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响应面法优化荚果蕨总三萜超声提取工艺



全 文 :200
响应面法优化荚果蕨总三萜超声提取工艺
杨晓艳,马 骥* ,彭 飞,陆 洋,马吉福,习伟佳,张 婷
(1.陕西师范大学生命科学学院,陕西西安 710062;
2.教育部药用植物资源及天然药物化学重点实验室,陕西西安 710062)
摘 要:以荚果蕨为研究对象,在单因素实验的基础上,选取乙醇浓度、料液比、超声温度、超声时间为自变量,荚果蕨
中总三萜的提取率为响应值,依据 Box-Benhnken原理设计四因素三水平实验。通过回归分析得到最优提取工艺参数
为:乙醇浓度 60%,料液比 1 ∶35,超声温度 63℃,超声时间 39min。总三萜提取率理论值为 35.7263mg /g,实际值为
36.0304mg /g,相对标准偏差为 0.40%,表明该优化工艺稳定可靠,可为后续实验提供一定的理论指导和参考依据。
关键词:荚果蕨,总三萜,超声,响应面法
Optimization of ultrasonic-assisted extraction of total triterpenes
from Matteuccia struthiopteris by response surface methodology
YANG Xiao-yan,MA Ji* ,PENG Fei,LU Yang,MA Ji-fu,XI Wei-jia,ZHANG Ting
(1.Life Science College,Shaanxi Normal University,Xi’an 710062,China;
2.Key Laboratory of Ministry of Education for Medicinal Plant Resource
and Natural Pharmaceutical Chemistry,Xi’an 710062,China)
Abstract:Matteuccia struthiopteris was regarded as study material.According to the center combination(Box-
Benhnken)experimental principles,four factors and three levels which were based on single factor experiments
were selected to design response surface test. The response factor was the yield of triterpenes,independent
variables were including ethanol concentration,solid - liquid ratio,ultrasonic temperature,and ultrasonic time.By
means of regression analysis,the results showed that the optimum technological method to extract triterpenes from
Matteuccia struthiopteris were as follows:ethanol concentration 60%,ratio of solid - liquid 1 ∶ 35,ultrasonic
temperature 63℃ and ultrasonic time 39min. The actual value was 36.0304mg /g,compared with the theoretical
value(35.7263mg /g) ,the RSD was 0.40% .From this study,it could be concluded that the extraction system was
reliable and practical,the certain reference and theoretical guidance for further research can be provided.
Key words:Matteuccia struthiopteris;triterpenes;ultrasonic;response surface methodology
中图分类号:TS201.2 文献标识码:B 文 章 编 号:1002-0306(2014)15-0200-06
doi:10. 13386 / j. issn1002 - 0306. 2014. 15. 035
