全 文 ：C N3 4
一
1 26/ 2 R中国动脉硬化杂志 2以” 年第
〔文章编号 〕 1 07一 9 3 49 ( 2仪以) 1 2一 3 0一 023 8一。
1 2卷第 3期 32 8
·实验研究 ·
金粉藏素抑制氧化应激诱导的血管内皮细胞凋亡
度勤慧 , 朱炳阳 , 廖端芳 , 严鹏科 , 雷小勇
(南华大学药物药理研究所 , 湖 南省衡阳市 42 10 1)
〔关键词 〕 药理学 ; 金粉旋素抑制内皮细胞调 亡 ; 流式细胞术 ; 金粉旋素 ; 氧化应激 ; 内皮细胞 ; 天冬
氛酸凋亡蛋白酶 3
[摘 要 ] 研究金粉旋素对氧化应激诱导的血管内皮细胞凋亡的影响及可能机制 。 用过氧化氢损伤人脐静脉内
皮细胞株 EC V 3俱 , 制备 内皮 细胞凋 亡模 型 。 应用四 甲基偶氮吐盐还原法观察细胞活性 ; 流式细胞术和 叭。 el 法检
测细胞凋亡率 ; 用 wc set m b lot 检测细胞天冬氨酸凋亡蛋白酶 3 活性 。 结果发现 , 金粉放素 ( 0
.
3
、
1 和 3 四 lo u )L 呈浓
度依赖性地增加内皮细胞活性 , 显著降低细胞凋 亡率 (巧 . 5% 士 1 . 2% 、 12 6% 土 0 . 9 % 、 8 . 2 % 土 0 . 8 % 比 2 . 7 % 土 3 .
9 %
,
p < 0
.
05 ) ; 同时金粉菠素 (3 脚 ,山 )L 抑制过氧化氢诱导天冬氨酸凋 亡蛋白酶 3 的活化 , 与阳性对照药金雀异黄
酮作 用强度相似 。 结果提示 , 金粉菠素拮抗氧化 应激诱导的血管内皮细胞凋亡可能与抑制 天冬氛酸 凋亡蛋 白酶 3
活化有关 。
【中图分类号 1 即6 〔文献标识码〕 A
rP
o
teC it ve E伟eC t o f o n y c ih n o n A op Pots is o f 、 a7 cs ul a r E n d o t h e lia l eC l s 知 d cu de by o x i
.
da t i v e S t r e s s
LTJ O 切n 一 H山 , Z H U B in牙物 Lg , L IA ( , D u肠陌 19 , 、娜 eP g-n eK , 即 d LE I Xj 盼 oY r、g
(瓜 加it ul o of 乃 a nrT衅 z丫心。 。 。乙召 , , 腼必l,a 如 :删办 , ]衍卿叨若 42 ]o ] , 以、 )
[K E Y w ( ) R E S } 。 , y e }` , , ; xO ; d a , sv e S l r e o s ; E n d o il le li al e e l ; c a s p as e 一 3 ; A卯 p t o s is ; l l y击叩 e n eP ioxr de「A B 5 r伟 LA cr ] A i n l 毛 , 5 1: , d y t }l e p or t e e * iv e .」l七C t of o叮 e比n 嗯苗r , t , as e lu ar e ndot he il al e e l a 即p t o s i , in dcu e d by o泛山 -
l iv e S ter
s s
.
