全 文 ：刘文瑜 ,王旺田 ,曹孜义 ,等.抗寒变叶葡萄砧木组织培养 [ J] .江苏农业科学 , 2010(5):81-84.
抗寒变叶葡萄砧木组织培养
刘文瑜 , 王旺田 , 曹孜义 , 马静芳 , 周香艳 , 吴　兵 , 柴多鹏
(甘肃农业大学生命科学技术学院 ,甘肃兰州 730070)
　　摘要:以抗寒葡萄砧木品种———变叶葡萄为试验材料 ,通过外植体的选择 、不同激素对其不定芽的诱导和芽增殖
以及生根效应探讨对变叶葡萄砧木组织培养的影响。结果表明 , 在变叶葡萄砧木初代培养阶段最适培养基为 GS+
KT0.5 mg/L+6-BA0.5 mg/L+NAA0.5mg/L, 在继代培养阶段最适合的培养基是 GS+NAA0.1 mg/L,在生根培
养阶段最适合的培养基是 GS+IBA0.2 mg/L。最适宜变叶葡萄砧木炼苗移栽的基质是肥土和木屑和腐熟有机肥。
　　关键词:抗寒变叶葡萄砧木;组织培养;外植体;培养基;激素
　　中图分类号:S663.104+.3　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2010)05-0081-04
收稿日期:2009-12-31
基金项目:甘肃省农业科技成果转化资金计划项目 (编号:
0805XCNA064)。
作者简介:刘文瑜(1985—),女 ,甘肃兰州人 ,硕士研究生 , 研究方向
为植物生理生化。 E-mail:yu850721.lemon@ 163.com。
通信作者:马静芳 ,教授 ,硕士生导师 ,主要从事植物生理生化方面的
研究。 E-mail:majf@gsau.edu.cn。
　　葡萄是多年生藤本浆果果树 ,属葡萄科葡萄属 (Vitis
L.),其种类繁多 ,在世界果树栽培中占重要地位 。葡萄果实
美观艳丽 ,肉质柔软多汁 ,风味酸甜可口 ,营养价值很高 ,是人
们喜爱的鲜食水果 ,可用于酿酒 、制干 、制汁以及作为重要的
食品工业原料 。它适应性强 、丰产早果 、可作为美化庭院楼
阁 、绿化荒山 、碱滩的观赏和绿化树种 [ 1 ] 。我国自然条件优
越 ,是葡萄栽培最适宜地带 ,目前 ,我国葡萄的栽培面积为 90
万 hm2 ,但主要栽培品种抗寒性差 ,最低温度低于 -15 ℃的
地区即需埋土防寒越冬 ,给葡萄生产带来诸多不便 [ 2 ] 。
中国野生葡萄资源丰富 ,性状较为优良 ,如山葡萄 、变叶
葡萄等葡萄品种。变叶葡萄(VitispiasezkiMaxim.),别名复
叶葡萄 ,属于葡萄科葡萄属 ,产于海拔在 1 000 ～ 2 000m的山
西 、陕西 、甘肃 、河南 、浙江 、四川等地 。虽然植株生长势强 ,抗
病 、抗寒能力强 ,但人工引种种植较为困难 ,目前尚未有人工
引种种植成功的报道 。
上世纪 40年代兴起的植物组织培养技术可解决人工引
种种植问题 ,葡萄组织培养 ,国内学者已经取得了成功的实
例 。如顾佩雯等以葡萄组织驯化苗为研究对象进行了小茎段
扦插试验 ,探索出一整套适合酿酒葡萄规模化小茎段扦插育
苗的生产技术 [ 3] ;宋润刚等进行 “双优 ”茎尖组织脱毒技术研
究获得成功 [ 4] 。张剑侠等利用葡萄的叶片 、叶柄 、茎段及单
芽茎段进行了离体培养研究 ,并从这些器官中诱导出一些不
定芽 ,但诱导率很低 [ 5 ] 。
本研究利用植物组织培养技术 ,通过对抗寒变叶葡萄砧
木的组织培养 ,探索适宜抗寒变叶葡萄砧木增殖及生根的培
养基激素浓度以及适宜大田生长的基质 ,旨在为今后葡萄嫁
接栽培提供优良砧木 ,同时为葡萄砧木组织培养提供理论
依据 。
1　材料与方法
1.1　材料及预处理
变叶葡萄以子午岭野生葡萄实生苗为材料 ,经多年抗寒
筛选而得到 ,具有良好的抗病性及抗寒性 。将变叶葡萄的枝
