全 文 ：小球藻细胞活性物质的提取及对啤酒酵母的生理效应 3
胡开辉 3 3 　周山勇
(福建农林大学生命科学学院 ,福州 350002)
Extraction of active substance from Chlorella vulga ris cells and its physiological effects on Saccha romyces cere2
visiae. HU Kaihui , ZHOU Shanyong ( School of L if e Sciences , Fujian A griculture and Forest ry U niversity ,
Fuz hou 350002 , China) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2005 ,16 (8) :1573～1576.
The study showed that freezing2thawing method could have a higher cellwall breakage rate ,and a light injury to
the active substance ,which could not only increase the cell fission and growth ,delay the death of S accharomycete
cells ,but also enhance CO2 production rate and quicken fermentation process when the cells were exposed to the
medium with 0. 5 % active substance.
Key words 　Chlorella vulgaris ,Active substance ,Extraction , S accharomycete ,Physiological effects.
文章编号 　1001 - 9332 (2005) 08 - 1573 - 04 　中图分类号 　TS262 　文献标识码 　A
3 国家自然科学基金项目 (30471028、30200170) 和福建省教育厅资
助项目 ( K04042) .3 3 通讯联系人.
2004 - 08 - 16 收稿 ,2004 - 12 - 15 接受.
1 　引 　　言
小球藻 ( Chlorella vulgaris) 为绿藻门普生性单细胞藻
类 ,因其具有极为丰富均衡的营养成分 ,常作为医疗保健
品[3 ,5 ,28 ] ,或用于食品、轻工业以及饲料添加剂 ,并可用于重
金属的生物吸附[7 ,13 ,16 ,21 ,23 ] 、污水处理[10 ,20 ,24 ] 及环境评
价[17～19 ,27 ,29 ] 等方面. 小球藻生长因子 ( Chlorella Growth
Factor ,CGF)又称小球藻精 ,为其细胞活性物质 ,含有氨基
酸、核酸、多糖、多肽、蛋白质、酶、维生素、矿物质等成分[3 ] ,
被誉为“类荷尔蒙”[11 ] . 国外对其医疗功能有较多的研究 ,其
药理作用主要有激活淋巴细胞、增强人体免疫能力、活化人
体细胞、加快儿童生长发育、抵抗外来疾病入侵和促进人体
受伤组织修复等. CGF 对有机物、重金属中毒具有迅速康复
作用 ,还能防治胃溃疡、高血压和心血管等疾病 [2 ,12 ] . 近来 ,
小球藻生长因子提取技术及其生理活性研究成为英、美、日
等国家和我国台湾地区的研究热点 [4 ,26 ,30 ] . 本文在比较几种
小球藻破壁方法的基础上 ,研究其活性提取物对啤酒酵母
( S accharomycete cerevisiae) 的生理效应 ,以期为今后将其应
用于酵母工业、提高酵母菌产率、缩短生产周期及降低生产
成本等提供理论依据.
2 　材料与方法
211 　材料
以粉核小球藻 ( Chlorella vulgaris) (福建莆田神州生物
公司提供) 、啤酒酵母 ( S accharomycete cerevisiae) (本校微生
物实验室保存) 为供试材料. 粉核小球藻培养基为 NH4Cl
01475 g , KH2 PO4 01136 g ,CaCl2 0102 g ,EDTA 01001 g ,Mg2
SO4 01024 g ,Na2CO3 01002 g ,加水至 1 000 ml ,调 p H710 ,
121 ℃高压灭菌 30 min. 啤酒酵母采用麦芽汁培养基 :称取
500 g 麦芽粉 ,加水至 2 000 ml ,于水浴锅内 65 ℃糖化 2 h ,
双层纱布过滤 ,滤液煮沸 30 min ,4 层纱布过滤 ,用糖度计测
定外观浓度为 12 Bx ,分装 ,121 ℃湿热灭菌 30 min 备用. 崩
解液 :NaCl 019 g ,Na2 HPO4·2H2O 2161 g ,柠檬酸·H2O 0136
g ,加水至 100 ml ,121 ℃高压灭菌 30 min.
212 　小球藻细胞活性物质的提取
21211 纯种培养与收集 　按 1∶10 接种小球藻 ,28 ℃光照培
养 1 周 ,长至浓绿 ,无菌条件下取 500 ml 摇匀 ,离心 10 min
(4 000 r·min - 1) ,弃上清液 ,沉淀用无菌水离心洗涤 3 次 ,得
纯净无菌藻泥.
21212 破壁方法 　1)机械匀浆破壁法 :用无菌水将无菌藻泥
稀释 ,使小球藻的密度达到 1 010 CFU·ml - 1 ,无菌条件下用
高速组织捣碎机匀浆 30 s(12 000 r·min - 1) ,3 次重复 ,取样 ,
显微镜下用血球计数板计数 ,统计完整细胞数 ;2) 机械研磨
破壁法 :将无菌藻泥在研钵中加少量石英砂研磨 30 min ;3)
超声波破壁法 :用超声波破碎仪进行处理 ;4) 冻融破壁法 :
用崩解液将无菌藻泥稀释 ,将样品置 4 ℃冰箱预冻 2 h ,再置
- 22 ℃冰箱冷冻过夜 ,次日取出 ,加水融化 ,融化至一半时
剧烈振摇 30 min ,再放回 - 22 ℃冰箱冷冻过夜 ,重复 12 次.
