变等作用[4],木犀草素亦有抗癌细胞增
殖、诱导癌细胞凋亡和凋亡增敏作用[5],本课题对国
家自然保护区内野生中华补血草药材中槲皮素和木
犀草素的含量进行了测定,对原始野生中华补血草
的质量资料留存,为后续中华补血草野生品种的保
存和鉴定,有重要的意义。
1 材料
1.1 仪器 LC-2010C高效液相色谱仪(日本岛津
公司);分 析 天 平 (德 国 赛 多 利 斯 BS210S),
SK5200H超声波清洗机(上海科导超声仪器有限公
司);双光束紫外可见分光光度计(尤尼柯仪器有限
公司 UV-4802H型)。
1.2 试药 槲皮素对照品(中国药品生物制品检定
所,批 号 100081-200806),木 犀 草 素 (阿 拉 丁,
1131358),甲醇为色谱纯,其他试剂均为分析纯,水
为注射用水。
中华补血草样品均自采集,经盐城师范学院生
命科学与技术学院于延球教授鉴定为蓝雪科补血草
属中华补血草Limonium sinense (Girard)Kuntze
全草。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱:TURNER Kromasil TM
(4.6 mm×250 mm,5μm);以甲醇-0.2%磷酸溶液
(55∶45)为流动相,检测波长为360 nm;进样量:20
μl,流速:1 ml·min
-1,柱温为30℃。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的
槲皮素对照品23.0mg,木犀草素对照品10.3 mg,
置同一250 ml量瓶中,加甲醇适量,超声10 min并
用甲醇稀释至刻度,即为槲皮素质量浓度为92.0μg
·ml-1和木犀草素质量浓度为41.2μg·ml
-1的对照
品贮备液。
2.3 供试品溶液的制备 取本品粉末(过3号筛)
约2 g,精密称定,精密加入甲醇100 ml,称定重量,
加热回流提取90 min,放冷后称定质量,用甲醇补
足减失的质量,摇匀,0.45μm微孔滤膜过滤,取续
滤液,即得[6]。
2.4 系统适应性考察 分别量取对照品溶液、供试
品溶液注入色谱仪,记录色谱图(图1),结果槲皮
素、木犀草素与样品中其他成分能较好分离。理论
板数按槲皮素和木犀草素峰计算应均不低于3 000。
图1 对照品及中华补血草样品的 HPLC图谱
A.对照品;B.样品;1-槲皮素;2-木犀草素
Fig 1 The HPLC chromatogram of standard solution and Limonium
sinense sample
A.Standard solution;B.Limonium sinense sample;1-Quercetin;2-
Luteolin
2.5 标准曲线的制备 精密吸取对照品贮备液
0.1,2,4,6,8,10 ml,置于10 ml量瓶,加甲醇稀释
至刻度,摇匀,配成系列浓度的对照品溶液。取20
μl注入液相色谱仪,测定峰面积值,以峰面积为纵
坐标(Y)对对照品浓度(X)绘制标准曲线。得槲皮
素的回归方程 为:Y =52 149 X +118 49(r=
0.999 6)。槲皮素在0.92~92μg·ml
-1范围内与峰
面积呈良好的线性关系。木犀草素的回归方程为:
Y=84 656 X+13 596(r=0.999 8)。木犀草素在
0.412~41.2μg·ml
-1范围内与峰面积呈良好的线
性关系。
2.6 精密度试验 精密量取混合对照品20μl,在
上述色谱条件下,按“2.1”项下色谱条件连续进样6
次,测定槲皮素和木犀草素峰面积。结果槲皮素峰
面积 RSD 为0.62%,木犀草素峰面积 RSD 为
0.57%,表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液适量,
室温下放置,于0,2,4,8,12,24 h分别进样20μl,
按“2.1”项下色谱条件测定,考察其稳定性。槲皮素
峰面积 RSD 为1.31%,木犀草素峰面积 RSD 为
·301·中国医院药学杂志2014年1月第34卷第2期Chin Hosp Pharm J,Jan 2014,Vol 34,No.2
