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Population fluctuation of main pathogens and their antagonistic bacteria in cucumber rhizosphere

黄瓜根际重要病原与其拮抗菌消长规律的研究



全 文 :黄瓜根际重要病原与其拮抗菌消长规律的研究*
梁建根1  张炳欣1* *  喻景权1  石  江2  陈振宇1
( 1 浙江大学植物保护系,杭州 310029; 2杭州市农业科学院蔬菜研究所,杭州 310004)
摘要  研究了 4 个不同黄瓜品种根际两类重要土传植物病原菌( Py thium spp. 和 Fusar ium oxysp orum
f. sp. cucumer inum)的种群动态变化.结果表明, 同一品种不同生长期间种群数有差异, 与通常的发病规
律相吻合. 统计分析可见,腐霉种群和尖孢镰刀菌黄瓜专化型种群品种间差异极显著( F = 49554> F 0 01
= 7 59; F= 2355 57> F 0 01= 7 59) . 整个生育期, 所有黄瓜品种种群数极显著地高于其它时期的腐霉种
群数, 结主蔓瓜期镰刀菌种群数极显著地高于其它时期的镰刀菌种群数. 同时, 2 种病原菌与其拮抗菌均
呈较密切的正相关关系, 相关系数分别为 0 95 和 081.
关键词  黄瓜  根际  病原菌  拮抗菌  种群数
文章编号  1001- 9332( 2005) 05- 0911- 04 中图分类号  S436 421, S476 文献标识码  A
Population f luctuation of main pathogens and their antagonistic bacteria in cucumber rhizosphere. L IANG
Jiangen1, ZHANG Bingx in1, YU Jingquan1 , SH I Jiang2, CHEN Zhenyu1 ( 1Depar tment of Plant Protection, Zhe
j iang University , H angzhou 310029, China; 2Hangzhou Institute of Vegetable, Zhej iang A cademy of Agricul
tural Science, Hangzhou 310004, China) . Chin. J . A pp l . Ecol . , 2005, 16( 5) : 911~ 914.
The invest igation on the population fluctuation of main pathogens Pythium spp. and Fusar ium oxy sp orum f. sp.
cucumer inum in the rhizospher e of four cucumber varieties show ed that there was a significant differ ence in the
population number of pathogens for different cucumber varieties and for different gr owth stag es of the same vari
ety , w hich was in accordance w ith the regular disease incidence pattern. T he population number of Pythium spp.
was significantly higher at cucumber creeping stage than at its other grow th stages, while that of Fusar ium oxys
porum f . sp. cucumer inum w as the highest at cucumber principalfruiting st ag e. There was a closer positive rela
tionship between tw o test pathogens and their antagonistic bacteria, wit h the correlation coefficient being 0. 95
and 0. 81, respectively.
Key words  Cucumber , Rhizosphere, Pathogen, Antagonistic bacter ia, Population number.
* 国家自然科学基金资助项目( 30230250) .
* * 通讯联系人.
2004- 05- 14收稿, 2004- 11- 14接受.
1  引   言
黄瓜( Cacum is sat ivus)是人们喜欢的一种重要
蔬菜.但由于土传病原引起的病害,使黄瓜的产量和
品质受到影响, 造成严重的经济损失.土传病原病害
严重, 其中以土传病原真菌的侵染占较大比例[ 18] .
对黄瓜而言, 土传病原物主要是由腐霉属 ( Py thi
um )的不同致病种引起的猝倒病, 以及由尖孢镰刀
菌( Fusar ium oxysp orum )不同专化型引起的枯萎
病.为此,以 4种不同的黄瓜品种为材料, 对其整个
生育期的两类重要病原种群动态进行了系统研究,
为有效地控制土传病害和提高防治效果提供理论依
据.同时, 研究了土传病原真菌与其拮抗菌的相互关
系,筛选出大量的拮抗细菌,为开展生物防治工作积
累了重要资料.
2  材料与方法
21  供试材料
211 黄瓜品种  超春四号、超优一号和新泰密刺均购自原
浙江农业大学种子公司,绿健由杭州市蔬菜研究所提供. 所
有种子未经任何种衣剂处理.
2 1 2 目标病原菌株  引起黄瓜苗期猝倒病的重要病原菌
瓜果腐霉( Py thium aphanidermatum) ,引起黄瓜枯萎病的重
要病原菌尖孢镰刀菌黄瓜专化性( Fusar ium oxy sp orum f.
sp. cucumer inum ) .由本土传实验室提供.
