全 文 ：基金项目:广西省科技攻关项目(桂科攻 0235022-1B);广西省回国人员科技基金项目(桂科回 0009004)
收稿日期:2004-09-02
作者简介:刘光田(1972-),男 ,山东人 , 工程硕士 ,从事分析化学工作。 E-mail:newfour tharmy@163.com。
固相萃取-反相高效液相色谱法
测定地钱中的芹菜素
刘光田
(中南大学化学化工学院 , 湖南 长沙 410083)
摘 要:建立了地钱中芹菜素含量的测定方法。样品用 80%乙醇水溶液提取后 , 用以硅胶为固定相的固相萃取柱纯
化 ,洗去杂质后的流出液作为反相高效液相色谱法测定用的供试液。结果表明 , 在 1.60 ～ 12.80 mg·L-1范围内 ,芹菜
素进样量与峰面积响应值呈良好的线性关系 , r=0.9995;回收率为 98.71%～ 103.20%, RSD 为 1.6%(n =5)。该法简
便快速 ,结果准确可靠 , 重复性好 ,可用于地钱中芹菜素的质量测定。
关键词:地钱;芹菜素;固相萃取;反相高效液相色谱法
中图分类号:Q 949.351.1 O 657.72 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2004)06-0051-03
地钱(Marchant ia polymorpha L.)又名地衣 ,属
苔藓类植物 ,多生于阴暗潮湿的地方[ 1] 。我国苔藓植
物资源十分丰富 ,已报道的约有 3000种 ,而药用的不
到1.8 %,极少作为正式药材使用[ 2] 。地钱的化学成
分主要包括萜类化合物 、黄酮类化合物 、联苄类化合物
及香豆素类等 ,黄酮类化合物以芹菜素 、木犀草素及其
甙为主[ 3] ,其测定方法主要有分光光度法[ 4] 和高效液
相色谱法[ 5] ,大多采用液-液萃取作为前处理手段和
梯度洗脱高效液相色谱法测定 ,操作繁琐 ,测定时间
长 ,且样品萃取不完全 ,重现性较差 。本研究采用固相
萃取法作为反相高效液相测定的前处理方法 ,等梯度
洗脱 ,外标法测定地钱中的芹菜素含量 ,简便快速 ,分
析结果准确可靠 ,重复性好 ,结果令人满意。
1 实验
1.1 仪器和试剂
BT8100 高 效 液 相 色 谱 仪 , Biot ronic 公 司;
BT8200UV 检测器 , 756MC 紫外可见分光光度计 ,上
海分析仪器厂;旋转蒸发仪 , 上海申科仪器公司。乙
醇 、石油醚 、乙酸乙酯等试剂均为 AR级;硅胶 AR级 ,
青岛海洋化工厂;甲醇和乙腈为色谱纯 。芹菜素对照
品由中国药品生物制品鉴定所提供;药材地钱 ,广西中
医学院提供。
1.2 色谱条件
色谱柱为 Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm i.d ,
5 μm , Hanbon Science & Technology Co.Ltd.);流动
相为乙酸∶甲醇∶乙腈∶磷酸∶水=10∶200∶100∶10∶200(体积比);
流速0.60 mL·min-1 ,检测波长350 nm;柱温 25℃;进
样量 6.0μL(自动进样)。
1.3 方法
1.3.1 对照品溶液的制备
精密称取芹菜素对照品 0.0100 g ,置 250 mL 容
量瓶中 ,加甲醇约 60 mL ,微热溶解 ,冷却室温 ,加少
量冰醋酸 ,加甲醇稀释至刻度 , 摇匀 , 得质量浓度为
40.00 mg·L-1的对照品溶液。
1.3.2 供试品溶液的制备
取粉碎后的地钱干燥品约 20 g 精密称定 , 80%乙
醇 100 mL 70℃下回流提取 0.5 h ,重复 3次 ,过滤 ,合
并滤液 ,减压回收乙醇 ,蒸干 ,加 20 mL 甲醇溶解 ,拌入
处理后的硅胶 30 g ,水浴 60℃缓慢加热 ,挥发去溶剂 ,
蒸干 ,干法装于固相萃取小柱中 ,先用 100 mL 氯仿-
甲醇(25∶12 ,体积比)混合液萃取 ,再用100 mL氯仿-甲醇
(25∶20 ,体积比)混合液萃取 ,收集后者的萃取液 ,减压蒸
馏 ,浓缩至 50 mL 即得地钱黄酮提取物的供试品溶液。
2 结果与讨论
2.1 线性关系校准曲线