1.03%。结果供试品溶液在24 h内稳定。
2.8 重复性试验 同一批样品,共6份,精密称定,
按“2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色
谱条件进行测定,计算槲皮素和木犀草素的含量,供
试品中槲皮素含量为2.320 mg·g-1,RSD 为
1.89%;木犀草素的含量为0.736 mg·g-1,RSD为
1.42%。结果表明,上述方法重复性良好。
2.9 加样回收试验 精密加入混合对照品溶液(槲
皮素质量浓度为2.41 g·L-1,木犀草素质量浓度为
0.75 g·L-1)1 ml至100 ml的具塞三角瓶中,挥干
溶剂,平行制备6份,再在每一份中加入已知含量的
中华补血草粉末(过3号筛)约1 g,按上述供试品溶
液制备方法和色谱条件测定,计算回收率,结果见表
1,槲皮素的平均加样回收率为98.87%,RSD 为
1.68%,木犀草素的平均加样回收率为99.33%,
RSD为1.89%。
表1 加样回收试验结果(n=6)
Tab 1 Results of the recovery(n=6)
成分
称样量
/g
样品量
/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均值
/%
RSD
/%
槲皮素 1.000 2 2.320  2.41  4.748 100.73 98.87 1.68
0.999 8 2.320  2.41  4.699  98.73
1.000 5 2.321  2.41  4.722  99.62
1.000 3 2.321  2.41  4.687  98.19
0.999 6 2.319  2.41  4.633  96.01
1.000 1 2.320  2.41  4.729  99.95
木犀草素1.000 2 0.736  0.75  1.492 100.78 99.33 1.89
0.999 8 0.736  0.75  1.472  98.15
1.000 5 0.736  0.75  1.474  98.35
1.000 3 0.736  0.75  1.476  98.64
0.999 6 0.736  0.75  1.504 102.44
1.000 1 0.736  0.75  1.468  97.59
2.10 样品测定 分别取不同产地的中华补血草药
材,粉碎,取粉末约2 g,精密称定,按照“2.3”项下供
试品溶液的制备方法制备,按照“2.1”项下的色谱条
件测定其槲皮素和木犀草素的含量。结果见表2。
表2 中华补血草样品含量测定结果(n=6)
Tab 2 Results of the samples determination by HPLC(n=
6)
批次 产地
槲皮素平均含量/
mg·g-1
RSD/

木犀草素平均含量/
mg·g-1
RSD/

1 大丰 2.320  1.89  0.736  1.42
2 东台 1.782  0.95  0.532  0.98
3 连云港 1.453  1.85  0.382  1.29
4 灌云 1.983  1.94  0.684  1.37
5 射阳 1.639  1.49  0.529  1.24
6 南通 1.314  1.13  0.320  0.96
7 如东 1.796  0.93  0.541  0.75
3 讨论
中华补血草虽然为濒危物种,但文献对它的报
道却很少,甚至迄今为止仍未见其化学成分中有木
犀草素的报道。笔者在对中华补血草进行研究时发
现一个黄酮化合物,后并对其进行了提取、分离、纯
化和波谱解析,证实为木犀草素,为首次在该药材中
发现。由于槲皮素和木犀草素这两种黄酮类代表化
合物均具有抗癌作用,且在中华补血草中含量较高,
故本实验选择对它们进行含量测定。
3.1 提取条件的选择 传统的中药提取有效成分
的方法有溶剂浸渍法、超声提取法、加热回流提取法
等,超声提取法和加热回流提取法在中药成分分析
中最为常用。本实验考察了超声提取法和加热回流
提取法2种方法在不同提取时间的提取效果,结果
表明加热回流提取法远比超声提取法的效果好。考
察了回流提取30,60,90,120,150,180 min,考虑提