条先用清水加 1 ～ 2滴洗涤剂浸泡 1 ～ 2 min,再用清水冲洗
20 min,然后将枝条用无菌水进行浸泡和冲洗 1次;在超净工
作台上先用 70%的酒精浸泡 30 s,再置于 0.1% HgCl2溶液
中消毒 8 min,然后用无菌水洗涤 5次 ,用消毒滤纸吸干枝条
表面水分 ,控制洗涤时间在 1 ～ 2 min内 [ 6 -7] 。
1.2　培养条件
基本培养基为 GS培养基 , 15 g/L蔗糖 , 4 g/L琼脂 ,
0.015g/L青霉素 , pH值为 5.8 ,培养温度为(25±2)℃,光照
强度为 2 000 ～ 3 000 lx,日光灯全日照 ,湿度为 70% ～ 80%。
1.3　试验设计
1.3.1　不定芽诱导培养　将变叶葡萄的枝条剪成不同长度 、
直径的单芽茎段接种于添加不同浓度 6-BA、KT、NAA的 GS
培养基上进行培养 ,每种激素下设 0.5 mg/L、1.0 mg/L2个
浓度 , 30d后统计芽的萌发情况 。
1.3.2　增殖培养　将完成初代培养的变叶葡萄试管苗转接
于以 GS为基本培养基的增殖培养基上 ,同时添加 NAA和
6-BA2种激素 ,每种激素下设 0.1 mg/L、0.2 mg/L2个浓
度 。 6周后观察试管苗生长情况 。
1.3.3　生根培养　将完成继代培养的变叶葡萄试管苗转接
于以 GS为基本培养基生根培养基上 ,选择 IBA作为影响因
素 ,设 0.01、0.05、0.1 mg/L3个浓度 。
1.3.4　炼苗和移栽　当在室内培养的变叶葡萄试管苗生长高
达瓶口 ,有 3 ～ 4枚正常叶片时 ,连同培养瓶转入温室内 ,去掉
瓶塞 , 2×104 ～ 4×104 lx自然光下炼苗 3 ～ 7 d,当其从瓶口伸
出油亮的叶片 ,幼茎呈淡红色时即可出瓶 ,用清水洗去培养基 ,
分别移栽于智能温室和普通培养室的生根基质中进行生长 ,空
气湿度不低于 70%、温度在 20 ～ 25℃。生根基质如表 1。
1.3.5　数据处理　所有数据采用 SPSS软件中的 AVOVA进
行方差分析和多重比较 。
—81—江苏农业科学　2010年第 5期
DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2010.05.137
表 1　变叶葡萄炼苗移栽影响因素试验设计
培养室类型
基质
1 2 3
智能温室 珍珠岩 +土 +腐熟有机肥 蛭石 +土 +腐熟有机肥 木屑+土 +腐熟有机肥
普通培养室 珍珠岩 +土 +腐熟有机肥 蛭石 +土 +腐熟有机肥 木屑+土 +腐熟有机肥
2　结果与分析
2.1　外植体长度对变叶葡萄初代培养的影响
将粗细程度一致 、已消毒完长度为 1.5 ～ 2 cm、2 ～ 3 cm、
3 ～ 5 cm的单芽茎段接种于 GS培养基上 ,生长 30d后芽分化
情况如表 2所示 。
表 2　外植体长度对变叶葡萄初代培养的影响
外植体长度
(cm)
接种数
(个)
分化数
(个)
分化率
(%)
1.5 ～ 2.0 40 36 90.0
2.0 ～ 3.0 40 15 37.5
3.0 ～ 5.0 40 8 20.0
　　从表 2可以看出 ,变叶葡萄外植体的长度对变叶葡萄的
初代培养具有一定影响 。随着外植体长度的增长 ,其成活率
依次呈现降低趋势 。当外植体的长度超过 3cm时 ,成活率仅
为 20%。在培养过程中 ,当外植体长度大于 3 cm时 ,容易造
成污染 ,分化所需时间延长 ,分化率也降低 。
2.2　外植体直径对变叶葡萄初代培养影响
将长为 1.5 ～ 2.0 cm、粗细分别为小于 2.0 mm、2.0 ～
3.0mm、大于 3.0mm的变叶葡萄外植体单芽茎段在 GS培养
