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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 8 期
结缕草胁迫诱导型启动子 Rd29A的克隆及功能鉴定
王莹1 罗国坤2 韩烈保3
(1贵州科学院生物研究所，贵阳 550009;2贵州省惠水县畜牧局，惠水 550600;3北京林业大学草坪研究所，北京 100083)
摘 要: 以结缕草基因组 DNA为模板，根据已报道 Rd29A启动子序列设计了一对特异引物，在优化的 PCR反应条件下
扩增出了 Rd29A 启动子的基因片段，通过序列分析与文献报道的基因序列有 41. 65%的同源性。在 GenBank 上的登录号为
EU346948。利用 GFP基因作为报告基因，构建了用于比较鉴定所克隆启动子活性的 pBIG(35S-GFP)和 pBIRG(Rd29A-GFP)
两个植物表达载体，进而采用基因枪法对洋葱表皮细胞进行遗传转化，检测 Rd29A 启动子在受体细胞中调控基因表达的活
性。结果表明，克隆到的 Rd29A启动子活性强于组成型的 35S启动子，利用 GFP瞬时表达的分析方法有效的筛选到用于进行
草坪草抗逆育种的启动子。
关键词: 结缕草 Rd29A启动子 GFP基因 基因枪法 启动子活性分析
Cloning and Identifying Stress-inducible Promoter
Rd29A of Zoysia japonica Steud．
Wang Ying1 Luo Guokun2 Han Liebao3
(1Biology Institute of Guizhou Science Academy，Guiyang 550009;2Guizhou Province Huishui County Animal
Husbandry Bureau，Huishui 550600;3Turfgrass Institute of Beijing Forestry University，Beijing 100083)
Abstract: A fragment of stress-inducible promoter Rd29A was cloned using the genome DNA extracted from tissue-cultivated
Zoysia japonica Steud． plant as template． Sequence analysis indicated the cloned fragment shared 41. 65% homology with the reported
sequence，and the difference between them was also remarkable． The number of accession GenBank is EU346948． Then utilizes the gene
of green fluorescence protein(GFP)as reporting gene，two transient plant expression vectors pBIG(35S-GFP)and pBIRG(Rd29A-GFP)
were constructed，transform the epidermis cells of onion by particle bombardment to detect the Rd29A promoter which regulates gene ex-
pression activities among recipient cells． Results showed intensity in transformed pBIRG is higher than in transformed pBIG obviously
under fluorescence microscopy． The analysis method of GFP instantaneous expressing is effective to select promoter in resist-adversity
breeding of turfgrass．
Key words: Zoysia japonica Steud． Rd29A promoter GFP gene Particle bombardment Analysis of promoter activity
收稿日期:2011-04-20
基金项目:国家转基因植物研究与产业化专项项目(J2002-B-006)
作者简介:王莹，女，硕士，研究实习员，研究方向:植物育种;E-mail:wangyinghouzi@ 163. com
通讯作者:韩烈保，男，博士生导师，E-mail:hanlb@ tom． com
启动子是调控基因表达的关键元件之一，分为
3 种类型，即组成型启动子、组织特异性启动子和诱
导型启动子［1］。组成型启动子 CaMV35S 是目前植
物基因工程中使用最多的启动子，它可使所驱动的
目的基因高效且非特异性表达［2，3］。但这种非特异
性表达模式不仅造成植物能量上的过度消耗，而且
还可能诱发转基因的沉默现象［4］，因此，许多研究