21213 细胞活性物质的提取 　将破壁后的小球藻转移至无
菌离心管中 ,8 000 r·min - 1离心 15 min ,上清液移至无菌透
析袋透析除盐 ,得细胞活性物质浓缩液. 用 1 ml 无菌注射器
以 015 ml·支 - 1分装至 2 ml 安培瓶中 ,冷冻干燥无菌封口 ,
得细胞活性物质冻干品 (图 1) .
213 　啤酒酵母生长测定
21311 泡沫变化 　取 7 支装有 9 ml 麦芽汁培养基的试管 ,每
支分别接种 1 ml 啤酒酵母菌液 ,按 210 %、110 %、015 %、
0125 %、011 %、0105 %加入细胞活性物质冻干品 ,摇匀 ,28
℃恒温箱培养 48 h ,观察泡沫高度变化 ,3 次重复.
应 用 生 态 学 报 　2005 年 8 月 　第 16 卷 　第 8 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY , Aug. 2005 ,16 (8)∶1572～1576
图 1 　小球藻活性物质冻干品
Fig. 1 Products of active substance from Chlorella v ulgarisby freezing2
dry method.
21312 CO2 失重测定 　取 6 瓶装有 100 ml 麦芽汁培养基的
三角瓶 ,每瓶分别接种 1 ml 啤酒酵母菌液 ,取 1 瓶作为对
照 ,另 5 瓶分别加入细胞活性物质 1、015、0125、011 和 0105
g ,摇匀 ,28 ℃恒温箱培养 ,每 6 h 称重一次 ,直至恒重 ,3 次
重复.
21313 菌体量测定 　取 3 支装有 9 ml 麦芽汁培养基的试管 ,
每支分别接种 1 ml 啤酒酵母菌液 ,取 1 支作为对照 ,另 2 支
分别加入 011 和 0105 g 的细胞活性物质冻干品 ,摇匀 ,28 ℃
恒温箱培养 ,于 24 和 48 h 取样计数 ,3 次重复.
21314 酵母菌死亡率测定 　取 3 支装有 9 ml 麦芽汁培养基
的试管 ,每支分别接种 1 ml 啤酒酵母菌液 ,取 1 支作为对
照 ,另 2 支分别加入 011 和 0105 g 的细胞活性物质冻干品 ,
摇匀 ,28 ℃恒温箱培养. 发酵 7 d 后 ,置 4 ℃冰箱保存 ,于
30、60 和 90 d 取样制片 (加次甲基蓝染色) ,并用血球计数板
统计染色酵母菌数 ,计算酵母死亡率 ,3 次重复. 啤酒酵母菌
死亡率 = 染色酵母菌数/ 总菌数 ×100 %.
21315 比生长率计算 　 U = (ln N t2 - ln N t1) / ( t2 - t1)
214 　数据处理
实验数据采用 SPSS软件分析和处理 [6 ,14 ,22 ] .
3 　结果与分析
311 　不同破壁方法的效果比较
小球藻体积小 ,细胞壁坚固 ,破壁较难 ,破壁成为提取活
性成分的关键.从表 1 可以看出 ,超声波法、冻融法与机械匀
浆法、机械研磨法相比差异达到极显著水平 ,机械匀浆法与机
械研磨法差异不显著.可见 ,以冻融法破壁效果最佳 (图 2) .
表 1 　不同小球藻破壁方法的效果
Table 1 Effect of diffferent methods to break cell wall
方法
Methods
匀浆法
Homogenate
研磨法
Grinding
超声波法
Ultrasonic
wave
冻融法
Froze2
thawing
破壁率 ( %)
Broken rates 11A 6A 30B 90C
破壁率 = (细胞总数 - 完整细胞数) / 细胞总数×100 % Broken rates =
( Total number of cell - complete cell number) / total number of cell ×100 % ;
表中数据为 3 次平均值 Data in the table were the average values of three
replications ;不同字母表示差异显著( P < 0101) Different letters represent
significantly different at 0101 level1 下同 The same below1
图 2 　冻融法的破壁效果
Fig. 2 Effect of froze2thawing method on C. v ulgaris celll wall.
312 　细胞活性物质对发酵过程酵母菌数的影响
从表 2 可以看出 ,不同浓度小球藻活性物质对酵母的生
长具有显著影响 ,其比生长速率明显高于对照. 在培养基中
添加 015 %的提取物 ,发酵 24 h 后啤酒酵母菌数是对照的
118 倍 ,48 h 后是对照的 618 倍. 说明细胞活性物质具有提
高酵母菌细胞分裂速度和促进生长的作用 (图 3) .
图 3 　细胞活性提取物对酵母生长的影响
Fig. 3 Effects of adding active substance from C. v ulgaris on the growth
of S . cerevisiae.