收稿日期:2013-12-30 * 通讯联系人
作者简介:杨晓艳(1989-) ,女,硕士研究生,研究方向:药用植物
资源。
基金项目:国家“十二五”科技支撑计划课题(2011BAI06B05) ;国家大
学生创新实验项目(201310718050)。
荚果蕨(Matteuccia struthiopteris(L.)Todaro)又名
荚果 蕨 贯 众、广 东 菜、黄 瓜 香,是 球 子 蕨 科
(Onocleaceae)荚果蕨属(MatteucciaTodaro)多年生草
本植物,含有多种药用成份,为我国主要的五种贯众
之一,可全草入药,具有清热解毒、杀虫、止血等功
效[1],在我国东北、华北、川陕及西藏等地广泛分布,
多生长于山谷、河岸等湿地。荚果蕨富含多种营养
元素,如多糖、蛋白质、脂肪、碳水化合物、粗纤维、维
生素和多种微量元素,是营养价值极高的出口绿色
山野菜,同时也是药食两用的蕨类植物[2]。
三萜类化合物为荚果蕨的主要有效成分之一[3],
具有抗癌[4]、保肝、降血糖、抗肿瘤、抗病毒[5-7]等活
性。本实验以荚果蕨根状茎为研究对象,采用超声
辅助提取技术,借助超声波的空化作用加速了细胞
内成分的溶出,缩短了提取时间,提高了提取效率[8]。
本文以荚果蕨总三萜含量为考察指标,利用响应面
法优化超声提取荚果蕨总三萜的工艺技术,这为荚
果蕨的药用研究、天然保健品、食品、化妆品等开发
及工业化生产提供一定的理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
荚果蕨 采自陕西省宁陕县旬阳坝地区;齐墩
果酸 标准品,中国药品生物制品检定所;无水乙
醇、冰乙酸、高氯酸均为分析纯;实验用水为超纯水。
HH-6B数显恒温水浴锅 江苏常州国华电器
有限公司;KQ-300DE 型数控超声波清洗器 昆山
超声仪器有限公司;SL202N 型药物电子天平 上海
明桥精密科学仪器有限公司;SHB-Ⅲ循环水式多用
201
真空泵、RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器
厂;TG16-WS型台式高速离心机 长沙湘仪离心机
仪器有限公司;超微量微孔板分光光度计 美国
BioTek;FZ102 微型植物粉碎机 黄骅市中兴有限责
任公司。
1.2 实验方法
1.2.1 材料处理流程 荚果蕨根状茎→清水洗净→阴干
→粉碎→过 60 目筛→石油醚脱脂→晾干→塑封保存→实验
材料
1.2.2 荚果蕨总三萜含量标准曲线的绘制 准确称
取干燥至恒重的齐墩果酸标准品 2mg 置于 10mL 的
容量瓶中,加入无水乙醇定容,得 0.2mg /mL 的标品
溶液。吸取系列梯度的标品溶液置于 10mL 的具塞
试管中,在 60℃恒温水浴锅中挥干,流水冷却后加
5%的香草醛-冰乙酸 0.2mL,高氯酸 0.8mL,摇匀,
60℃水浴锅加热 15min,流水冷却,加 5mL冰乙酸,摇
匀后在 550nm处测定吸光值[9-10]。以齐墩果酸质量
为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。得回归
方程为:Y =5.5458X-0.0457,相关系数 R2 = 0.9995。
1.2.3 荚果蕨总三萜含量的测定 准确称取 1.2.1 中
样品粉末于锥形瓶中,加入乙醇溶液,在设置的超声
条件下提取,然后离心,抽滤,旋蒸,定容,按 1.2.2 方
法显色,测吸光值,根据标准曲线计算荚果蕨总三萜
含量,其公式为:
提取含量(mg /g)= CV /M
其中:C为提取液中总三萜的浓度,mg /mL;V 为
提取液的总体积,mL;M为称取的原材料质量,g。
1.2.4 单因素实验
1.2.4.1 乙醇浓度 选取 40%、50%、60%、70%、
80%,固定料液比为 1∶20,功率 300W,于 50℃条件下
反应 50min,分析乙醇浓度对提取率的影响。
1.2.4.2 料液比 选取 1 ∶ 10、1 ∶ 20、1 ∶ 30、1 ∶ 40、
1∶50g /mL,固定乙醇浓度 60%,功率 300W,于 50℃条
件下反应 50min,分析料液比对提取率的影响。
1.2.4.3 超声温度 选取 40、50、60、70、80℃,固定乙
醇浓度 60%,料液比 1∶20,功率 300W,于不同温度下
反应 50min,分析超声温度对提取率的影响。
1.2.4.4 超声时间 选取 20、30、40、50、60min,固定
乙醇浓度 60%,料液比 1 ∶20,功率 300W,于 60℃下
反应不同时间,分析超声时间对提取率的影响。
1.2.4.5 超声功率 选取 100、200、300、400、500W,