者改用组织特异性启动子或诱导型启动子来解决这
一问题。Rd29A 基因的启动子是逆境诱导型启动
子，含有干旱、高盐、低温和 ABA诱导表达相关的顺
式作用元件［5］，逆境胁迫可在早期瞬时诱导这些顺
式作用元件，从而激活靶基因的表达，增强转基因植
物的抗逆性。
由于载体构建和转化基因来检测启动子的特性
所用的周期长，并且费时费力，近年来，人们又发展
了启动子的瞬间表达分析法，即目的启动子连上一
2011 年第 8 期 王莹等:结缕草胁迫诱导型启动子 Rd29A的克隆及功能鉴定
种易检测的报告基因并转化到受体中，观察报告基
因的表达情况，进一步确定启动子的活性［6］。本研
究从结缕草中克隆了胁迫诱导型启动子 Rd29A 启
动子的基因片段，选用来源于水母的绿色荧光蛋白
基因(GFP)作为报告基因，构建了分别由 CaMV 35S
启动子和 Rd29A启动子驱动的 GFP 植物瞬时表达
载体，通过基因枪转化法将两种表达载体分别转化
洋葱表皮细胞，进行瞬时表达。通过 GFP 的表达量
来检测 Rd29A启动子活性，为随后构建植物表达载
体进行草坪草转基因抗逆性研究奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
结缕草的标本由北京林业大学草坪研究所采集
并保存，采集于辽宁省辽阳县鸭子沟。
1. 2 方法
1. 2. 1 结缕草基因组 DNA与大肠杆菌质粒 DNA提
取 结缕草基因组 DNA的提取采用 SDS 法，大肠杆
菌质粒 DNA的提取和相关操作采用碱裂解法［7］。
1. 2. 2 Rd29A启动子目的基因克隆 根据已报道的
Rd29A启动子基因序列，经分子生物学软件 Oligo 分
析，设计了一对引物，同时引入了便于载体构建过程
中进行定向连接的相应酶切位点 BamH I和Hind III。
引物序列如下:P1:5-GGATCCCTGCAAGAATCT-
CAAACACG-3，P2:5-GGTTTGATTACTTCTATTG-
GAAAGCTT。
以结缕草基因组 DNA为模板，用 P1 和 P2 为引
物进行 PCR扩增，扩增程序:95℃ 5 min;94℃ 30 s，
57℃ 40 s，72℃ 90 s，30 个循环;72℃延伸 10 min，循
环结束后 4℃保存。进行 1. 2% 琼脂糖凝胶电泳
检测。
1. 2. 3 基因序列分析 将 PCR扩增出的基因片段
委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序;利
用分子生物学分析软件 DNAMAN 对测序结果与已
知序列进行同源性分析。
1. 2. 4 两种启动子分别驱动的 GFP 基因植物表达
载体构建 选用 Xma I + Sac I分别双酶切 pBI121 和
pTG质粒，将回收到的约 750 bp 的 GFP 基因片段与
载体片段用 T4 DNA Ligase 连接，构建成 35S 启动子
驱动的 GFP基因的表达载体 pBIG;用 BamH I + Hind
III分别双酶切 pBIG和 pT29A，将回收到的约 800 bp
的 Rd29A启动子片段和载体连接，构建成 Rd29A 启
动子驱动的 GFP基因的表达载体 pBIRG(图 1)。
图 1 植物表达载体 pBIRG(A)和 pBIG(B)结构示意图
1. 2. 5 基因枪转化 轰击材料为洋葱表皮。洋葱
表皮平铺于高渗培养基中预培养 4 － 6 h 后，转入
MS固体培养基上，pBIG和 pBIRG质粒 DNA浓度为
1 μg /μL，基因枪采用 PDS-1000 /He，样品室真空度
为 26 inHg，可裂膜压力为 1 100 psi，靶距 9 cm［8］。
1. 2. 6 GFP活性分析 基因枪轰击后的材料，25℃
暗培养 12 h，在 4℃和 25℃光照培养 24 h［9］，在荧光
显微镜 Olympus Bx5I /Bx52 下观察、照相、分析启动
子表达活性。
2 结果与分析
2. 1 Rd29A启动子的克隆
以结缕草基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增得
到 1个约 800 bp 的 Rd29A 启动子基因片段(图 2) ，
测序结果(图 3)表明，该片段长度为 814 bp，其中 DRE
顺式作用元件、TATA box，与发表的拟南芥Rd29A启动
子序列同源性为 41. 65%(图 4)。结缕草 Rd29A启动
子序列在 GenBank上的登录号为 EU346948。
M． DL2000 Marker;1，2． Rd29A启动子片段 PCR扩增产物
图 2 从结缕草基因组中扩增到的 Rd29A启动子片段
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上游引物位点 TATA box
GCAAGAATCTCAAACACG ATAAAATATATTAAGAACCGTTGATTAAATT TATAAAA CAAAGATTTTAAAAGCGACAACCTGAAATAAACTACCAG
AGAATCCAGAAGTCTAAGCAAGAATGCATCGAGCCCATACGATGCACCTTTTAGCAGCACAAACCAACAATACAATACAGCGAGCAGGACTTCCATTG