M祀ht 闭 5 C u l t u er ol l、um o l u n l b山 e ; d v e i l、 e r l d o t l l e lial c e ls ( E CV 3以 ) w e er i n e己 ) a t e d fo : 30 而 11 iw t ll e ithe : v e hi -
e le ( D MOS )
, 罗 ,五s t e i n o r o n y e l` n }、 fo er 佼 i ,、 9 e ll司l e : l g e d iw it 、 H Z姚 Cc l vi ab ili ty we r e , , le as uer d by t ,、 e M rT as s叮 , an d e el
a即 P t o s i s w as d e t e nur dne by fl o w e yt 。 ): n e t ir e an 街 5 1; adn t e nur n滋 d eo x尹1: : e le o t id y l t r。 。 fe sr as 一 n l战 a t e (1 d l门下 in e k e n d 一 l滋 il n g
(
,
n l l l e l ) re
s详 e r iv e ly . M e , l w l五le , W e s t e m b l ,比 w韶 :巧 . : d t o n l e a s uer t }l e a e t iv at io n o f e朋 pas e 一 3
.
R e s u lst l七伙 etr a t刀 l e nt
fo
r 2 4 h e v o晚〔 l e , l d o t ll e li t o l 。即 [ ) t` )、 15 , 。 ld o r、 y ` }云r (0 . 3 , 1 an d 3 zo l l o U I ) d e e er * d t lle r a r e o f a卯 tP o s e e n d ot h e h al e e l , ( 15 .
5 , 士 1
.
2%
,
12
.
6% 士 0 . 9 % 阴 。! 8 . 2% 士 0 . 8% v s 2 2 . 7% 士 3 . 9% ) i ; 1 a e o cn e n t ar t io n 一 de 详 ; ,d e , I t m an e r
.
Me an w l山 e ,
0卿 e l百r、 〔 lce er as e d t ll e e x P r e s 、 , o n o f a 〔 .t iv e e二p a 、 一 : , in d L` e e d b y 从恤 朋 群 、 in s : 。 i ; , C O n cl ius 叨 。 。 y e l五, 1 p er v e o t s 践 仇 一 in -
。
i
l l o e
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il
、四 a卯r )t o s i s w l“ e l l e。。能王a te d 们 t lz i rd五b主之io n of e a s asn -e 3 a e t i、 , a士jo , ,
.
血管内皮细胞功能受损是动脉粥样硬化触发的
早期事件 ,而受损的内皮细胞发生细胞凋亡是细胞
功能受损的重要原因之一川 。 在动脉粥样硬化斑块
部位也存在凋亡的内皮细胞 , 凋 亡内皮细胞脱落后
促进血栓形成 , 最终引起管腔再狭窄比 , { 、、 因此拮
抗各种病理因素刺激引起的内皮细胞凋亡是防治动
脉粥样硬化和再狭窄的又一热门靶点 。
金粉藏素 ( o n y ch in , O n y )是 一种新型三氢黄酮
贰类单体化合物川 , 与植物雌激素中轻基异黄酮 的
化学结构类似 。 在离体血管环 实验 中观察到 , 金粉
截素对溶血性磷脂酞胆碱损伤的内皮依赖性舒张功
能有保护作用 L’ 〕 , 并且能够拮抗体外培养的内皮细
胞氧化应激损伤同 ,提示金粉藏 素有 内皮细胞保护
作用 。 而金粉旅素的细胞保护效应是否与拮抗内皮
细胞凋亡有关 , 尚未见文献报道 。 本研究将进一步
验证金粉旅素对内皮细胞凋亡的影响 。
〔收稿 日期」 20 3一的 一 l() 〔修 回日期」 2以“ ( )2一。 !
〔基金项 目」 l , 尸{ 部 入f 余 ` 98 1飞45 ) 、 胡 l有古 , 1, 1、 ; 乡勺科 日I J浅金
( 2(U 减义b ) 和湖 J打省教 委 J浅众 ( 9 8 1弓l旧 )资土叻
〔作者简介 1 胜勤 致 , , } ,南大学防 卜研究 ’ } · 卜卜川 ial 为油灿 ,勿 * h)l , ·
. 1 1 哗端芳 .膊 l, 教授 , 卜乎卜研究 ’ ( 分师 , 卞文通讯作者 , 卜一 l 以 ! l 为
肪 小 但 } .` , f: .以 l卜 , ` 1 、 米炳阳 高级 ,妈浏巾
1 材料与方法
1
.
