全 文 ：草酸对土壤胶体与矿物表面酶的吸附
及活性影响*
赵振华1, 2 黄巧云3 蒋 新2* * 王代长3 郜红建2 李学垣3
( 1 河海大学环境科学与工程学院,南京 210098; 2中国科学院南京土壤研究所,南京 210008;
3 华中农业大学资源与环境学院,武汉 430070)
=摘要> 采用平衡批处理法, 研究了模拟根系分泌物 ) ) ) 草酸溶液的浓度、pH 对酸性磷酸酶在针铁矿、高
岭石及黄棕壤和砖红壤胶体( < 2 Lm)上的吸附及比活的影响. 结果表明 ,针铁矿对磷酸酶的吸附量受草
酸浓度的影响较小, 其它供试胶体对蛋白的吸附量随草酸浓度的升高, 一般表现为先急剧降低( 0~ 5 mmol
#L - 1) ,之后逐渐升高到与对照相当或略低.这与草酸在土壤胶体和矿物表面的配位形态及其对载体表面
的电荷改变、溶解有关.草酸体系中, 供试胶体对磷酸酶的吸附顺序为针铁矿m黄棕壤> 高岭石> 砖红壤.
酶在草酸体系中的最大吸附点位一般出现在蛋白的等电点( IEP)和供试胶体的 PZC之间, 而酶在草酸体
系中被固定到供试胶体上之后, 其最适比活点随胶体类型的不同而没有变化或有所高移.
关键词 草酸 磷酸酶 土壤胶体 矿物 吸附 活性
文章编号 1001- 9332(2005) 03- 0533- 06 中图分类号 X1311 3 文献标识码 A
Effects of oxalate on acid phosphatase adsorption and its a ctivity on soil colloids and minera ls. ZHAO Zhen2
hua1, 2, HUANGQiaoyun3 , JIANGXin2 , WANG Daizhang3, GAOHongjian2, LI Xueyuan3 ( 1College of Environ2
mental Science and Enginning, H eha i University , Nanj ing 210098, China ; 2 Institute of Soil Science, Chinese
Academy of Sciences, Nanjing 210008, China ; 3Huazhong Agr icultur al University , Wuhan 430070, China ) .
2Chin. J . Appl . Ecol . , 2005, 16( 3) : 533~ 538.
By a batch method, this paper studied the effects of different concentration and pH of oxalate, an important root
exudate, on the adsorption of acid phosphatase and its activity on < 2 Lm colloids of yellow brown soil and
latosol, and on minerals goethite and kaolinite. The results showed t hat the acid phosphatase adsorption by
goethite was less affected by the concentration of oxalate; while the adsorbed amount of this enzyme by the other
test colloids and kaolinite was sharply decreased with the increasing oxalate concentration ( 0~ 5 mmol# L - 1 )
first , and then gradually increased to the level equal to or less than the blank, which may be related to the coordi2
nation type of oxalate on soil colloids andminerals, and their surface charge change and dissolution. In the systems
oxalate existed, the adsorbed amount of acid phosphatase by soil colloids and minerals decr eased in order of
goethitemyellow brown soil > kaolinite > latosol. The pH value for t he maximum adsorption of acid phos2
phatase was between the IEP of the enzyme and the PZC of test colloids and minerals. After the enzyme was im2
mobilized on colloids and minerals, t he pH of its maximum specific activity had no change, or shifted to a higher
value.
Key words Oxalate, Phosphatase, Soil colloid, Minerals, Adsorption, Activity.
* 国家重点基础研究发展规划项目( 2002CB410805)、中国科学院王
宽诚博士后工作奖励基金项目、国家自然科学基金项目( 40271064)、
中国博士后基金项目和河海大学创新基金资助项目.
* * 通讯联系人.
2004- 01- 15收稿, 2004- 07- 13接受.
1 引 言
土壤中的一切生化反应都是在酶的参与下进行.
