全 文 ：红网纹草（Fittonia verschaffeltii）是爵床科草
本植物，叶脉红色网纹状，耐阴湿、喜温暖，是一
种珍贵的室内观叶植物 [1]。主要以扦插或分株法
进行繁殖，因北方地区冬季气温低不易发根，只能
在春、夏两季育苗。由于常规方法受季节影响较
大，且繁殖速度太慢，不能满足市场需要 [2]，因而
可利用组织培养技术实现红网纹草的快速繁殖。
由于红网纹草茎段部位有较多纤毛，且叶背
脉络较深，这为其组织培养中的外植体消毒带来
一定困难，而有效的消毒方法是组织培养成功的
前提和保障。不同植物材料、不同部位其消毒试剂
和消毒时间不尽相同 [3]。尽管近几年来国内开展
了一些关于网纹草属的组织培养研究 [1-2,4-9]，但仅
局限于白网纹草 [1-2,4-8]，关于红网纹草的组织培养
研究仅有 1 篇 [9]，尚未见关于红网纹草组织培养
消毒方法的研究报道。本研究旨在筛选适宜红网
收稿日期：2015-05-18；修订日期：2015-06-21
基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目（12543012）
作者简介：范诸平（1993—），女，山东潍坊人，在读本科生，主要从事园林植物组织培养研究。
通讯作者简介：张彦妮（1974—），女，山西大同人，副教授，主要从事园林植物繁殖、栽培管理及育种研究。
红网纹草组织培养外植体消毒方法研究
范诸平，王立雪，张彦妮
（东北林业大学 园林学院，黑龙江 哈尔滨 150040）
摘 要：以红网纹草的顶芽、叶片、茎段为外植体，对其进行最佳消毒方法的研究。首先以叶片为外植体，筛选最适宜的次氯酸
钠浓度和升汞浓度，即进行不同浓度次氯酸钠（1%，2%，5%）和升汞（0.05%，0.10%，0.15%）的单因素试验。继而进行外植体（顶
芽，叶片，茎段）、2%次氯酸钠消毒时间（0,5,10 min）、0.10%升汞消毒时间（0,5,10 min）3因素 3水平的 L9（34）正交试验。结果表
明：在单因素试验中，适合红网纹草外植体的次氯酸钠和升汞浓度分别为 2%和 0.10%；在正交试验中，茎段与叶片污染率相同，
均低于顶芽，但茎段成活率最高，因而为理想的外植体，最佳的消毒方法是将茎段外植体在 2%的次氯酸钠中消毒 5 min，再在
0.10%的升汞中消毒 5 min。此种消毒方法污染率和死亡率最低为 0，存活率最高为 100%，是适宜红网纹草的最佳消毒方式。
关键词：红网纹草；组织培养；消毒方法；正交试验
中图分类号：S682.39 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2015.08.029
Research on Disinfection Methods of Explants of Fittonia verschaffeltii in Tissue Culture
FAN Zhu-ping，WANG Li-xue，ZHANG Yan-ni
(Landscape Architecture College, Northeastern Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040, China)
Abstract：Taking Fittonia verschaffeltii terminal buds, leaves, and stem segments as explants, the experiment was carried out to find
out the best disinfention method. Firstly, with leaves as its explants, the single factor experiment was carried out with three concentra-
tions of NaClO(2%, 5%,10%) and HgCl2(0.05%, 0.10%, 0.15%). Secondly, an orthogonal experiment followed with L9（34）array of
three factors and three levels, namely explants(terminal bud, leaf, stem segment), the disinfection time for NaClO(0,5,10 min), and the
disinfection time for HgCl2 (0,5,10 min).The results showed that in the single factor experiment with leaf as explants, the concentra-
tions of NaClO and HgCl2 with good disinfection effect were 2% and 0.10%respectively. In the orthogonal test, stem segments, com-
pared with terminal buds and leaves, had low pollution rate and high survival rate, and were easier to produce callus, leading to its
becoming the ideal explants for the tissue culture of Fittonia verschaffeltii. The best disinfection way was that the explants were im-
mersed in alcohol(75%) for 30 s, NaClO(2%) for 5 min and then HgCl2(0.10%) for 5 min with the lowest pollution rate(0%) and high-
est survival rate(100%).
