全 文 ：应用与环境生物学报　 2005, 11(2):235～ 237 　 　
ChinJApplEnvironBiol=ISSN1006-687X 　 2005-04-25
　苔藓植物光合色素含量测定方法
———以暖地大叶藓为例＊
包维楷＊＊　冷 俐
(中国科学院成都生物研究所　成都　 610041)
摘　要　为了探讨苔藓植物光合色素含量测定方法的可靠性 , 设计了材料研磨或不研磨以及常见的 80%丙酮和 95%
乙醇作为溶剂所组成的 6个组合提取暖地大叶藓叶光合色素;并采用光谱比色方法 ,比较了所测定叶绿素 a、b以及类
胡罗卜素含量之间的差异.发现研磨是藓叶光合色素提取的必要步骤 ,而提取溶剂以 95%乙醇最佳 ,明显优于目前广
泛应用的丙酮.综合分析表明 , 95%乙醇提取并经研磨处理提取光合色素 、光谱比色方法是苔藓植物光合色素含量测
定的可靠方法.表 1参 11
关键词　苔藓植物;光合色素;测定方法;暖地大叶藓
CLC　Q949.350.5
DETERMINATIONMETHODSFORPHOTOSYNTHETICPIGMENTCONTENT
OFBRYOPHYTEWITHSPECIALRELATIONOFEXTRACTINGSOLVENTS＊
BAOWeikai＊＊＆LENGLi
(ChengduInstituteofBiology, ChineseAcademyofSciences, Chengdu　610041, China)
Abstract　EfectsofsixcommonextractingtreatmentsonphotosyntheticpigmentcontentofRhodobryumgiganteum(Schwae-
gr.)Par.werestudiedbyspectrophotometricmethod.Theobjectiveistocomparethedifferencesamongthesixextracting
treatmentsandtofindoutareliabledeterminationmethodforphotosyntheticpigmentcontentofbryophyte.Itwasfoundthataf-
termaterialwasground95%ethanolasextractingsolventwasmostreliablefordeterminingphotosyntheticpigmentcontentand
itwasmuchbeterthantheextensivelyusedacetone.Undertheenvironmentalconditionwith18℃ temperature, 3 000lxlight
intensityand70% humidity, contentsofchlorophyla, chlorophylbandcarotenoidsintheleavesofR.giganteumwere
(2.388 2±0.267 8)mg/g, (1.488 4±0.271 3)mg/gand(0.429 5±0.017 8)mg/g, respectively.Tab1, Ref11
Keywords　bryophyte;photosyntheticpigment;determinationmethod;Rhodobryumgiganteum(Schwaegr.)Par.
CLC　Q949.350.5
　　苔藓植物是 C3植物 , 光饱和与光补偿点低 , 常常能在林
下弱光环境中良好生存和发展.和其它高等植物一样 , 苔藓植
物对环境中光资源的利用通过光合色素来实现.目前光合色素
已经在藻类 、地衣 、苔藓以及其它高等植物研究中作为判断活
力与胁迫状况的指标而得到应用 [ 1] , 因此 , 准确可靠测定光合
色素含量具有重要的意义.
苔藓植物光合色素的测定主要根据 Arnon方法 , 采用紫外
或传统分光光度计比色来进行的 [ 1 ～ 10].已有的研究采用了不
同的溶剂来制备色素提取液 , 较多的研究采用 80%的丙
酮 [ 1～ 8] , 也 有 人 采 用 甲 基 砜 DMF( N, N -dimethyl-
formamide)[ 9] , Penuelas＆ Valcorba(1988)采用甲醇(metha-
nol)来提取 [ 10].杨敏文(2002)研究发现 , 3种溶剂(丙酮 -乙
醇混合液 、 80%丙酮 、95%乙醇)提取的微管束植物色素的光密
收稿日期:2004-01-08　　修回日期:2004-07-20
＊中国科学院知识创新工程项目(KSCX1-07-01, KZCX3-SW-339)与
西部之光项目共同资助　SupportedbytheKnowledgeInnovation
ProjectandLightofWesternChinaoftheChineseAcademyofSci-
ences
＊＊通讯作者　Correspondingauthor(E-mail:baowk@cib.ac.cn;Tel:
028-85231656)
度值一致 , 可采用 Arnon法进行测定和计算 , 但丙酮 -乙醇混
合液提取测定的叶绿素含量最高 、精密度最好 、效果最好 [ 11].