固定乙醇浓度 60%,料液比 1 ∶ 20,于 60℃下反应
40min,分析超声功率对提取率的影响。
根据上述设计做单因素实验,取三次重复的平
均值,初步确定每个因素的最佳范围,探究各因素对
荚果蕨总三萜提取率的影响。
1.2.5 响应面设计 在单因素实验的基础上,综合
各因素的影响,选取乙醇浓度(A)、料液比(B)、超声
时间(C)、超声温度(D)作为实验因素并确定各因素
合适的水平数,以荚果蕨中总三萜的提取率(R1)为
响应值,采用 Design - Expert.8.05b 软件中的 Box -
Behnken Design,简称 BBD 实验设计方法进行设计。
四因素三水平实验设计表如表 1。
表 1 实验因素水平及编码表
Table 1 Factors and coded levels
in the central composite design
水平
因素
A乙醇浓度
(%)
B料液比
(g /mL)
C超声时间
(min)
D超声温
度(℃)
- 1 50 20 30 55
0 60 30 40 60
1 70 40 50 65
1.2.6 数据处理 采用 Design-Expert.8.05b 软件对
实验数据进行分析处理并对各因素间的交互作用做
回归分析。
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 乙醇浓度对总三萜提取率的影响 从图 1 可
以看出,在乙醇浓度低于 60%时,总三萜提取率随乙
醇浓度升高逐渐增大,当浓度大于 60%时,提取率却
迅速下降,这是因为荚果蕨中的总三萜可能以苷和
苷元两种形式存在[11],苷易溶于水,苷元易溶于醇,
乙醇浓度过高或过低都不利于二者的充分提取,因
此 60%乙醇溶液最适。
图 1 乙醇浓度对总三萜提取率的影响
Fig.1 Effect of ethanol concentration
on triterpenes extraction rate
2.1.2 料液比对总三萜提取率的影响 从图 2 可以
看出,总三萜提取率随料液比的增加而逐渐增大,当
料液比大于 1∶30 时曲线逐渐趋于平缓,即此时材料
中的总三萜已经基本提出,考虑到高效、节约资源等
因素,选取 1∶30 为最佳料液比。
图 2 料液比对总三萜提取率的影响
Fig.2 Effect of solid-liquid ratio
on triterpenes extraction rate
2.1.3 超声温度对总三萜提取率的影响 由图 3 知,
202
在 40~60℃范围内,荚果蕨总三萜提取率与温度呈正
相关,因为随着温度的升高,分子运动速率逐渐加
快,有利于细胞内物质溶出,而超过 60℃时,提取率
反而下降,其原因可能是过高的温度易造成乙醇挥
发。因此,初选 60℃为最佳超声温度。
图 3 超声温度对总三萜提取率的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic temperature
on triterpenes extraction rate
2.1.4 超声时间对总三萜提取率的影响 由图 4 看
出,随着超声时间延长,总三萜提取率先升高后降
低,40min时提取率最大。原因是超声时间过长,可
能破坏了有效结构[12],或时间过长溶出的杂质变
多[13],所以选择最优超声时间为 40min。
图 4 超声时间对总三萜提取率的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic time
on triterpenes extraction rate
2.1.5 超声功率对总三萜提取率的影响 从图 5 可
知,超声功率在 100~300W 时,提取率不断增大,原
因是超声功率达到一定强度才能产生较好的空化作
用,利于总三萜溶出。当功率高于 300W 时,提取率
反而下降,可能是功率过高破坏了某些目标组分的
分子结构[13],因而选取 300W最佳。
2.2 响应面法优化荚果蕨总三萜提取工艺
2.2.1 响应面实验设计 综合各因素对荚果蕨三萜
类化合物提取率的影响可知:超声功率对提取率的
影响比其他四因素都小,其 RSD 为 1.9%,没必要将
其作为响应面设计的因素,因此选择超声功率为
300W。根据 Box - Benhnken 中心组合实验设计原
理[14],选取乙醇浓度(A)、料液比(B)、超声时间
(C)、超声温度(D)4 个因素设计响应曲面实验。设
计表及结果如表 2。
利用 Design-Expert.8.05b 软件对表 2 实验数据
进行回归拟合,得到二次多项回归方程为:
R1 = 34.80 - 0.61A + 2.91B + 0.09C + 0.85D +