土壤酶是土壤中物质转化的重要生物化学催化
剂[4, 7, 14, 31].磷酸酶在土壤磷的转化、循环中起着重要
作用. 酶在土壤中的存在状态直接影响到其活
性[5, 12, 18] .酶在土壤固相表面的吸附固定既决定于酶
本身的性质[ 18, 21]和胶体表面特性[14] ,还受到一系列
环境条件及体系中共存的各种无机和有机离子的影
响[5~ 7, 15, 30, 32] .在土壤体系特别是根际土壤中, 各种
低分子量有机酸数量丰富, 种类较多[ 9, 21, 22, 24, 25], 在
逆境特别是营养胁迫下,酶与低分子量有机酸往往共
存于植物的根际微环境中[ 3, 22, 23, 26~ 28] . 草酸作为其
中的一种典型的酸类,对蛋白质、酶分子的存在状况
及其与胶体的相互作用势必产生影响. 以往关于酶在
土壤胶体或矿物表面的吸附及活性研究多考虑酶及
矿物表面的性质,很少涉及体系中共存的阴离子的影
响.而这方面的研究对于深入探讨土壤成分相互作用
机理,阐明影响土壤酶活性的有关因素, 提高土壤肥
应 用 生 态 学 报 2005 年 3 月 第 16 卷 第 3 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Mar. 2005, 16( 3)B533~ 538
力水平和环境质量等具有重要的理论和实际意义.本
研究旨在探讨草酸存在时,两种可变电荷土壤及其常
见的几种粘粒矿物胶体对酸性磷酸酶的吸附及活性
的影响.
2 材料与方法
211 供试材料
21111 酶试剂酸性磷酸酶 [EC 3. 1. 3. 2, Type II , 0. 8 units#
mg - 1, from potato,分子量约 100 kDa[ 19] ]购于 Sigma 公司.
21112 土壤胶体和矿物制备 黄棕壤采自湖北孝感 Q3 母质
发育的水稻土( 0~ 20 cm) ;砖红壤采于海南东山峙花岗岩发
育的荒地( 17~ 35 cm) ;高岭石为化学试剂(上海三浦化工有
限公司生产) . 以上土壤和矿物制成悬浊液后以 0. 1 mol#L - 1
的 NaOH 调 pH 至中性, 超声波分散, 沉降法分离< 2 Lm的
粘粒,用 0. 5 mol#L - 1的 CaCl2絮凝, 去离子水和酒精洗至无
Cl- , 45 e 烘干, 研磨,过 100 目筛, 得到供试< 2 Lm的土壤
胶体及粘粒矿物.
针铁矿按 Atkinson 方法[ 1]合成, 电渗析除去游离的离
子, 45 e 下干燥 24 h,过 100 目筛备用. 制备的土壤胶体和
粘粒矿物的主要性状列于表 1.
表 1 土壤胶体和粘土矿物某些基本性质
Table 1 Some propert ies of test soil colloid and clay minerals
粘粒矿物
Clay
minerals
有机质
Organic
matter
( g# kg- 1)
比表面
Special
surface
(m2#g- 1)
电荷
零点
PZC
矿物组成
Mineral composition
高岭石
Kaolinite
20 31 61 高岭石 Kaolinite
针铁矿
Geothite
83 81 27 针铁矿 Geothite
黄棕壤
Yellow brown soil
101 9 245 219 伊利石 Illite( 63% )、11 4 nm矿物
minerals( 19% )、高岭石 Kaolinite
( 14% )、游离氧化铁 Free iron ox2
ide( 4% )
砖红壤
Latosol
51 86 84 31 85 高岭石 Kaolinite( 86% ) , 伊利石
Illite和三水铝石 Gibbsite(微量) ,
游离氧化铁 Free iron oxide( 9% )
21113 土壤胶体和粘粒矿物悬浊液制备 称取 215 g 土壤胶
体于锥形瓶中, 加适量去离子水, 以 011 mmol# L - 1盐酸或
NaOH 每隔 2 h 调悬浊液的pH ,直至稳定在 5. 5(约需1 周) ,
定容到 250 ml[ 13] .
212 研究方法
21211 酶含量测定 采用 Folin2酚试剂法[ 11] .吸取012 ml含
0~ 600 Lg#ml- 1的酶溶液于玻璃试管中, 加入 1 ml的福林试
剂甲,摇匀, 室温下放置 10 min, 加入 011 ml的福林试剂乙,
立即混匀,于 40 e 水浴中恒温 30 min, 以不含酶的试剂空白
为对照,在 VIS27220 型分光光度计上比色测定,测定波长为
650 nm.