但对苔藓植物而言 ,还不清楚究竟采用那种提取溶剂可以获得
更为可靠的结果.
本文以暖地大叶藓 Rhodobryumgiganteum(Schwaegr.)
Par.为材料 ,选择了两种常见溶剂 80%丙酮和 95%乙醇以及
实验材料研磨或不研磨 ,组成 6个处理 ,进行色素提取 ,采用紫
外 -可见光分光光度计比色 , 测定最佳光密度值 , Arnon计算
公式计算光合色素含量.目的是探讨不同处理方法之间的差异
性 , 寻找测定苔藓植物叶绿素含量测定的可靠方法 ,为深入开
展苔藓植物色素生理生态作用提供方法依据.
1　实验材料与测定方法
1.1　实验材料
实验材料暖地大叶藓 R.giganteum采自四川都江堰市龙
池国家森林公园 ,栽培在室内 , 管理浇水成活后移入人工气候
箱 , 培养控制条件为:温度 18℃, 光照强度 3 000 lx(光密度 28
～ 30 μmolm-2 s-1),湿度 70%.10 d后取样进行测定 , 这样可
以消除因取样生境差异导致的研究材料背景值的差异.
1.2　测定方法与步骤
采集暖地大叶藓鲜枝顶端 1 ～ 2 cm, 分别采用 3种提取液
80%丙酮(A.R)溶剂 、95%的乙醇(A.R)、80%丙酮:95%乙醇
(V∶V=2∶1)溶剂分别进行提取(包括磨碎).在 663、 665
nm和 646、649nm光谱下 , 用(英国)LNICAMUV330紫外 /可
见分光光度计测定叶绿素 , 在 470nm下测定类胡萝卜素 ,均采
用 Arnon方法计算叶绿素 、叶绿素 a、叶绿素 b和类胡罗卜素
的含量 , 色素含量均用 w/mgg-1(干重)表示 [ 1～ 8].
95%乙醇提取过程如下:剪取苔藓栽培样品生长末稍适
量 , 淘去泥沙 ,去除杂质 ,晾干表面水分 , 剪碎(约 2 mm左右)
混合均匀.每个样品称取 0.200 0 g左右 , 作 5个重复 , 分别放
入研钵中 , 加少量石英砂和碳酸钙及 2 ～ 3 mL95%乙醇 , 研磨
成匀浆 , 再加乙醇 10 mL, 继续研磨至组织变白.静置 3 ～ 5
min.过滤到 25 mL棕色容量瓶中 , 并用少量乙醇冲洗数次 ,直
至滤纸和残渣中无绿色为止 ,最后用 95%乙醇定容至刻度 ,比
色测定色素 , 以 95%乙醇为空白.在 665 nm、649 nm和 470nm
下测定吸光度.95%乙醇作溶剂 ,用如下公式计算其浓度:
叶绿素 a含量 ρchl-a/mgL-1 =13.95A665nm-6.88A649 nm;
叶绿素 b含量 ρchl-b/mgL-1 =24.96A649nm-7.32A665nm
类胡罗卜素含量 ρcaro/mgL-1 =(1000A470nm -2.05ρchl-a-
114.8ρchl-b)/245;
色素含量(w/mgg-1)=ρ×V×N/m×1000
式中:ρ—色素的浓度(mgL-1);V—提取液体积(mL);
N—稀释倍数;m—样品鲜重或干重(g);1 000—提取液体积
mL换算成 L.