表 2 　细胞活性物质对发酵过程啤酒酵母菌数的影响
Table 2 Effect of active substance from cells on the amount of
S1 cerevisiae in fermentation process
项目
Treatments
比生长速率
Specific growth rate
(u·d - 1)
0～24 h 24～48 h
细胞数
Numbers
(105CFU·ml - 1)
0 h 24 h 48 h
CK 2123 2178 0112 1112 18
0125 % 2144 4121 0112 1138 93
015 % 2172 4122 0112 1183 125
313 　细胞活性物质对啤酒酵母发酵过程中产生泡沫的影响
从图 4 和图 5 可以看出 ,细胞活性物质具有促进啤酒酵
母的发酵、提高啤酒酵母产气量的作用 ,且泡沫高度随活性
物质添加量的增加而增加. 当添加量达到 015 %以上时 ,增
加量趋于平缓.
314 　细胞活性物质对啤酒酵母发酵过程中 CO2 失重影响
由图 6 可见 ,在加入细胞活性物质的培养基中 ,啤酒酵
母发酵产生的 CO2 与对照不同 ,并且随着添加量的增加 ,
CO2 失重增加. 当添加量达到 015 %以上时 ,失重增加量趋
于平缓 ,表明适量的小球藻活性提取物有利于提高酵母对糖
类物质的利用和产酒精能力.
4751 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　16 卷
图 4 　细胞活性物质对啤酒酵母发酵过程中产生泡沫的影响
Fig. 4 Effect of active substance from C. v ulgaris on foamy height in
the fermentation process of S . cerevisiae .
图 5 　泡沫高度与细胞活性物质添加量的关系
Fig. 5 Relationship between foamy height and active substance dosage.
图 6 　啤酒酵母发酵过程中 CO2 失重与细胞活性物质添加量的关系
Fig. 6 Relationship between the loss of CO2 and active substance dosage
in the fermentation process of S1 cerevisiae.
315 　细胞活性物质对啤酒酵母菌死亡率的影响
从表 3 可以看出 ,加入 0125 %和 015 %的细胞活性物质冻
干品 ,酵母菌 30 d后的死亡率分别比对照减少 34 %和 50 % ,60
d后分别比对照减少 20 %和 34 % ,90 d 后分别比对照减少 13 %
和 27 % ,表明小球藻活性提取物能延长该酵母的保存期.
表 3 　细胞活性物质对啤酒酵母菌死亡率的影响
Table 3 Effect of active substance from cells on the morality rate of
S1 cerevisiae
处理
Treatments
酵母菌死亡率
Morality rate of S1 cerevisiae ( %)
30 d 60 d 90 d
CK 21 30 45
0125 % 14 24 39
015 % 10 21 33
4 　讨 　　论
目前 ,小球藻的破壁提取主要采用机械匀浆法、机械研
磨法、超声波法、酶解法以及酸碱浸提法等. 酶解法效果较
好 ,但成本较高 ,难以在生产上推广应用. 机械匀浆法、机械
研磨法、超声波法等由于小球藻的细胞壁为坚固的纤维素 ,
且体积微小 ,破壁率低 ,不能充分利用. 酸碱浸提法产率较
高 ,但活性物质易被破坏. 通过对小球藻几种破壁方法的比
较发现 ,细胞冻融法破壁率较高 ,且能最大程度地保持小球
藻活性成分的活性 ,活性物质损伤少 ,提取工艺简单. 冻融法
破壁率高的主要原因可能是反复冻融小球藻使其细胞壁结
为冰晶 ,而后又解冻 ,连续处理多次使小球藻细胞壁被拉伤 ,
通透性增加 ,细胞较易破裂 [15 ,25 ] .
小球藻细胞活性物质含有氨基酸、多糖、蛋白质、维生素
等功能成分 , 具有活化细胞 , 促进细胞生长和分裂作
用[1 ,8 ,9 ,25 ,31 ] .对小球藻细胞活性物质对啤酒酵母生理效应
的研究表明 ,小球藻细胞活性物质可显著增加啤酒酵母发酵
过程中的酵母菌数 ,促进啤酒酵母的生长和繁殖 ,加速酵母
发酵进程 ,增加酵母发酵的泡沫高度、产气量 ,缩短酵母菌发
酵的延滞期 ,快速启动发酵 ,提前到达产气高峰. 同时 ,小球
藻提取物能提高酵母发酵过程抗杂菌能力 ,且细胞活性物质
可以使酵母菌的降糖更彻底、糖的利用率更高. 此外 ,添加小
球藻细胞活性物质还可延缓酵母菌的死亡时间 ,在酵母工
业、酿酒工业生产上具有良好的应用前景. 今后还需进一步
对小球藻活性成分进行分离鉴定 ,并深入探讨其活性成分对
酵母菌的生理效应及其作用机理.
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作者简介 　胡开辉 ,男 ,1962 年生 ,副教授. 主要从事微生物
生态和食用真菌的教学与科研工作 ,发表论文 8 篇. E2mail :
hukh62 @sohu. com
6751 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　16 卷