取芹菜素对照品贮备液适量 ,用流动相稀释 ,制成
质量浓度(mg·L-1)分别为 1.60 、3.20 、6.40 、8.00 、
9.60和 12.80的对照品溶液 ,依次进样测定 ,以质量
浓度 c(mg·L-1)为横坐标 ,峰面积响应 A(mV·s)为
纵坐标 ,线性拟合 , 得线性方程 A =1.013×105 c -
化学与生物工程
Chemistry &Bioengineering 2004, No.6 分析测试 51
5.448 ×10 4 , r=0.9995 ,表明在 1.60 ～ 12.80 mg·L-1
浓度范围内 ,样品质量浓度与峰面积响应值呈良好的
线性关系 。校准曲线见图 1 。
图 1 校准曲线
Fig.1 Calibration curve
2.2 精密度试验
取质量浓度为 6.04 mg·L-1的对照品溶液 ,连续进
样6次 ,测得峰面积响应值的 RSD为1.6%(n=5)。对
照品的HPLC 色谱图见图 2。
图 2 标准品色谱图
Fig.2 Chromatograms of standard samples
2.3 稳定性试验
取质量浓度为 6.04 mg·L -1的对照品溶液在配制
的当天以及后 3 d 内不同的时间进样测定 ,测得峰面
积响应值的 RSD为 1.49%(n =5),表明对照品溶液
至少在 4 d 内稳定。
2.4 重复性试验
取样品 5份 ,每份约 5 g ,精密称量 ,分别按 1.3.2
方法制得供试品溶液 ,进样测定 ,计算得 5份样品的含
量平均值为 0.0057 , RSD为 2.98%(n=5)。
2.5 回收率试验
取样品 5份 ,每份约 5 g ,精密称量 ,分别按 1.3.2
方法制得供试品溶液 ,取每份供试品溶液各10 mL 于
25 mL 容量瓶中 ,各精密加入质量浓度为 3.20 mg·L-1
的对照品贮备液 5 mL ,加流动相稀释至刻度 ,摇匀;制
得回收试验用供试品溶液 ,进样测定 ,结果见表 1。
表 1 回收试验结果(n=5)
Tab.1 The results of recovery tests(n=5)
样品
g
初始量
μg
加入量
μg
测定量
μg
回收率
%
平均值
%
RSD
%
5.0892 22.90 16.00 39.88 102.51
5.1864 25.40 16.00 41.42 100.05
5.1467 26.20 16.00 41.71 98.84 100.66 1.38
5.2810 24.30 16.00 39.78 98.71
5.1023 24.00 16.00 41.28 103.20
2.6 样品测定结果
供试品溶液 5份 ,进样测定 ,外标法计算芹菜素含
量 ,测定结果见表 2。供试品色谱图见图 3。
表 2 样品测定结果
Tab.2 The results of sample
序号 芹菜素含量/ % 平均值/% RSD/ %
1 0.0055
2 0.0056
3 0.0059 0.0057 2.98
4 0.0058
5 0.0058
图 3 样品色谱图
Fig.3 Chromatograms of samples
2.7 讨论
2.7.1 对照品的溶解
曾用不同溶剂进行试验 ,发现芹菜素对照品微溶
于冷的甲醇 、乙醇 、正丁醇 ,不溶于丙酮 、水 、乙醚和氯
仿。在热的甲醇(50℃)中溶解度较大 ,溶解后的溶液
呈淡黄色 ,置于冰箱中放置 , 12 h 内测定 ,芹菜素含量
未见有明显改变 ,但放置 2 d 后溶液变混浊 ,有芹菜素
晶体析出;芹菜素溶液直接放在室温下 3 d 内芹菜素
含量未见有明显改变 ,4 d 后测定芹菜素含量明显减
少;用甲醇溶解后马上加入少量冰醋酸使溶液呈酸性 ,
未见芹菜素固体析出 ,一周内测定 ,未见芹菜素含量明
显改变 。试验结果表明芹菜素在酸性条件下稳定 ,在
碱性条件下不稳定 。以甲醇作溶剂 ,微热使芹菜素完
52 刘光田:固相萃取-反相高效液相色谱法测定地钱中的芹菜素/2004 年第 6期
全溶解 ,溶解后加少量冰醋酸 , 3 d 后未见芹菜素固体
析出 ,一周内亦未发现其含量发生改变 。
2.7.2 地钱中黄酮类化合物的提取
用不同溶剂(甲醇 、乙醇 、丙酮)对地钱中的黄酮类