21212 土壤胶体和粘粒矿物对酸性磷酸酶的吸附[ 6] 在磁
力搅拌下吸取土壤胶体或粘粒矿物悬浊液 1 ml于 10 ml的
离心管中,加 0~ 2 000 Lg#ml- 1、pH 51 5的酶溶液1 ml,然后
加入 1 ml pH 5. 5、0~ 150 mmol# L - 1以 0. 15 mol# L - 1 NaCl
作支持电解质的草酸溶液. 25 e 下振荡 3 h,静置 1 h, 12 000
r#min- 1下离心,用 Folin2酚试剂法测定上清液中酶的含量.
各体系中加入酶的总量扣除上清液中的酶量, 即为土壤胶体
或矿物对酶的吸附量.
21 21 3 不同 pH 土壤胶体和粘粒矿物对酶的吸附及活性试验
分别配制 pH 215~ 71 0, 100 mmol# L- 1的系列草酸溶液,
其它试验步骤和操作方法同 21211 和 21212. , 但土壤胶体
和高岭石的水土为 100,水针铁矿= 125.离心后得到的固体
残留物+ 3 ml去离子水, 涡旋振荡仪和超声波充分分散后,
立即吸取 0103 ml该悬液于玻璃试管中, 加 pH 515 的对硝
基苯磷酸二钠2乙酸溶液 1 ml, 于 37 e 水浴中恒温 30 min,
立即加入 1 ml 1 mol# L - 1的 NaOH 终止酶反应. 稍微静置,
离心, 生成产物对硝基苯酚的浓度直接在分光光度计上 405
nm处测定[ 19] . 所测酶活性与待测酶量的比值即为此时固定
化酶的比活.
以上试验均设 3 次重复. 数据均为 3 次重复的平均值.
3 结果与讨论
311 不同草酸浓度中土壤胶体和粘粒矿物对酸性
磷酸酶的吸附等温曲线
在供试的草酸浓度范围, 土壤胶体和粘粒矿物
对酸性磷酸酶的吸附等温曲线均符合 Langmuir 方
程( R2> 0195,表 2) : X= BmaxKC/ (1+ KC) .其中,
X 是单位吸附载体对溶质的吸附量, Bmax是溶质的
最大吸附量, K 是与吸附结合能有关的常数, 与吸
附亲和力常数是倒数关系, C是溶液中溶质的平衡
浓度.
由图1可见, 根据Giles[ 8]对吸附等温曲线的分
图 1 不同草酸浓度土壤胶体和矿物对磷酸酶的吸附等温线
Fig. 1 Adsorpt ion isotherm of phosphatase on soil colloid an d clay miner2
als in oxalate system.
a)针铁矿 Goethite; b)黄棕壤 Yellow brown soil; c)高岭石 Kaolinite; d)
砖红壤 Latsol.下同 The same below.草酸浓度 Concent ration of oxalate:
1) 0 mmol#L- 1; 2) 5 mmol#L- 1;3) 35 mmol#L- 1; 4)50 mmol#L- 1.
534 应 用 生 态 学 报 16卷
类,酶在各供试土壤胶体和粘粒矿物上的吸附曲线
类型随草酸浓度的升高, 除针铁矿为典型的 L1 型
外,其它供试胶体上的吸附曲线类型均由高亲和力
的H 型或 L2型向较低亲和力的 L1型转化,草酸浓
度继续升高, 则等温线又转化为 L2 型. 表 2的吸附
结合能常数 K 呈先升高后降低的变化,说明草酸浓
度的升高使酶在矿物表面的吸附亲和力先降低( 0~
5 mmol#L- 1) ,之后逐渐升高( 5~ 50 mmol#L- 1) .