图 5 超声功率对总三萜提取率的影响
Fig.5 Effect of ultrasonic power
on triterpenes extraction rate
1.11AB-0.66AC-0.21AD-0.47BC-0.22BD-0.21CD-
2.61A2-2.99B2-1.15C2-0.67D2
表 2 中心组合实验设计及结果
Table 2 The result of central composite experimentation
实验号 A B C D
实际值
(mg /g)
1 - 1 0 0 - 1 31.36
2 0 0 - 1 1 34.08
3 0 1 0 1 34.89
4 0 - 1 1 0 27.83
5 1 1 0 0 32.29
6 - 1 1 0 0 30.49
7 0 - 1 - 1 0 26.06
8 1 - 1 0 0 25.66
9 0 - 1 0 1 29.29
10 1 0 0 - 1 29.71
11 - 1 - 1 0 0 28.30
12 0 1 1 0 33.91
13 - 1 0 0 1 33.32
14 1 0 - 1 0 31.65
15 0 1 - 1 0 34.00
16 0 0 0 0 35.25
17 - 1 0 - 1 0 31.48
18 0 1 0 - 1 33.89
19 - 1 0 1 0 32.21
20 0 0 0 0 34.54
21 0 0 0 0 35.38
22 0 0 1 1 33.95
23 0 0 1 - 1 32.25
24 0 0 0 0 35.03
25 0 0 - 1 - 1 31.54
26 1 0 1 0 29.73
27 1 0 0 1 30.83
28 0 - 1 0 - 1 27.39
29 0 0 0 0 33.79
由回归模型方差分析表 3 可知,该模型极显著
(p < 0.01) ,失拟项不显著(p = 0.3338 > 0.05) ,说明
所选用的二次多项模型具有极高的显著性。R2Adj =
0.9212,表明有 92.12%的数值可以用该模型来解释。
203
表 3 回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance for the developed polynomial model
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F值 > F 显著性
模型 209.86 14 14.99 24.39 < 0.0001 **
A 4.43 1 4.43 7.21 0.0177 *
B 101.76 1 101.76 165.54 < 0.0001 **
C 0.096 1 0.096 0.16 0.6984
D 8.67 1 8.67 14.11 0.0021 **
AB 4.95 1 4.95 8.05 0.0132 *
AC 1.76 1 1.76 2.86 0.1132
AD 0.18 1 0.18 0.29 0.5999
BC 0.87 1 0.87 1.41 0.2543
BD 0.20 1 0.20 0.32 0.5805
CD 0.18 1 0.18 0.29 0.5978
A2 44.09 1 44.09 71.73 < 0.0001 **
B2 57.80 1 57.80 94.03 < 0.0001 **
C2 8.56 1 8.56 13.93 0.0022 **
D2 2.94 1 2.94 4.78 0.0464 *
残差 8.61 14 0.61
失拟项 6.92 10 0.69 1.65 0.3338
纯误差 1.68 4 0.42
总变异 218.46 28
标准偏差 0.78 复相关系数 0.9606
校正决定系数 0.9212 精密度 18.132
注:* 表示显著(0.05 < p < 0.01) ,**表示极显著(p < 0.01)。
R2 = 0.9606,即该回归方程拟合度较好,实验误差小。
各因子对 R1 的影响程度为:B(料液比)> D(超声温
度)> A(乙醇浓度)> C(超声时间)。优化后的最佳
工艺参数分别是:乙醇浓度 60%,料液比 1 ∶35,超声
温度 63℃,超声时间 39min。总三萜提取率理论值为
35.7263mg /g。
同时,由图 6 可以看出 29 个实验点基本分布于
一条直线上,表明各实验值之间相关性较好,该模型
能很好的反映各因素与提取率之间的真实关系。综
合图表可知此回归方程能够对响应值进行预测
分析[15]。
图 6 总三萜提取率的残差分布图
Fig.6 Distribution of internally studentized residuals