Key words: Fittonia verschaffeltii; tissue culture; disinfection methods; orthogonal test
植物生理与生物技术
天津农业科学 Tianjin Agricultural Sciences 2015，21（8）：115-119
第 21卷天津农业科学
纹草组织培养的外植体、消毒试剂和消毒时间，为
红网纹草组织培养的无菌操作提供技术支持。
1 材料和方法
1.1 试验材料
试验材料红网纹草购自哈尔滨市花卉市场，
选取生长健壮、无病虫害的顶芽、叶片、茎段为外
植体。
1.2 试验方法
1.2.1 外植体的预处理 将剪好的外植体盛装
于小烧杯中，先用洗衣粉水冲洗 10 min，再用流水
冲洗 10 min，直至小烧杯中的洗衣粉泡沫冲洗殆
尽。
在超净工作台上，将洗好的外植体移入已消
毒的空瓶中，用 75%的酒精浸泡 30 s，不断摇晃容
器使外植体充分接受酒精的杀菌作用。倒出酒精，
倒入无菌水涮洗 1次，然后按试验设计要求对外
植体进行不同消毒试剂、不同时间的浸泡消毒。若
消毒试剂为次氯酸钠，则用无菌水冲洗 3次；若消
毒试剂为升汞，则用无菌水冲洗 5次，以充分消除
残余升汞对外植体产生愈伤组织的抑制作用。
将已消毒的外植体置于铺有无菌滤纸的超净
工作台上，使其充分吸收外植体表面的水分。剪掉
顶芽外植体形态学下端与消毒试剂接触的部位，
再将其剪成 1 cm左右的小段；剪掉茎段外植体两
端与消毒试剂接触的部分，再剪成 1 cm 左右的小
段；剪掉叶片外植体四周与消毒试剂接触的部分，
再剪成 1 cm2左右的小块。将 3 种外植体接种于
MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1 的诱导培
养基（添加 7.8%琼脂、25 g·L-1蔗糖）上，调节 pH
值至 5.8～6.0。培养室温度 25 ℃，光照强度 3 000
lx，光照时间 16 h·d-1。
1.2.2 单因素试验 筛选次氯酸钠和升汞的最
适浓度：以红网纹草叶片为外植体，设置次氯酸钠
1%，2%，5%和升汞 0.05%，0.10%，0.15% 3 个浓
度水平的 6组处理，每组处理均消毒 10 min，每个
处理 30瓶，每瓶接种 1个外植体，试验重复 3 次。
30 d 后，统计污染率、死亡率，筛选出最适合红网
纹草的次氯酸钠和升汞浓度。
1.2.3 L9（34）正交试验 筛选适宜的消毒试剂和
消毒时间：在单因素试验基础上，进行外植体（顶
芽、叶片、茎段）、2%次氯酸钠消毒时间（0,5,10
min）、0.10%升汞消毒时间（0,5,10 min）3 因素 3
水平的 L9（34）正交试验[3]。按照表 1、表 2共进行 9
个处理，每个处理 30瓶，每瓶 1个外植体，试验重
复 3次。30 d后，统计污染率、死亡率、成活率，进
而探究出红网纹草外植体的最佳消毒方法。
水平
因素
外植体（A） 2%次氯酸钠消毒时间 /min（B） 0.10%升汞消毒时间 /min（C）
1 顶芽 0 0
2 叶片 5 5
3 茎段 10 10
处理 1 2 3 4 5 6 7 8 9
组合 A1B1C1 A1B2C2 A1B3C3 A2B1C2 A2B2C3 A2B3C1 A3B1C3 A3B2C1 A3B3C2
表 2 L9（34）正交试验设计的 9 个处理
表 1 红网纹草外植体消毒 L9（34）正交试验设计
1.3 数据统计与分析
利用 Microsoft excel软件制表，统计污染率、死
亡率和成活率，利用 SPASS统计分析软件进行方
差分析，利用邓肯氏多重比较（Duncan’s multiple-
range test）检验其显著性，P >0.05为变化不显著，P
<0.05为变化显著，P <0. 01为变化极显著[10]。
污染率=污染的外植体数
污染的外植体数
×100%；
死亡率=死亡的外植体数
污染的外植体数
×100%；
·116·
第 8期
成活率=成活的外植体数
污染的外植体数
×100%；
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 次氯酸钠适宜浓度 在污染率、成活率指
标上，不同浓度的次氯酸钠处理之间差异均达到
极显著水平（P<0.01）。将外植体分别用 1%，2%，
5%的次氯酸钠处理 10 min，培养 30 d 后，进行观