表 2 磷酸酶在土壤胶体和粘粒矿物上吸附等温拟合 Langmuir 方
程参数
Table 2 Langmuir parameter s for adsorption of phosphatase on soil col2
loid and clay minerals
土壤胶体和粘粒矿物
Soil colloid and minerals
参 数
Parameters
草酸浓度
Oxalate concentration( mmol# L- 1)
0 5 35 50
针铁矿 Bmax 26216 32918 339 28714
Geot hite K 371 8 601 7 981 4 911 8
R2 01995 01989 01999 01995
黄棕壤 Bmax 11916 64185 10715 73128
Yellow brown soil K 81787 35165 25180 32172
R2 019964 01 9493 01 9691 01 9408
高岭石 Bmax 721 8 781 2 651 2 771 1
Kaolinit e K 611 10314 271 4 411 6
R2 01954 01948 01989 01998
砖红壤 Bmax 691 1 0156 491 8 621 4
Latosol K 101 4 501 3 191 2 541 5
R2 01964 01950 0199 01995
312 不同草酸浓度对磷酸酶在土壤胶体和粘粒矿
物上吸附行为的影响
由图 2可见,当酶加入量为 1 000 Lg时, 除针铁
矿外, 不同草酸浓度影响下的磷酸酶的吸附趋势整
体上表现为 0~ 5 mmol#L- 1,吸附量先急剧下降,之
后随草酸浓度升高,吸附量也逐渐升高到与对照相
等或略低的水平,其中黄棕壤和高岭石比较显著. 这
与等温吸附的结果相一致, 说明不同草酸浓度影响
了酶与吸附载体之间的吸附结合能.
图 2 不同草酸浓度磷酸酶在土壤胶体和矿物表面的吸附
Fig. 2 Adsorpt ion of phosphatase on soil colloids and minerals in different
concentrat ion oxalate solut ion.
一般认为, 草酸主要通过羟基配位交换和静电
作用吸附在土壤胶体、矿物表面,而酶可通过专性吸
附(即羟基配位交换)、疏水力、静电力、范德华力和
氢键等多种作用吸附在土壤胶体、矿物表面[ 18, 20] .
低浓度时,草酸主要以双配位形态吸附在胶体表面;
当浓度较高时,草酸也可以相对较弱的单配位复合
物( SOOC2COOH)吸附在胶体表面[16, 17] . 酶可通过
与土壤胶体表面的单配位草酸竞争来增加吸附量,
而很难与吸附结合能较高的双配位草酸发生交换吸
附.同时,草酸在胶体表面的吸附及配位形态的不同
都可导致胶体表面电荷的变化.
专性吸附在铁铝氧化物对酶的吸附中占主导地
位,但静电力也对其吸附产生较大影响[5, 7, 13, 15, 20].在
pH 515,针铁矿荷正电,草酸的双基配位降低其表面
正电荷,可减少荷负电酶( IEP= 510)的吸附;当草酸
浓度增高到使其配位形态转化为单基时,酶虽可通过
交换单基配位草酸增加吸附量,但单基配位草酸上游
离羧基解离( pKa1= 112, pKa2= 4119)产生的负电荷,
又可降低酶的吸附量,因而针铁矿上酶的吸附整体表
现为逐渐下降.对于以层状硅酸盐矿物为主的土壤胶
体和高岭石来说,最初低浓度草酸的双配位吸附会导
致其表面正电荷大量减少,负电荷少量增加[29] ,可大
量减少酶的吸附,此时酶主要以疏水性作用力吸附在
土壤胶体的表面,当草酸浓度升高,单基配位草酸使
土壤胶体、高岭石表面的负电荷进一步增加,虽不利
于酶的吸附,但矿物溶解产生的吸附点位及通过置换
草酸增加的酶吸附量可能超过了负电荷的影响,因而
酶在该类土壤胶体、高岭石表面的吸附随着草酸浓度
的升高呈先降后升的趋势.