of the yield of total triterpenoids
2.2.2 响应曲面分析 根据回归方程做出响应曲面
图(图 7~图 12) ,分析各交互作用对荚果蕨总三萜提
取率的影响。若响应曲面图越陡峭或呈拱形,表明
此因素对响应值的影响较显著;若响应曲面趋于平
坦则差异显著性不大[16]。具体分析如下:
图 7 乙醇浓度和液料比
对荚果蕨总三萜提取率影响的响应曲面
Fig.7 Response surface showing the
interactive effects of ethanol concentration and
solid-liquid ratio on the yield of triterpenes
图 7~图 12 是四因素中的某两个因素取零水平
时,其余两个因素对响应值的影响。以图 7 为例,从
图 7 曲面图的形状可知,料液比对应的曲面坡度较
乙醇浓度的陡峭,即料液比对响应值的影响比乙醇
浓度显著。由图 7 可知:随着乙醇浓度的增大,提取
率先升高后降低;随着料液比的不断增大,提取率先
增大后基本趋于不变,与前面单因素结果相一致。
当乙醇浓度为 60%,料液比 1 ∶40 左右时,提取率达
到最大即曲面图的顶点。因此,在一定乙醇浓度、料
液比范围内,提取率随其增大而提高,与回归方程中
204
的 AB项的系数是正号相符[17-18]。同理,图 8 显示乙
醇浓度较超声时间对总三萜的提取率影响显著;图
9、图 12 显示超声温度对其影响较大;图 10、图 11 显
示料液比对提取率影响较显著。
图 8 超声时间和乙醇浓度
对荚果蕨总三萜提取率影响的响应曲面
Fig.8 Response surface showing the interactive effects
of ultrasonic time and ethanol concentration
on the yield of triterpenes
图 9 超声温度和乙醇浓度
对荚果蕨总三萜提取率影响的响应曲面
Fig.9 Response surface showing the
interactive effects of ultrasonic temperature and
ethanol concentration on the yield of triterpenes
图 10 超声时间和料液比
对荚果蕨总三萜提取率影响的响应曲面
Fig.10 Response surface showing the
interactive effects of ultrasonic time and
solid-liquid ratio on the yield of triterpenes
2.2.3 最优工艺验证 为了检验响应面法所得最优
工艺的可靠性,按照 2.2.2 中所得工艺条件进行提
取,三次重复实验所得结果分别为:36.0121、35.898、
36.181mg /g,平 均 值 36.0304mg /g,与 理 论 值
35.7263mg /g 相比,相对误差为 0.85%,RSD 为
图 11 超声温度和料液比
对荚果蕨总三萜提取率影响的响应曲面
Fig.11 Response surface showing the
interactive effects of ultrasonic temperature and
solid-liquid ratio on the yield of triterpenes
图 12 超声温度和超声时间
对荚果蕨总三萜提取率影响的响应曲面
Fig.12 Response surface showing the
interactive effects of ultrasonic temperature and
ultrasonic time on the yield of triterpenes
0.4%,说明所得最优工艺参数准确可靠,可用其预测
分析实验结果。
3 结论
在单因素实验基础上,利用响应面法对超声辅
助提取荚果蕨总三萜的工艺进行优化,建立数学模
型。通过对模型响应曲面图及等高线图分析表明:
影响总三萜提取率的因素依次为:B(料液比) ,D(超
声温度) ,A(乙醇浓度) ,C(超声时间)。利用模型方
程优化出最佳的提取工艺条件:乙醇浓度 60%,料液
比 1∶35,超声温度 63℃,超声时间 39min。经过验证,
实际值为 36.0304mg /g,理论值为 35.7263mg /g,其
RSD为 0.4%,说明预测值和实际值拟合度良好,表
明该数学回归模型合理可靠,可为荚果蕨后续的合
理开发利用提供一定的理论基础。
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