2 1 3 培养基  1) VP3 选择性培养基: 分离腐霉[ 24] ; 2) CMA
培养基: 腐霉纯化、保存; 3) Komada 培养基: 分离尖孢镰刀
菌[ 11] ; 4) KMB:细菌分离、纯化和培养; 5) TSA / 10(酪蛋白胰
蛋白酶水解物 3 g, 琼脂 20 g, 蒸馏水 1 000 ml) : 腐霉拮抗菌
筛选; 6) PDA:镰刀菌拮抗菌筛选.
2 1 4 土样采集  4 个黄瓜品种种植在浙江大学华家池农场
塑料大棚内, 定期在黄瓜不同生育期根围 ( 5~ 15 cm)取土
样,每处理每次随机取 20 个点, 土壤基本农化性状经浙江大
学环境与资源学院农业化学研究所测定, 分别为全 N3 04 g
!kg- 1 ,速效 N7245 mg!kg- 1 ,速效 K7023 mg!kg- 1, 有机
质 14 68 mg!kg- 1 ,含水量 17 7% , pH 6 56.
应 用 生 态 学 报  2005 年 5 月  第 16 卷  第 5 期                              
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, May 2005, 16( 5)∀911~ 914
22  研究方法
221 试验地设计  试验地选在多年种植蔬菜农场塑料大
棚内.试验小区采用随机排列, 小区面积 4 5 m2, 参试的4 个
品种各设 3 个重复,每小区种植黄瓜 100 株, 按照黄瓜的生
育期进行取样.
222 根际土壤悬浮液制备  从发芽期开始取样,每小区五
点法随机取样, 轻轻拔出黄瓜苗, 抖落根上松散的附着土,将
苗自根茎处剪断,称取根 10 g, 用无菌水漂洗 3 次后, 将根置
于盛有 40 ml灭菌的 02%水琼脂的 100 ml三角瓶中, 在摇床
中, 20 # , 150 rmp振荡5~ 10 min, 最后得到根际土壤悬浮液.
223 病原菌分离、培养和纯化  1) 腐霉: 用浓度稀释梯度
法,选取合适稀释浓度, 移液枪吸取 1 ml涂布在腐霉选择性
培养基 VP 3(每一稀释度重复 5 次) , 置于 25 # 的恒温培养
箱中暗培养 24~ 48 h, 然后用细水流的自来水冲掉培养基表
面的泥浆,对光检查、记录腐霉菌落数,挑取不同的菌落边缘
菌丝于 CMA 培养基上纯化 2~ 3 次, 保存于 CMA 斜面试管
内,以便进一步鉴定、致病性测定和拮抗菌的筛选[ 27] . 最后
计算出每克干土的腐霉菌落数( CFU!g - 1) . 2) 尖孢镰刀菌:
用浓度稀释梯度法, 选取合适稀释浓度, 移液枪吸取 0 5 ml
涂布在尖孢镰刀菌选择性培养基(每一稀释度重复 5 次) , 置
于 25 # 的恒温培养箱中暗培养 24~ 48 h, 挑取不同的菌落
边缘菌丝于 PDA 培养基上纯化 2~ 3 次, 保存于 PDA 斜面
试管内以便进一步分类鉴定及致病性测定,以及其拮抗菌的
筛选. 最后计算出每克干土的尖孢镰刀菌菌落数 ( CFU!
g - 1) .
224 拮抗菌筛选、培养和纯化  参考文献[ 25]并稍作修改.
用移液枪吸取 0 1 ml合适稀释梯度根际土壤悬浮液涂布于
T SA/ 10(用于腐霉拮抗菌的筛选)和 PDA(用于镰刀菌拮抗
菌的筛选)培养基表面, (每一稀释度重复 5次) ,平板表面稍
干后, 将培养处于对数生长期的目标病原菌菌丝块分别(直
径 6 mm)放于其上. TSA/ 10 平板 28 # 条件下培养 2 d 后,
分别统计对腐霉不同种具有拮抗作用的细菌菌落 ,挑取不同
类型的菌落于 KMB培养基上纯化, 最后计算出每克干土的
拮抗腐霉细菌总数( CFU!g- 1 ) . PDA 平板 28 # 条件下培养
4 d 后, 分别统计对尖孢镰刀菌具有拮抗作用的细菌菌落, 挑
取不同类型的菌落于 KMB培养基上纯化, 最后计算出每克
干土的拮抗细菌总数( CFU!g- 1 ) .
2 2 5 数据分析  采用唐启义[ 22]编著的 DPS 软件进行数据
分析. 多重比较采用 LSR 法.