察与统计，结果见表 3。当次氯酸钠浓度为 2%时，
其污染率为 3 组中最低值（33.3%），成活率为 3
组中最高值（66.7%），其消毒效果最佳。当次氯酸
钠浓度降低至 1%时，其污染率增加，且成活率降
低；当次氯酸钠浓度升高至 5%时，其污染率与成
活率均降低。由此可见，2%的次氯酸钠污染率最
低，能保证较高的成活率，是适合于红网纹草的最
佳消毒浓度。
2.1.2 升汞适宜浓度 在污染率、成活率指标
上，不同浓度的升汞处理之间差异均达到极显著
水平（P<0.01）。将外植体分别用 0.05%，0.10%，
0.15%的次氯酸钠处理 10 min，培养 30 d 后，进行
观察与统计，结果见表 4。经纵向比较可以看出当
升汞浓度为 0.10%时，其污染率为 3 组中最低值
（46.7%），成活率为 3 组中最高值（53.3%），其结
果为最佳。当升汞浓度降低至 0.05%时，其污染率
上升，成活率随之下降；当升汞浓度升高至 0.15%
时，虽然污染率相比较 0.05%的升汞处理低，但成
活率也处于较低水平。原因是升汞不易去除，高浓
度的升汞残留在外植体表面对其造成毒害作用致
其死亡。由此可见，0.10%的升汞污染率最低，且
对植物的毒害作用相对较小，能保证较高的成活
率，是适合于红网纹草的最佳消毒浓度。
2.2 正交试验
2.2.1 不同外植体的消毒效果 方差分析结果
表明（表 5），在死亡率、成活率两个指标上，不同
外植体的消毒效果之间差异极显著（P<0.01）。纵
向比较可发现，叶片和茎段的污染率均低于顶芽，
但茎段较叶片死亡率低且成活率高。显然，以茎段
作为红网纹草的外植体是最佳选择。
2.2.2 次氯酸钠不同消毒时间的消毒效果 方
差分析结果表明，在污染率、死亡率、成活率 3 个
指标上，次氯酸钠不同消毒时间的消毒效果都差
异极显著（P<0.01）。在污染率指标上，消毒时间 0
min 最高（表 6），达到 53.3%，消毒时间延长 5
min，污染率明显下降，达到 15.6%，下降约
37.7%。但当消毒时间继续延长 5 min，污染率略
有上升，猜测是红网纹草与次氯酸钠的化学反应
所致，但仍待进一步研究考证。当消毒时间延长至
10 min时，由于次氯酸根的强氧化性致试验材料
边缘白化以致死亡，死亡率高达 43.3%，显著高于
其他两个处理，造成试验材料的浪费。由此可见，
次氯酸钠的最佳消毒时间为 5 min。
2.2.3 升汞不同消毒时间的消毒效果 方差分
析结果表明，在污染率、死亡率、成活率 3 个指标
上，升汞不同消毒时间的消毒效果差异极显著
（P<0.01）。在污染率指标上，消毒时间为 0 min时
最高（表 7），达到 48.9%，消毒时间延长 5 min，污
染率明显下降，达到 21.1%，下降约 27.8%。消毒
次氯酸钠浓度 /% 污染率 /% 成活率 /%
1 40.0 60.0
2 33.3 66.7
5 37.8 57.8
表 3 不同浓度次氯酸钠的消毒效果统计
升汞浓度 /% 污染率 /% 成活率 /%
0.05 55.6 44.4
0.10 46.7 53.3
0.15 53.3 46.7
外植体 污染率 /% 死亡率 /% 成活率 /%
顶芽 35.6 24.4 40.0
叶片 25.6 25.5 48.9
茎段 25.6 17.8 56.7
表 4 不同浓度升汞的消毒效果统计
表 5 不同外植体的消毒效果比较
消毒时间 /min 污染率 /% 死亡率 /% 成活率 /%
0 53.3 6.7 40.0
5 15.6 17.8 66.6
10 17.8 43.3 38.9
表 6 次氯酸钠不同消毒时间的消毒效果比较
范诸平等：红网纹草组织培养外植体消毒方法研究 ·117·
第 21卷天津农业科学
时间继续延长 5 min，虽然污染率得到有效控制，
但死亡率显著上升，上升约 37.8%，达到 42.2%，
显著高于其他两个处理。猜测由于植物材料长时
间浸润于升汞中，使升汞残留外植体表面造成植
物的重金属中毒。由此可见，当升汞的消毒时间为
5 min 时，能保证较低的污染率和死亡率，是理想
的消毒时间。
2.2.4 正交试验 9 个不同处理的消毒效果 方
差分析结果表明（表 8），正交试验中 9 个不同处
理污染率、死亡率、成活率 3 个指标差异极显著
（P<0.01）。经比较，在污染率和死亡率指标上，处
理 2 均为最低值 0，且其存活率达 100%。在其余
8 组处理中，处理 3 的污染率也较低，但其死亡率