基进行初代培养 。 30d后统计分化数及成活率(表 3)。
表 3　外植体直径对变叶葡萄初代培养的影响
外植体直径
(mm)
接种数
(个)
分化数
(个)
分化率
(%)
<2.0 40 22 55
2.0 ～ 3.0 40 32 80
>3.0 40 10 25
　　从表 3可以看出 ,变叶葡萄外植体茎段的直径大小对其
初代培养的苗成活率有一定的影响 。当变叶葡萄外植体的直
径小于 2.0mm时 ,试管苗成活率为 55%,外植体在培养过程
中相对污染率较低 ,芽分化所用时间一般为 18 ～ 22 d;而当变
叶葡萄外植体的直径在 2.0 ～ 3.0 mm时 , 试管苗成活率最
高 ,芽分化所用时间仅为 7 ～ 8d;而当变叶葡萄的外植体直径
大于 3.0mm时 ,试管苗成活率仅有 25%,并且单芽茎段在培
养过程中易污染 ,而且芽分化所用时间较长 ,一般在 25 ～
28 d。由此可见 ,在进行变叶葡萄的初代培养时 ,茎段过细或
过粗不仅不利于外植体的分化 ,而且会影响其分化时间 。
2.3　不同激素浓度配比对变叶葡萄初代培养的影响
将长度为 1.5 ～ 2.0 cm、直径 2.0 ～ 3.0 mm的变叶葡萄
单芽茎段直立插入 GS培养基中 ,进行初代培养 , 30 d后统计
芽发生率及芽长度 ,生长情况如表 4、图 1所示 。
　　变叶葡萄外植体接种到初代培养基上 ,培养 15d时茎段
底部开始萌动并逐渐膨大 ,形成乳白色 、块状的愈伤组织 。培
养到 25 d时 ,愈伤组织上的绿色突起开始分化形成不定芽 。
从表 4可以看出 , 随着 6-BA的质量浓度由 0.5 mg/L升高
表 4　不同激素对变叶葡萄初代培养的影响
激素质量浓度(mg/L)
6-BA KT NAA
接种数
(个)
愈伤组织
分化率
(%)
芽发
生率
(%)
芽长度
(mm) 生长势
0.5 0.5 0.5 40 95 100 3.0 旺盛
0.5 0 0.5 40 93 98 2.5 旺盛
0.5 0.5 0 40 89 90 2.0 缓慢
1.0 0.5 0.5 40 89 88 2.4 较旺盛
1.0 0 0.5 40 92 79 2.0 较旺盛
1.0 0.5 0 40 83 86 1.6 缓慢
到 1.0 mg/L,变叶葡萄愈伤组织的分化率分别由 95%、93%
和 89%降低为 89%、92%和 83%;芽发生率也分别由 100%、
98%和 90%降低为 88%、79%和 86%;外芽长度也分别由
3.0mm、2.5mm、2.0mm减短为 2.4mm、2.0mm和 1.6mm;
生长势也随之降低 。
2.4　不同激素浓度配比对变叶葡萄继代培养芽增殖的影响
将愈伤组织转接到添加有 6-BA、NAA的 GS培养基上
进行培养 。 15 d后观察发现 ,在添加有 6-BA的 GS培养基
上有不定芽出现 ,但分化出的不定芽不仅数量少 ,而且已展开
的新叶叶片狭小 、叶色嫩绿 、茎纤细 、植株矮小 ,这样的试管苗
需转接到另外新鲜的培养基上再次进行培养 ,以培养生长为
健壮的植株 。同时发现 ,在添加有 NAA的 GS培养基上也有
不定芽出现 ,较添加有 6-BA的培养基上生长的试管苗比
较 ,不仅分化出的不定芽数量多 ,而且已展开的新叶叶片宽 、
叶色深绿 、茎较粗 、植株能长至瓶口。从表 5可看出 , 随着
6-BA和 NAA质量浓度的升高 ,变叶葡萄继代培养的平均芽
数降低 ,同时增殖倍数也降低;当 6-BA和 NAA在同一个质
量浓度下时 ,添加有 NAA的培养基上生长的试管苗的芽数显
著多于生长在添加有 6-BA的培养基(图 2), NAA质量浓度
为 0.1 mg/L时 ,变叶葡萄不定芽增殖数达到最大值 。表明
0.1mg/L的 NAA是变叶葡萄继代培养的最优激素浓度 。