化合物进行提取研究:分别称取地钱样品10 g , 在
60℃下 ,用不同浓度的甲醇 、乙醇 、丙酮提取 ,时间1 h ,
2次 ,分光光度法测定总黄酮含量[ 4] ,结果见图 4。从
图 4可知相同时间下乙醇提取率最高 ,丙酮次之 ,甲醇
最差 。随溶剂浓度的增大乙醇对总黄酮提取率影响显
著。考虑到试验的安全性 ,本研究选用乙醇水溶液为
提取溶剂 ,经过正交试验确定 70℃下回流提取0.5 h ,
提取次数 3次 ,提取率达 1.94%[ 6] 。
Fig.4 Effects of solvents on ext racting flavones
2.7.3 固相萃取洗脱剂的选择
试验了不同配比的氯仿 、甲醇溶液对芹菜素萃取
的影响 ,萃取结果见图 5。
由图 5可知 ,选择配比为25∶12(氯仿∶甲醇 ,体积比)
的萃取液作为杂质的洗脱剂 ,去除杂质;然后用配比为
25∶20(氯仿∶甲醇 ,体积比)的萃取液萃取出芹菜素 ,作为
HPLC的供试品溶液。
2.7.4 色谱分离
在拟定的色谱条件(以多元混合溶剂为流动相)
下 ,得到芹菜素标准品的色谱图(图 2)以及地钱黄酮
制备液的色谱图(图 3)。由图 3可见 ,地钱样品中芹
菜素与相邻组分的分离度 RS >1.5 ,达到基线分离 ,符
合定量分析之要求 ,且在此色谱条件下地钱中其它黄
酮类化合物分离度也较好 ,故本法确定的色谱条件也
可用于地钱中其它黄酮类化合物分析测定。
图 5 芹菜素萃取曲线
Fig.5 Extraction curve of apigenin
3 结论
以固相萃取法作为地钱中芹菜素反相高效液相色
谱测定中样品的分离纯化处理方法 ,不损失待测成分 ,
简便实用 ,可作为地钱中的芹菜素的质量控制方法 。
参考文献:
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Determination of Apigenin in Marchantia Polymorpha by
RP-HPLCwith Solid-Phase Extraction
LIU Guang-tian
(College of Chemistry and Chemical Engineering , Central South University , Changsha 410083 , China)
Abstract:A method for determinat ion of apigenin in Marchant ia polymorpha was established.The sample was
ex tracted by 80%EtOH , then the solution was purif ied through the solid-phase ex traction column with silica gel as
stationary phase.The liquid w hich w as eluted after the cartridge absorbed apigenin to saturation state w as used as a
test solution and measured by HPLC-UV.The linear range of 1.60 ～ 12.80 mg·L-1(r =0.9995), recoveries of
98.71%～ 103.20% and RSD of 1.6%(n =5)for the method w ere obtained.The method w as proved to be simple ,
accurate , repeatable , and can be used for the quality cont rol of apigenin in Marchant ia polymorpha.
Keywords:Marchant ia polymorpha;apigenin;solid-phase ex traction;HPLC
刘光田:固相萃取-反相高效液相色谱法测定地钱中的芹菜素/ 2004 年第 6 期 53