3  结果与分析
31  不同生育期根围腐霉种群数量变化
黄瓜根围腐霉种群消长与品种和生育期密切相
关(表 1) . 不同生育期腐霉种群数量不同, 4个品种
在整个生育期腐霉种群总变化趋势一致, 均在抽蔓
期达到最大. Duncan∃s新复极差测试表明,该时期的
腐霉种群数极显著地高于其它时期的腐霉种群数
( P< 001) . 超春四号在调查的 10个时期中, 种群
数量都高于其它 3个品种; 其次,绿健种群数量也高
于另外两个品种. 超优一号除发芽期、结主蔓瓜期 2
和结回头瓜期 2,其余 7个时期均高于新泰密刺.对
各品种腐霉种群 10次调查平均值方差分析表明,品
种间差异极显著( F = 49554> F 001= 759) . 在整
个生育期中, 超春四号根围腐霉种群数极显著地高
于新泰密刺、超优一号和绿健的镰刀菌种群数. 与超
优一号和新泰密刺相比, 绿健根围腐霉种群数表现
极显著差异.超优一号和新泰密刺相比,腐霉种群数
在其根围也表现极显著差异( P< 001) .
表 1  不同黄瓜品种不同生育期中 2种根围病原菌种群数量变化*
Table 1 Fluctuation of population of Pythium spp and Fusar ium oxysporum in the rhizosphere of di fferent cucumber varieties of di fferent growing
stages( cfu!g- 1DW rootsoi l)
生育期
Grow ing stage
腐霉 Pythium spp.
A B C D
尖孢镰刀菌 Fu sarium oxysp orum
A B C D
发芽期
Init ial stage
1080fG 540iG 060fD 400hG 1350169fgF 1933034hH 1214197gF 1027269hH
幼苗期
S eedling stage
4995cC 3470cC 3099bcBC 2338cC 2876271bB 4153115cC 3579691cC 2992146bB
抽蔓期
M idseason stage 38345aA 29849aA 24068aA 11209aA 1009009eE 3345756 fF 1253228fgF 1361730gG
结果前期
Earlyf ruit ing stage 6440bB 3127dD 1979bcdBCD 884efDE 1661170hG 3531532 eE 1356925fF 1471129fF结主蔓瓜期 1
Principalfruit ing stage 1 4132dDE 3776bB 2976bcBC 2394cC 3858136aA 7410098aA 5098435aA 3584060aA
结主蔓瓜期 2
Principalfruit ing stage 2 4666cCD 3910bB 3414bB 3850bB 1318900gF 1552489cC 1539417eE 1476292fF
结主蔓瓜期 3
Principalfruit ing stage 3 1577eFG 1225gF 1135defCD 1077dD 1469688Ff 5170504bB 2043133dD 1835073eE
结回头瓜期 1
Backf ruiting stage 1 1944eF 1679fE 1118defCD 740fEF 2012422dD 2788402Gg 1940540dD 1900765eE
结回头瓜期 2
Backf ruiting stage 2 1043fG 755hG 190efD 569gFG 2908447bB 4178729iI 2048558dD 2705778cC结瓜末期
Latef ruit ing stage 3789dE 1898eE 1620cdeBCD 993deD 2530364cC 3873521dD 3872409bB 2491591dD
A:超春 4号 Chaochun 4; B:绿健 Ljian; C:超优 1号 Chaoyou 1; D:新泰密刺 Xintaimici. * 同列中相同大、小写字母的种群数差异均未达 P 0. 01和
P 0. 05水平Duncan% s mult iple range test . T he number of populat ion in the same column w ith the same capital or small let ters w as not significantly dif fer
ent at P0. 01 and P 0. 05 l evel. 下同 The same below .
912 应  用  生  态  学  报                   16卷
32  不同生育期根围尖孢镰刀菌种群数量变化
由表 1可见, 黄瓜根围尖孢镰刀菌种群的消长
与生育期、品种密切相关. 4个品种在不同生育期尖
孢镰刀菌种群数量不同, 但整个生育期不同黄瓜品
种尖孢镰刀菌种群数量总的变化趋势一致, 都在结
主蔓瓜期 1达到最大. Duncan∃s新复极差测试表明,
该时期的尖孢镰刀菌种群数极显著地高于其它时期
( P< 001) . 品种间镰刀菌群数量变化在整个生育
期有一定的规律,绿健在调查的 10个时期中种群数
量都高于其它 3个品种, 而其它 3个品种间无规律
可循.对各品种尖孢镰刀菌种群 10次调查平均值方
差分析表明, 品种间差异极显著 ( F = 235557 >
F 0 01= 759) . 在整个生育期中, 绿健根围尖孢镰刀
菌种群数极显著地高于新泰密刺、超优一号和超春
四号.与超春四号和新泰密刺相比,超优一号根围尖
孢镰刀菌种群数也表现极显著差异( P< 001) . 而
尖孢镰刀菌种群数在新泰密刺和超春四号根围未表
现出差异.