由图 2可以看出, 在草酸体系中,供试的各土壤
胶体和粘粒矿物对酶的吸附量大小顺序为:针铁矿
> > 黄棕壤> 高岭石> 砖红壤( P < 0101) . 可见以
羟基化表面为主的针铁矿对酶的吸附占有绝对优
势,但相对于乙酸体系,草酸对酶的吸附抑制仍增加
了 10%左右[32] ;黄棕壤中较高含量的有机质( 1019
g#kg- 1,表 1)与游离氧化铁( 4% ,主要以针铁矿为
主[ 10] ) ,以及较高的比表面积都有利于酶的吸附,因
此其对酶的吸附量仅次于针铁矿;砖红壤中虽含较
多游离氧化铁, 但主要以活性较低的赤铁矿为
主[ 10] ,而且可能以胶膜的形式包被在土壤胶体表
面.这种状况既影响酶在高岭石等硅氧烷表面的疏
水性吸附,也使土壤胶体易因草酸对处于矿物边面
或包膜中 AlOH 及 FeOH 的配位, 而影响对酶的吸
附[ 5, 7, 15] .因此砖红壤对酶的吸附量低于高岭石.
313 不同草酸浓度土壤胶体和粘粒矿物对酶的吸
附
由图 3可见, 随着 pH 升高,酶在针铁矿上的吸
5353 期 赵振华等:草酸对土壤胶体与矿物表面酶的吸附及活性影响
图 3 不同 pH 草酸体系中磷酸酶在土壤胶体和矿物的吸附
Fig. 3 Adsorpt ion of phosphatase on soil colloids and minerals in different
pH oxalate solution.
附量几乎未发生变化;而酶在其它供试胶体上则表
现为先逐渐升高,之后吸附量逐渐降低,整体曲线类
似于/钟形0,均在 pH 3. 8左右达到最大吸附, 该区
域位于酶的等电点( IEP)和供试胶体的 PZC之间
(表 1) .
Bhatt i等[2]发现, 一种含有高岭石、三水铝石和
羟基层间蛭石的土壤胶体对草酸的吸附中, 在 pH
3. 5时形成了单配位和双配位表面复合物, 但在 pH
4. 5和 5. 5时形成了双配位表面复合物. 对针铁矿
而言,在供试 pH 范围内均荷正电( PZC= 8127) , 当
pH 低于 510 时, 酶( IEP= 510)与针铁矿带相同正
电荷,静电排斥不利于酶的吸附,而酶对单配位草酸
的取代又可增加吸附量. 两种作用导致酶的吸附量
没有较大降低, 当 pH 高于 510时,酶与针铁矿带异
号电荷,虽有利于酶吸附,但双配位草酸又使酶吸附
量减少.因此在整个供试 pH, 针铁矿对酶的吸附量
没有太大变化. 而对于以层状硅酸盐矿物为主的土
壤胶体和高岭石,当 pH< 310 时, 土壤胶体与酶均
带正电,静电排斥使酶的吸附略有降低,但其它作用
力仍可维持酶较高吸附量;当 pH= 310~ 510时, 两
者带异号电荷, 静电吸引及酶与单配位草酸的竞争,
都有利于酶吸附.酶在这类土壤胶体、矿物表面的最
大吸附点一般出现在该区域, pH 继续升高, 带相同
负电荷的酶与土壤胶体以及双配位的草酸, 都使酶
的吸附量迅速降低, 使酶的吸附曲线类似/钟形0.
314 土壤胶体和粘粒矿物表面固定化酶的比活
酶的比活计算公式为: S = Asum/XT . 其中, S
是酶的比活,以单位时间单位质量酶所产生的对硝
基苯酚的量表示, Asum是样品中酶的总活性, X 是
酶在矿物表面的吸附量, T 是反应的时间. 由图 4
可见, 草酸体系中, 针铁矿上酶的比活最高, 与 Qui2
quampoix的相类似[18] ,针铁矿的羟基化表面可能有
利于酶活性的保留;砖红壤上酶的比活稍高于高岭
石,这可能与砖红壤中较高比例( 9% )的游离氧化铁
有关;而黄棕壤上酶的残留比活最低,其组成中较高
含量的伊利石( 63%)及有机质( 1019%)可能是其上
固定化酶活性较低的原因.因为伊利石比高岭石具
有更高的抑制酸性磷酸酶活性的能力[4] .
图 4 不同 pH 草酸体系中固定化磷酸酶比活
Fig. 4 Specific act ivity of immobilized phosphatase in different pH ox2
alate solut ion.