2.5　不同浓度 IBA对变叶葡萄生根培养的影响
当变叶葡萄组培苗在继代培养阶段长至瓶口后 ,将其转
接到生根培养基上 ,接种后大约 7 d可观察到有白色的根原
—82— 江苏农业科学　2010年第 5期
表 5　不同激素对变叶葡萄组培苗芽增殖的影响
激素质量浓度
(mg/L)
接种芽数
(个)
增殖芽数
(个)
平均芽数
(个)
增殖
倍数
0.1NAA 50 150 15.0 4.00
0.1BA 50 117 11.7 2.33
0.2NAA 50 110 11.0 2.17
0.2BA 50 92 9.2 1.83
基出现 ,部分培养基的外植体出现愈伤组织 ,当培养 25 d时 ,
各培养基里均有不定根产生 , 当 IBA的质量浓度为
0.01 mg/L时 ,生长出的组培苗的不定根数量最少 。不定根
生长状况见表 6。从表 6可知 ,组培苗的单株不定根数和平
均长度在 IBA质量浓度 0.01 ～ 0.05 mg/L范围内逐渐增加 ,
在 IBA质量浓度为 0.05mg/L时单株不定根数和平均长度达
到最大值 ,分别为 12条和 7 cm,部分处理的不定根数达到 14
条之多 ,根颜色多为白色而且粗壮 ,须根多 ,盘绕瓶底;当 IBA
的质量浓度增加为 0.1 mg/L时 ,单数不定根数和平均长度都
有不同程度的下降 。当 IBA的质量浓度在 0.01 ～ 0.1 mg/L
之间都可以诱导变叶葡萄组培苗出现不定根 , IBA的质量浓
度为 0.05 mg/L时 ,诱导出的不定根数最多 ,生长势最佳(图
3)。表明最适宜抗寒葡萄砧木 LDP生根的培养基为 GS+
IBA0.05 mg/L。
表 6　IBA对变叶葡萄组培苗生根的影响
IBA质量浓度
(mg/L)
接种数
(个)
单株不定根数
(条)
平均不定根长度
(cm)
0.01 40 5 2
0.05 40 10 5
0.10 40 7 3
2.6　不同生长条件对移栽成活率的影响
一般情况下 ,试管苗要经过炼苗 、驯化 ,才能移栽入大田
进行田间生长 。将生根培养过程中的变叶葡萄试管苗转接于
增殖培养基上 , 30 d后选择株高一致 、长势较好的变叶葡萄
试管苗 ,将棉塞去掉 ,在日光下自然生长 ,当有 3 ～ 4张嫩绿 、
油亮的叶片伸出瓶口时 ,将其从组培瓶中取出 , 35 ℃以下温
水洗净根部培养基 ,用育苗盘装拌土 、珍珠岩 、蛭石 、木屑和腐
熟有机肥进行移栽 。将育苗盘放在育苗床上 ,相对湿度控制
在 65%,温度控制在 25 ℃的智能温室和普通培养室进行培
养炼苗 。从表 7可知 ,生根环境智能温室中培养的试管苗的
成活率明显高于普通培养室 。生根基质无论是在智能温室还
是在普通培养室中 ,用木屑作为生根基质时 ,变叶葡萄试管苗
移栽成活率都最高 ,达 90%以上;其次是蛭石 , 为 65% ～
71%;成活率最差的是珍珠岩 ,仅为 50% ～ 60%。组培苗越
大 ,生根数量越多 ,根越粗壮 ,地上部的生长旺盛 、不缓苗 、移
表 7　环境与基质对变叶葡萄组培苗炼苗移栽成活的影响
生根环境 生根基质 移植数(个)
成活数
(个)
成活率
(%)
智能温室 珍珠岩 +土+腐熟有机肥 20 12 60
蛭石 +土+腐熟有机肥 20 14 71
木屑 +土+腐熟有机肥 20 18 90
普通培养室 珍珠岩 +土+腐熟有机肥 20 10 50
蛭石 +土+腐熟有机肥 20 13 65
木屑 +土+腐熟有机肥 20 16 78
—83—刘文瑜等:抗寒变叶葡萄砧木组织培养
栽易成活(图 4)。表明将变叶葡萄试管苗移栽入木屑拌土拌
腐熟有机肥的基质中 ,并放在智能温室中进行培养 ,最有利于
其成活 。
3　讨论
3.1　外植体的选择