表 2  2种根围病原菌种群数量及其拮抗菌的关系
Table 2 Relationship between Pythium spp , Fusarium oxysp orum and
their antagonistic bacteria on population at di fferent growing stages of
cucumber ( cfu!g- 1 DW root soil)
生育期
Growing st age
尖孢镰刀菌数
Number of
Fusarium
oxy sp orum
( & 100)
腐霉数
Number of
Pyt hium
spp.
拮抗菌数
Number of antagonist ic
bact er ia ( & 100000)
尖孢镰刀菌
Fusarium
oxysp orum
腐霉
Pythium
spp.
发芽期
Init ial stage
13812 520 4267 749
幼苗期
Seedling st ag e
34003 3476 9697 48 26
抽蔓期
M idseason st age 17424 258 68 34058 15225
结果前期
Earlyfruiting st ag e 20052 3108 5933 45 26
结主蔓瓜期 1
Principalfruiting stage 1 49877 3319 65422 46 99
结主蔓瓜期 2
Principalfruiting stage 2 14718 3960 5298 61 24
结主蔓瓜期 3
Principalfruiting stage 3 26296 1253 6327 39 66
结回头瓜期 1
Backfruiting stage 1 21605 1370 6246 40 38
结回头瓜期 2
Backfruiting stage 2 29604 639 8522 722
结瓜末期
L atefruiting stage 31920 2075 8965 37 46
33  根围病原菌种群数量与其拮抗菌的关系
在黄瓜整个生育期中, 病原尖孢镰刀菌种群数
远大于腐霉.二者的拮抗菌数,除了结主蔓瓜期 2以
外,表现出尖孢镰刀菌大于腐霉.病原菌与其对应拮
抗菌在整个生育期的种群变化趋势相吻合 (表 2) ,
对腐霉的种群数( Y 腐)与腐霉的拮抗菌( X B)一元线
性回归分析, 可得回归方程: Y腐 = 25572 +
0506X B,其相关系数 R= 095, t 检验 t = 888>
t 0001= 392, 表现为高度相关性; 对镰刀菌的种群
数( Y尖)与对应的拮抗菌( X B)一元线性回归分析,
可得回归方程: Y尖 = 148283 + 1169 X B, R =
081, t = 245> t 005= 210,表现为较好的相关性.
4  讨   论
  根际病原与其拮抗微生物在组成与数量上不但
与植 物 生 育 期 有 关, 品 种 间 也 有 很 大 差
异[ 1, 2, 6~ 9, 14, 23] .本研究结果表明, 4 个黄瓜品种根
际两种重要病原菌 ( Py thium spp. 和 Fusarium
oxysp or um )种群在品种间, 同一品种的不同生长期
间均有差异,而且与通常的发病规律相吻合.方差分
析结果表明, 黄瓜根际两类重要病原菌种群数不同
品种间存在极显著差异.相关报道中,或强调根际微
生物量与植物品种有关,抗病品种比感病品种高;或
认为感病品种比抗病品种要高[ 1, 5, 7, 10, 12] .不同作物
间以及同一作物不同品种间根分泌物的组成与含量
存在一定差异, 根际微生物主要受根系分泌物控
制[ 4, 6, 13, 16, 19~ 21, 23, 26, 28, 29] .这有待于进一步研究.
此外,影响根际微生物的因子还很多, 如农药、
土壤肥力和重金属等[ 13, 15, 17, 21, 30] .本试验选取的地
块属中等肥力,为保证试验数据的准确性和可靠性,
试验地完全没有施肥和使用农药等影响结果的各项
操作.
相关分析表明, 黄瓜病原菌与拮抗菌间呈密切
正相关关系.究其原因: 1)植物根系在生长过程中,
由于各种原因以多种方式向根际土壤释放有机物和
无机物,这些物质将是根际微生物赖以生存的食物,
病原菌与拮抗菌对食物的竞争具有同步性,从而产
生正相关的生态效应. 2)说明病原菌对细菌的拮抗
作用有一定的耐力,可与细菌共生存.这进一步说明
防治植物病害单纯依赖植物根围自然存在的拮抗菌
远远不够. 此外, 由于土传病害用化学农药难以控
制,加之化学防治易产生抗药性,造成环境和食品污
染,为寻求安全有效的防治措施,植物病害的生物防
治越来越引起人们的重视.随着现代生物技术的广
泛应用、基因组学的迅猛发展和蛋白组学的兴起,拮
抗基因的分离克隆、表达调控和遗传改良成为可
能[ 3] . 这将为生物防治展现诱人的前景.
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作者简介  梁建根, 男, 1972 年生,博士生. 主要从事蔬菜苗
期土传病害及其生物防治研究, 发表论文多篇. T el: 0571
86971215; Email: ljg422@ eyou. com
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