随着体系 pH 的升高, 黄棕壤、高岭石、砖红壤
上酶的比活分别在 pH 519、510和 417 左右达到最
大,针铁矿上酶的最大比活点有两个, 首先在 pH
417左右达到一个最大比活点, 之后固定化酶的比
活逐渐降低,在 pH 517经过最低比活点后,酶的比
活又转而升高.可见酸性磷酸酶在草酸体系中被固
定到胶体表面后, 其最适比活随胶体类型的不同而
没有变化或有所高移(供试酸性磷酸酶在游离状态
时的最适比活在 pH 418左右) .
315 不同 pH 对酶在土壤胶体和粘粒矿物表面的
吸附与比活机理
对图 3和图 4比较可见, 随着 pH 的升高,酶的
吸附量与比活的变化呈相反趋势(图 5) . 影响固定
化酶比活的因素主要有: 1)酶分子构型的改变; 2)立
体位阻及底物、产物的扩散限制; 3)固定化酶周围的
微环境; 4)酶在固定化载体上的拥挤度. 体系中的
pH、温度、吸附载体的表面特性及作用力都可引起
被吸附蛋白或酶构型的改变[18, 21] . 对针铁矿而言,
不同 pH 中酶的吸附量并无太大变化(酶分子间拥
挤度也变化不大) , pH 较低时,对酶比活产生的影响
主要是体系中过量质子对酶构型干扰而导致的酶部
分或全部失活, pH 较高时, 针铁矿表面的 FeOH2+
可能延缓了 OH- 对酶构型的干扰,使其上的酶保持
较高活性.对于以层状硅酸盐矿物为主的供试土壤
胶体和高岭石,酶的吸附随 pH 变化出现了较典型
536 应 用 生 态 学 报 16卷
图 5 不同 pH 磷酸酶在土壤胶体和矿物表面的吸附及比活变化
Fig. 5 Mechanism of phosphatase adsorpt ion and specific activity on soil
colloids and minerals in different pH oxalate solut ions.
1)酶吸附曲线 Enzyme adsorpt ion curve; 2) 酶比活曲线 Enzyme spe2
cific act ive curve. 3)带电荷的本体和去折叠酶分子 The nat ive and un2
folded enzyme molecular with elect ric charge; 4)粘粒矿物 Clay miner2
al; 5)草酸 Oxalate.
的/钟形0曲线. 此外,矿物表面酶的拥挤度也发生改
变. pH< 310时,大量质子的存在可破坏维持蛋白构
型的氢键,使酶变性失活(图 4) ; pH 310~ 510时, 酶
虽可保持较高的吸附量, 但固定化酶分子间较高的
拥挤度、静电引力引起酶构型的改变都不利于酶活
性达到最高;当 pH 为 510左右时,酶表面电荷呈现
中性, 即使被吸附在胶体表面也利于保持它自身的
构型, 且此时酶吸附量的减少降低了酶的表面拥挤
度,因而酶的比活可达到最高. 但当 pH 继续升高,
酶与胶体矿物表面均带负电荷, 且草酸主要以双配
位为主,这些既不利于酶在胶体表面的吸附, 也不利
于酶自身构型的稳定以及构成活性中心的氨基酸的
解离,使酶的比活又逐渐降低.
4 结 论
草酸存在下,针铁矿对酶的吸附量受草酸浓度
的影响较小,其它供试胶体对蛋白的吸附随草酸浓
度的升高一般表现为先急剧降低 ( 0 ~ 5 mmol#
L- 1) ,之后逐渐升高到与对照相当或略低. 草酸体
系中,供试胶体对酶的吸附顺序为针铁矿 m黄棕壤
> 高岭石> 砖红壤.酶的最大吸附点一般出现在蛋
白的等电点( IEP)和供试胶体的 PZC之间, 而酸性
磷酸酶在草酸体系中被固定到矿物胶体上后, 其最
适比活随胶体类型的不同而没有变化或有所高移.
参考文献
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作者简介 赵振华, 男, 1973 年生,博士后, 主要从事土壤环
境生物化学及污染控制研究, 发表论文 10 余篇. Tel: 0252
86881193; E2mail: 2zh4000@mail. tom. com
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