外植体在原植物体上所达到的发育程度、结构与功能影
响其脱分化 、分裂 、生长和再分化 。对同一器官和组织来说 ,
幼年状态的外植体比成年期的容易培养和再生植株 [ 6] 。取
材时间及外植体的大小影响植株的再生频率 ,外植体越大 ,再
生植株的频率越高 ,清除病毒的效果越差 [ 7] 。本研究选用田
间 4月的变叶葡萄的幼嫩茎作为外植体 ,外植体过长 ,培养过
程中易造成污染 ,不利于吸收培养基中的营养成分 ,影响芽分
化的时间及分化率 。在变叶葡萄的初代培养过程中 ,外植体
的修剪长度应控制在 1.5 ～ 2.0cm内为宜 。
3.2　激素的选择
培养基成分适宜与否 ,对葡萄的繁殖影响极大 [ 8-9] 。一
般认为器官分化的倾向是取决于内源 CK和生长素的平衡 。
有些植物的外植体中原有的内源激素种类和浓度不同 ,为达
到这种平衡 ,培养基就需补加一定量的生长素或 CK。前人研
究表明 , 250种植物外植体的直接或间接再生植株中 ,包含
24.7%的双子叶植物 、17.7%的单子叶植物和 50%的裸子植
物是单独使用 6-BA诱导无根苗形成的 ,显然 6-BA在不定
芽的诱导过程中起着重要作用 [ 10 ] 。本研究在继代培养阶段
选取 6-BA、NAA这 2种激素 ,因为 CK和生长素对芽的诱导
和生长发育均起重要作用 。不同的生长素不但对生根的数量
而且对根的形态也有影响 ,生长素可能主要在根的诱导时起
作用 。根据李克喜等 [ 10 ] 、刘永清等 [ 11] 、高金辉等 [12]对不同葡
萄试管苗的组织培养研究 ,本研究初代培养采用 GS+6-BA
+KT,当 6 -BA和 KT的浓度都为 0.5 mg/L时 ,变叶葡萄
LDP愈伤组织的分化率高 、芽发生率高且芽长度可达 3 cm;
继代培养时选用 GS+NAA,当 NAA的浓度为 0.1 mg/L时 ,
变叶葡萄 LDP试管苗不但分化出的不定芽数量多 ,而且已展
开的新叶叶片宽 、叶色深绿 、茎较粗 、植株能长至瓶口 ,表明
0.1mg/L的 NAA有利于芽的分化和增殖;生根培养时选用
GS+IBA,由于浓度的影响使得不同浓度下变叶葡萄 LDP试
管苗发根数和根长有所差异 ,但发根数较多 ,根较长且粗壮。
3.3　抗寒葡萄砧木 LDP炼苗阶段移栽成活率的影响因素
在炼苗移栽阶段影响抗寒变叶葡萄砧木 LDP成活率的
因素较多 。首先 ,变叶葡萄 LDP试管苗在移栽前敞口锻炼一
段时间 ,在长出 3 ～ 4片浓绿的叶片时再进行移栽 ,在移栽过
程中选取了根多且粗壮的试管苗进行移栽 ,成活率较高;其
次 ,炼苗的方式和介质 ,一般有 4种炼苗方式 ,分别为摇床内
直接炼苗 、营养钵内移栽炼苗 、育苗盘内移栽炼苗 、炼苗器内
移栽炼苗 。本研究选择在育苗盘内移栽炼苗 ,炼苗介质为土
+腐熟有机肥 +珍珠岩或木屑或蛭石 ,结果木屑的基质中移
栽的变叶葡萄 LDP试管苗成活率高且生长旺盛;再次 ,变叶
葡萄 LDP试管苗是在饱和湿度下培养的 ,叶片保水能力差 ,
移栽时温室中的相对湿度控制在 65%左右 ,移栽成活率可达
80%以上 。
4　结论
通过对抗寒葡萄砧木品种———变叶葡萄的组织培养的研
究 ,结果表明 ,最适宜变叶葡萄初代培养的培养基为 GS+KT
0.5mg/L+6-BA0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L;最适宜其继代
培养的培养基为 GS+NAA0.1 mg/L;最适宜其生根培养的
培养基为 GS+IBA0.05 mg/L;移栽炼苗的最适基质为木屑
+土 +腐熟有机肥 。
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