用 80%丙酮 、V(80%丙酮)∶V(95%乙醇)=2:1两种溶
剂分别提取时 , 取样方法同上 , 每份样品称 0.200 0 g左右 , 每
种溶剂作 5个重复 , 分别研磨成匀浆 , 转入离心管中;再用少
量溶剂洗净研钵并转入离心管中 , 4 000 r/min离心 10 min;将
上清液转入 25mL棕色容量瓶中 ,沉淀再加少量溶剂 , 搅匀 ,再
次离心 10min;上清液一并转入容量瓶中 , 定容至刻度 , 放入
冰箱冷藏室中待测.在 470 nm、 646 nm、 663 nm波长下测其吸
光度.80%丙酮及混合溶剂用下述公式计算其浓度:
叶绿素 a含量 ρchl-a/mgL-1 =12.21A663nm-2.81A646 nm
叶绿素 b含量 ρchl-b/mgL-1 =20.13A646nm-5.03A663nm
类胡罗卜素含量 ρcaro/mgL-1 =(1000A470nm-3.27ρchl-a-
104ρchl-b)/229
色素含量计算方法同上.
研磨与不研磨处理试验.取同样暖地大叶藓材料 ,取样方
法同上 , 不研磨 ,直接进行提取 ,提取时间 11 d,每天震荡 1次.
色素提取过程均在弱暗光和 4℃低温条件下进行.
2　结果与讨论
苔藓植物组织结构简单 ,通常仅具 1 ～ 2层细胞 , 是否能不
经研磨而直接提取光合色素并得到满意的结果呢? 实验表明 ,
暖地大叶藓样品不经过研磨 , 直接用 3种溶剂进行提取 , 尽管
提取时间很长 , 实验观察到提取后的残渣仍然表现为微绿现
象.经实验测定 , 4个各色素变量的含量均偏低(表 1), 其中采
用 80%丙酮溶剂不研磨处理提取的结果最低 , 难以获得理想
的结果 , 表明研磨处理仍然是苔藓植物光合色素测定的必要步
骤 , 否定了我们最初的想法.
在研磨前提下 , 3种不同提取溶剂处理的测定结果间差异
显著(P<0.05), 其中以 95%乙醇提取测定的结果最高 , 而混
合液提取的测定结果次之 , 最差的是 80%丙酮提取后测定的
结果(表 1).表明苔藓植物光合色素测定在低温暗光条件下采
用 95%乙醇作为提取溶剂并经研磨处理制备提取液比色测定
获得的测定结果最为可靠 ,这种方法明显优于广泛采用的丙酮
作为溶剂制备提取液来进行比色测定光合色素含量的方法.
表 1　不同处理下暖地大叶藓光合色素含量比较
Table1　ComparisonofphotosyntheticpigmentcontentsinR.giganteumunderdiferentextractiontreatments
光合色素变量
Pigmentvariables
色素提取处理
Extractingtreatments
重复数量
Replication(N)
平均值 Mean
(w/mgg-1)＊
标准偏差
Std.Deviation
叶绿素 aChlorophyla 不研磨 +80%丙酮 Notgrinding+ 80% acetone 3 0.2556a 0.0076
研磨 +80%丙酮 Grinding+ 80%acetone 4 0.8203b 0.2596
不研磨 +2∶1混合液 Notgrinding+2∶1mixture 3 0.3640ab 0.0248
不研磨 +95%乙醇 Notgrinding+ 95% ethanol 3 0.6040ab 0.0899
研磨 +2∶ 1混合液 Grinding+2∶1mixture 5 1.6022c 0.4627
研磨 +95%乙醇 Grinding+ 95%ethanol 4 2.3882d 0.2678
叶绿素 bChlorophylb 不研磨 +80%丙酮 Notgrinding+ 80% acetone 3 0.2000a 0.0076
研磨 +80%丙酮 Grinding+ 80%acetone 4 0.7431b 0.1354
不研磨 +2∶1混合液 Notgrinding+2∶1mixture 3 0.2461a 0.0021
不研磨 +95%乙醇 Notgrinding+ 95% ethanol 3 0.3084a 0.0367
研磨 +2∶ 1混合液 Grinding+2∶1mixture 5 0.9059b 0.1132
研磨 +95%乙醇 Grinding+ 95%ethanol 4 1.4884c 0.2713
类胡罗卜素 Carotenoids 不研磨 +80%丙酮 Notgrinding+ 80% acetone 3 0.0441a 0.0091
研磨 +80%丙酮 Grinding+ 80%acetone 4 0.1348a 0.0474
不研磨 +2∶1混合液 Notgrinding+2∶1mixture 3 0.0780a 0.0039
不研磨 +95%乙醇 Notgrinding+ 95% ethanol 3 0.1559a 0.0172