GAATTGTAGAGGGAGAGAGAAACACACCTGCAATAAAAACAACAAAGAGCCAAGCCTTGAGCATTTAAATGCTCAGCAAGTCTTACCCGTCAATATGG
CCAA
DRE顺式作用元件
CTACAG CCGACAT CAAAGAATATGATAAGGTTGACTCACAGGGATGGCTAGATGGCAAAAAGCAGCGCTAATAGTAAATCTTTACTTTCAATTTTTA
GCAACGAATTAAGTTGCGCTAAA
TATA box
AA TATAAAT TTAATTTGCACTATAATCTACATCAAACAGGTTGCCAAACAATTTATGATAAATGTACCATGAAAATCATATTAACATCATCATTCCTT
CTTTAATCCACTTCTTACTACGATGTGGCGCACTGAAACAAGTGGCACTCGTTACTGTGAGAGGAAACGATTATAATCGATTTAA
DRE顺式作用元件
TCCAGCTGGAGAAACTTAATTA CCGACAT GTACGCGCTTTCTGAAAGCCGTACATGGCAACTTTTCACGCCAATGATACATAGCGCCGGGTCCGATG
CTCACCTCTCCCGAACACTAGTCCTCCATGCGATAACCACACCGGGTCTATCTATGGTTAGCCTCAAAGCGCTCCTTTTTATC
下游引物位点
ATCTTCAGAAGAGA GGTTTGATTACTTCTATTGGA
图 3 测序结果分析
图 4 Rd29A启动子基因测序结果与其已知序列对比结果
2. 2 两种启动子驱动的 GFP植物表达载体的构建
用 GFP 替换 pBI121 中的 GUS 基因，命名为
pBIG。用 Rd29A 启动子替换 pBIG 中的 35S 启动
子，命名为 pBIRG。对 pBIG 和 pBIRG 分别进行酶
切和 PCR鉴定后，用金粉对质粒进行包被。
2. 3 启动子活性的鉴定分析
将构建好的植物表达载体通过基因枪法导入洋
葱表皮细胞，进行瞬时表达，通过观察 GFP 的表达，
以确定该基因是否具有启动子的功能，为随后利用
Rd29A启动子提高转基因植物抗逆性做好前期
准备。
将转化后的洋葱表皮分别于 25℃和 4℃条件下
培养，在 OLYPUS BX51 /BX52 型荧光显微镜下用蓝
光激发绿色荧光，在显微镜下观察到洋葱表皮呈现
绿色荧光。在不同的培养条件下，4℃低温诱导 24 h
后 Rd29A启动子所驱动的 GFP 基因在洋葱表皮细
胞得到了高水平的表达(图 5-A) ，说明该启动子在
低温条件下能使所驱动的基因表达，而 35S 启动子
所驱动的 GFP基因在洋葱表皮细胞中表达较弱(图
5-B)。25℃条件下，Rd29A启动子所驱动的 GFP 基
因在洋葱表皮细胞中表达的强度较 4℃的弱(图 6-
A) ，而 35S启动子所驱动的 GFP基因在洋葱表皮细
胞中表达较强(图 6-B)这说明该基因具有启动子功
能，并在低温条件下具有较强的调控能力。
3 讨论
瞬时表达是用来检测外源基因能否正常表达的
一种方式，通过检测报告基因的表达情况，可用来研
究基因的表达调控。本研究选用的报告基因—绿色
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2011 年第 8 期 王莹等:结缕草胁迫诱导型启动子 Rd29A的克隆及功能鉴定
图 5 25℃下分别采用 Rd29A启动子(A)及 35S启动子(B)驱动 GFP基因在洋葱表皮中的表达
图 6 4℃下分别采用 Rd29A启动子(A)及 35S启动子(B)驱动 GFP基因在洋葱表皮中的表达
荧光蛋基因(GFP)是来源于动物的一种报告基因，
与其它报告基因相比，由于植物本身不含绿色荧光
蛋白基因，这就可以避免以往报告基因可能产生的
底色对检测的干扰，可信度较高。此外，传统检测报
告基因的方法需将表达载体转化植物或以原生质体
为受体材料，过程非常繁琐［10］。而本试验选用洋葱
表皮细胞作为受体材料，并运用基因枪转化法进行
转化，省去了以往制备生质体或转化植物所带来的
不便，简单易行，是研究基因表达调控一种有效的
方法。
选择合适的启动子来驱动目的靶基因在转基因
植物中的表达已成为植物基因工程研究的热点问题
之一。针对不同的目的基因，人们选用不同的启动
子，从而使靶基因在特定组织或条件下表达，有利于
转基因植物的正常生长发育［11 － 13］。Rd29A 基因的
启动子被认为是干旱、低温和高盐诱导型启动子，具
有低温、高盐和脱水响应元件(CCGACAT)及 TATA
框(保守序列为 TATAAA)［14］。在逆境环境下可促
进靶基因大量表达，从而提高转基因植物的抗逆性，
但在结缕草中克隆出 Rd29A启动子还尚未报道，因
此，为随后构建植物抗逆性表达载体进行草坪草转
基因抗逆性研究奠定了基础。
本研究利用基因枪法转化洋葱表皮细胞，在荧
光显微镜下观察 GFP的表达，并对发光强度进行研
究，这一方法快速、方便，省去了用其他方法检测而
花费的大量时间，以便快速地进入到下一步的工
作中。
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(责任编辑 马鑫
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