处于最高水平 73.3%，且存活率为最低水平
20.0%，易造成植物材料的浪费。处理 4~9 中，污
染率波动幅度不大，死亡率除处理 4为 0外，其余
处理均相差不大，且在这 6组中，处理 4存活率最
高也仅为 63.3%，与处理 2相比还有很大差距。由
此可见，处理 2（A1B2C2：次氯酸钠处理 5 min，升汞
处理 5 min）的污染率、死亡率最低，成活率最高，
是适合红网纹草的外植体消毒方法。
3 结论与讨论
3.1 外植体的选取
保证无菌是组织培养成功的前提和后续试验
能够顺利开展的基础，由于不同的外植体外部形
态不同，因而消毒方式和消毒效果不尽相同。试验
结果表明，茎段较顶芽和叶片污染率、死亡率较
低，成活率较高，且较易产生愈伤组织，消毒效果
较好，因而为理想的外植体。
叶片消毒效果较差可能与叶片上纤毛较多、
叶背的网脉较深，以致消毒试剂难以深入有关。顶
芽是植物最幼嫩的组织器官，所携带的微生物量比
其他器官组织相对较少，但因其过于幼嫩，又极易
被杀死，难以实现污染率和死亡率的同时降低[3]。不
同外植体的消毒效果不同，还可能与不同基因在
不同外植体的选择性表达、不同外植体经过消毒
后产生的次生物质不同有关 [11]。总之，原因较复
杂，尚需进一步试验和研究。
此外还发现，在相同激素配比的培养基中，不
同的外植体产生的愈伤组织形态不同。以叶片为
外植体时，在叶片边缘和叶脉处产生白色愈伤组
织；以茎段为外植体时，其形态学下端膨大产生绿
色愈伤组织，茎节处芽萌发形成嫩叶；以顶芽为外
植体时，顶芽下端亦膨大产生绿色愈伤组织（图
1）。原因可能为相同的外界条件下，基因在不同
部位的外植体选择性表达而产生不同的愈伤组
织，仍需进一步试验探究。
消毒时间 /min 污染率 /% 死亡率 /% 成活率 /%
0 48.9 21.1 30.0
5 21.1 4.4 74.5
10 16.7 42.2 41.1
表 7 升汞不同消毒时间的消毒效果比较
处理 组合 污染率 /% 死亡率 /% 存活率 /%
1 A1B1C1 100.0a 0f 0g
2 A1B2C2 0e 0f 100.0a
3 A1B3C3 6.7d 73.3a 20.0f
4 A2B1C2 36.7b 0f 63.3b
5 A2B2C3 20.0c 33.3c 46.7d
6 A2B3C1 20.0c 43.3b 36.7e
7 A3B1C3 23.3c 20.0d 56.7c
8 A3B2C1 26.7c 20.0d 53.3c
9 A3B3C2 26.7c 13.3e 60.0b
表 8 正交试验 9 个处理消毒效果的多重比较
图 1 叶片、茎段、顶芽作外植体时不同的愈伤组织形态
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第 8期
3.2 消毒试剂的选用和消毒时间的选择
由于基因的选择性表达，使得不同外植体的外
部形态不同，因而消毒效果不尽相同。试验结果表
明，最适宜红网纹草的消毒方式组合为 A1B2C2，即
将茎段外植体浸于 75%的酒精中消毒 30 s，倒出酒
精，倒入无菌水冲洗 1次，再在 2%的次氯酸钠中消
毒 5 min，倒出次氯酸钠并用无菌水冲洗 3次，继而
在 0.10%的升汞中消毒 5 min，倒出升汞并用无菌
水冲洗 5次。此消毒方法的污染率和死亡率最低，
存活率最高，是最适合红网纹草的消毒方式。
消毒试剂和消毒时间的选择尤为重要。在众
多消毒试剂中，本试验采用次氯酸钠和升汞进行
外植体的消毒，选择适宜的时间，能够保证较低的
污染率和死亡率，是较为理想的消毒试剂。消毒的
同时，消毒剂会破坏外植体的细胞，细胞出于自我
保护，不断地产生大量次生物质，若消毒时间过
长，会引起细胞毒害，导致外植体褐变甚至死亡 ;
若消毒时间过短，外植体则会因消毒不彻底，而导
致高污染率 [12]。因而合理的消毒时间和消毒试剂
是红网纹草外植体良好消毒效果的保证。
由图 2可看出，在单因素试验中，相同的培养
基浓度和消毒时间，单独采用升汞消毒的外植体
产生愈伤组织的时间显著长于次氯酸钠，约长 8
d。原因可能为升汞残留造成外植体内部的一系列
生理变化，延迟愈伤组织产生时间。
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图 2 次氯酸钠和升汞处理的外植体愈伤组织产生时间
范诸平等：红网纹草组织培养外植体消毒方法研究 ·119·