取效率,兼顾节约能源等因素,最终选择了加热回流
提取90 min的提取方法。
3.2 检测波长的确定 文献报道槲皮素和木犀草
素的常用检测波长为255[7]、360[8-9]、370 nm[10],利
用紫外-可见光分光光度计对槲皮素和木犀草素对
照品溶液进行扫描,槲皮素在255,370 nm处有较
大紫外吸收,木犀草素在254,349 nm处有较大紫
外吸收,但中华补血草中所含的挥发油、香豆素[11]、
蛋白质[12]、鞣质类[13]成分对254 nm处均有干扰,
兼顾提高灵敏度和减少杂质干扰的要求,本实验选
择了槲皮素与木犀草素均有较大吸收的360 nm作
为含量测定的检测波长。
3.3 流动相的选择 中华补血草所含成分复杂,且
槲皮素和木犀草素极性差别小,流动相不合适易造
成出峰时间过长或分离效果不佳。文献[14-15]采
用甲醇-0.4%磷酸(45∶55)、甲醇-0.1%磷酸(60∶
40)等作为流动相,在分离中华补血草时效果不佳,
流动相为55%甲醇溶液时出峰较好,但拖尾严重。
笔者尝试了用加入少量醋酸、磷酸来改善峰型,醋酸
因其易挥发效果不佳,所以本文选择不挥发的磷酸
来改善峰型,文中采用甲醇-0.2%磷酸(55∶45)作为
流动相,槲皮素和木犀草素出峰快,分离完全,峰型
也较好。
3.4 不同部位的含量研究 对中华补血草不同器
官中槲皮素和木犀草素的含量做了对比研究,结果
表明:在植株的花、叶、茎、根中均含有黄酮成分,其
中根的槲皮素与木犀草素含量最高,花次之,再次为
叶,含量最少的是茎。因此对中华补血草药材的利
用,应从资源的保护、合理利用及可持续发展的角度
出发,以合理利用全草为好。
3.5 不同地区的含量测定 不同地区的中华补血
草所含槲皮素和木犀草素差异非常大。槲皮素和木
犀草素含量最高的是大丰自然保护区内的中华补血
·401· 中国医院药学杂志2014年1月第34卷第2期Chin Hosp Pharm J,Jan 2014,Vol 34,No.2
草,灌云的次之,如东、东台的中华补血草中槲皮素
和木犀草素的含量也较高,这可能与不同地区各自
的生态环境有关。因此,从黄酮类成分的资源利用
角度来看,大丰自然保护区内的中华补血草质量较
好,故建议在以中华补血草作为药源时应考虑同种
药材不同产地的含量差异。
本文对野生中华补血草药材中槲皮素和木犀草
素的含量测定方法进行了研究,对建立的测定方法
进行了考察。经验证,该方法简便,快速,准确度高,
重复性好。本文对深入研究中华补血草质量、保存
中华补血草野生品种的相关数据资料、植物保护等
方面有重要的意义。
参考文献:
[1] 刘兴宽.中华补血草的化学成分研究[J].中草药,2011,42(2):
230-233.
[2] 董必慧.江苏沿海滩涂中华补血草的保护性研究[J].中国野生
植物资源,2005,24(6):28-30.
[3] 张华彬,张代臻,葛宝明,等.中华补血草的生药学研究[J].时
珍国医国药,2011,22(12):2847-2848.
[4] Liu SP,Chen SM,Zhu WD.Advance studies of biological ac-
tivity of quercetin and its derivations[J].Chin Tradit Herb
Drugs,1991,22(7):182-185.
[5] Kim JA,Kim DK,Kang OH,et al.Inhibitory effect of luteo-
lin on TNF-alpha-induced IL-8 production in human colon
epithelial cels[J].Int Immuno Pharmacol,2005,5(1):209-
217.
[6] 中国药典.一部[S].2010:348.
[7] 孙兆荣.高效液相色谱法测定银葛胶囊中总黄酮醇苷的含量
[J].中国医院药学杂志,2011,31(22):1906-1908.
[8] 樊鑫梅,申雪丽,闫丽丽,等.高效液相色谱法同时测定沙棘果
中槲皮素、山柰酚和异鼠李素的含量[J].中国医院药学杂志,
2012,32(17):1343-1346.