研磨 +2∶ 1混合液 Grinding+2∶1mixture 5 0.3071b 0.0939
研磨 +95%乙醇 Grinding+ 95%ethanol 4 0.4295b 0.1781
＊不同的字母表示在 0.05水平下的差异显著性　Diferentlettersshowingsignificantdiferenceat0.05level
3　结 论
在低温暗光条件下 ,采用 95%乙醇作为提取溶剂 , 并经研
磨处理制备提取液比色测定苔藓植物光合色素含量的方法最
为可靠 , 优于广泛采用的丙酮作为溶剂制备提取液的方法.在
236 　　　　　　　　应 用与 环 境生 物学 报　　ChinJApplEnvironBiol　　　　　　　　　　　　　　 　　　11卷
温度 18℃, 光照强度 3 000 lx, 湿度 70%的环境条件下 , 暖地
大叶藓的叶绿素 a含量为(2.388 2±0.267 8)mg/g、叶绿素 b
含量为(1.488 4±0.271 3)mg/g、类胡罗卜素含量为(0.429 5
±0.017 8)mg/g.
References
1　Martinez-AbaigarJ, Nunez-OliveraE, Sanchez-diazM.Seasonal
changesinphotosyntheticpigmentcompositionofaquaticbryophytes.J
Bryo, 1994, 18:97～ 113
2　MartinCraigeE.Chlorophyla/bratiosofelevenNorthCarolinamos-
ses.TheBryologist, 1980, 83:84～ 87
3　MartinCraigeE, ChurchilStevenP.Chlorophylconcentrationsanda/
bratiosinmossescollectedfromexposedandshadedhabitatsinKansas.
JBryo, 1982, 12:297～ 304
4　KershawKA, WebberMR.Seasonalchangesinthechlorophylcontent
andquantumeficiencyofthemossBrachytheciumrutabulum.JBryl,
1986, 14:151～ 158
5　Martinez-AbaigarJ, Nunez-OliveraE, Sanchez-diazM.Efectsof
organicpolutionontransplantedaquaticbryophytes.JBryo, 1993, 17:
553 ～ 566
6　AdamsonE, AdamsonH, SeppeltR.CementdustcontaminationofCer-
atodonpurpureusatCasey, EastAntarctica:damageandcapacityforre-
covery.JBryo, 1994, 18:127 ～ 137
7　BarsigM, SchneiderK.EfectsofUV-Bradiationonfinestructure,
carbohydrates, andpigmentsinPolytrichumcommune.TheBryologist,
1998, 101(3):357 ～ 365
8　LiuYing-Di, LiJing, HouJin-Jun, CaoTong.TheMeasurementof
netphotosynthesisofthreespeciesofPlagiomniummossesanditsrela-
tiontothelightandtemperature.JHatBotLab, 1999, 87:315 ～ 324
9　McCalKK, MartinCE.Chlorophylconcentrationsandphotosynthesis
inthreeforestunderstorymossesinNortheasternKansas.TheBryolo-
gist, 1991, 94(1):25～ 29
10　PenuelasJ, VallcorbaT.Spatio-temporalpigmentgradientalong
transversetransectsoftheRiutenes(Catalonia).JBryo, 1988, 15:
229～ 232
11　YangMW(杨敏文).Studyonrapiddeterminationofchlorophylcon-
tentofleaves.ChinJSpectroscopyLab(光谱实验室), 2002, 19
(4):478～ 481
237　 2期 包维楷等:苔藓植物光合色素含量测定方法———以暖地大叶藓为例