[9] 中国药典.一部[S].2010:257.
[10]冼寒梅,周蓉,张宏.HPLC法测定三白草中槲皮素的含量
[J].中药材,2008,31(8):1179-1180.
[11]陶君彦,杨安树,朱江,等.不同采收时间和药用部位草木樨药
材中香豆素含量的测定[J].中国医院药学杂志,2010,30(17):
1503-1505.
[12]郭志磊,范捷.固相萃取和蛋白沉淀法在高效液相色谱法测定
万古霉素血药浓度中的比较[J].中国医院药学杂志,2013,33
(9):745-747.
[13]周本宏,金龙,张琛霞,等.大孔吸附树脂富集纯化石榴皮总鞣
质的工艺条件优选[J].中国医院药学杂志,2012,32(23):
1859-1863.
[14]胡玥,李启艳.RP-HPLC法测定垂盆草药材中槲皮素、山奈素
和异鼠李素的含量[J].药物分析杂志,2010,30(3):504-507.
[15]罗君,张丽艳.RP-HPLC法测定八角莲属植物中槲皮素及山
奈酚的含量[J].中国中药杂志,2010,35(22):3021-3023.
[收稿日期]2013-06-19
[作者简介]陈黎,女,在读博士,主任药师,副教授;研究方向:中药资源及制剂研发,电话:0719-8801157,E-mail:chenli0201@sian.com  [通
讯作者]陈科力,男,教授,博士生导师,研究方向:中药资源及品质研究,电话:0719-8801157;E-mail:kelichen@126.com
鄂西北地区白及高效液相指纹图谱研究
陈黎1,2,黄良永2,毛闪闪3,陈士林4,陈科力1  (1.湖北中医药大学药学院,湖北 武汉430065;2.湖北医药学院附属太
和医院,湖北 十堰,442000;3.湖北医药学院药学院,湖北 十堰442000;4.中国中医科学院中药研究所,北京100007)
[摘要] 目的:建立鄂西北地区白及化学成分的 HPLC指纹特征图谱,为白及药材的质量控制提供科学依据。方法:采用
HPLC法,以 Waters SunFire C18(4.6 mm×250 mm,5μm)为色谱柱,Diamonsil C18保护柱,以乙腈和水为流动相,梯度洗脱,
流速为1 ml·min-1,检测波长270 nm,柱温为30℃。结果:不同产地的15批白及药材化学成分特征图谱共检出9个分离度良
好的共有峰。对不同产地的9个特征峰进行聚类分析,白及药材产地与特征图谱相似度差异不大,样品中参照物1,4-二[4-(葡
萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine)的含量有明显差别。结论:该方法简便、快速,可做为白及的质量控制的有效手段。
[关键词] 白及;指纹图谱;高效液相色谱法;militarine;质量控制
[中图分类号]R927 [文献标识码]A [文章编号]1001-5213(2014)02-0105-05 DOI:10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2014.02.07
Study on the HPLC fingerprint of Bletilla striata from northwest area of Hubei province
CHEN Li 1,2,HUANG Liang-yong2,MAO Shan-shan3,CHEN Shi-lin4,CHEN Ke-li 1(1.Colege of Pharmacy,
Hubei University of Traditional Chinese Medicine,Hubei Wuhan430065,China;2.Department of Pharmacy,Affiliated Taihe
Hospital,Hubei University of Medicine,Hubei Shiyan,442000,China;3.Colege of Pharmacy,Hubei University of medi-
cine;Hubei Shiyan 442000,China;4.Institute of Traditional Chinese medicine,China academy of Chinese medical sciences,
Beijing100007,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To establish the HPLC fingerprint of chemical constituents of Bletila striata from northwest area of
Hubei province,to provide evidence for quality control of Bletila striata.METHODS The chromatographic separation was per-
·501·中国医院药学杂志2014年1月第34卷第2期Chin Hosp Pharm J,Jan 2014,Vol 34,No.2