1 药品与试剂
人脐静脉内皮细胞株 EC V3以 购自武汉 大学细
胞馆藏中心 ;过氧化氢 ( H Z 0 2 ) 、 金雀异黄酮 、 二 甲基
亚飒 〔DM义 ) )和 四 甲基偶氮挫盐 ( M l 一 r )均购 自 51 9拍
公司 ; l) M E M培 养基 为 C BI (C ) 产 品 ; 新生牛血清 (杭
州四季清产品 ) ; 鼠抗 人天 冬氨酸特异性半眺氨酸蛋
白酶 3( 又称 为天 冬氨酸 凋亡 蛋 白酶 3 , 。 sP as e 一 3 )
2 84 IS SN I(X ) 7
一
34 9 9h C in J Ar t er i ol sc er
,
V o l 12
,
No 3
(& m扭 CrUZ iB oet c lm o logy ) ; B CA 蛋 白含量测定试剂 、
w 加et m b lot 荧光检测试剂盒 ( H y c lon e 一 iP二 e 公 司 ) ;
肠 n e l 试剂盒 (博士德公司 ) ;金粉放素为本实验室提
取并鉴定 (纯度 > 98 % ) , 溶于二 甲基亚矾 ( DMS O ,
终浓度 < 0 . 01 % ) 。
1
.
2 细胞培养及处理
用含有 10 % 新生牛血清的 DM EM 培养基 , 同时
加入 lX() u /L 链霉素和 l的 亩 L 青霉素 ,在 3 7℃ 、 5%
C 0 2
、饱和 湿度的 C氏 培养箱中培养细胞 。 实验分
组 : 空 白对照组弃原培养基并重新加入含 1% 新生
牛血清的 DM EM 培养基继续培养 ,残 q 诱导的细胞
凋亡组在含 1% 新生牛血 清的 D MEM 培养中加入 1
~ 心 L 珑仇 孵育 24 h , 金粉蔗素组在加入 玩 q 前
30 而 n 分别加入不同浓度金粉族素 ( 0 . 1 、 0 . 3 、 1、 3 和
10 “ m 0 1/ L ) , 溶媒对照 组在含 1% 新 生牛血 清的
MD EM 培养中加入 。
、
01 % DM SO
, 阳性药物对照组在
加入 风 q 前 30 ~ 加入 10 脚即 UL 金雀异黄酮
。
1
.
3 四甲基偶氮哇盐还原实验
细胞以 2 x l了 个L/ 铺种于 % 孔板 , 待汇合后
按以上分组处理 , 24 h 后弃原培养基 , 各孔 加入含
M l l
,
(终浓度 0 . 5 毗 I L )和 1% 新生牛血清的 DM EM
培养基 , 培养 4 h 后 , 弃培养基 , 加入 10 “ L MD S o
原液 , 37 ℃ 培养 10 ha n , 待结晶完全溶解后 , 用酶联
免疫仪于 57 0 ln 波长处测定吸光度 ( A ) ;并根据吸
光度计算细胞存活率 , 细胞存活率 二 给药组吸光度
令 空白组吸光度 x l o % 。
1
.
4 流式细胞术测定细胞凋亡
按分组处理细胞 后 , 用 0 . 25 % 胰蛋 白酶消化 ,
收集悬浮和贴壁细胞 , 1姗 g 离心 5 而 n 。 弃上清 ,
BP s 垂悬再离心 , l 以刃 以而n 离心 5 而 n , 弃上清 , 用
50 匹 BP S 将细胞 吹打成单细胞悬液 , 加入 75 % 乙醇
4℃ 固定 24 h 。 用 P BS 洗细胞 2 次 , 加碘化毗吮 ( IP )
荧光染料于 4 ℃冰箱中放置 45 而 n , 30 目尼龙网滤
过 ,流式细胞仪检测分析细胞 凋亡率 , 寻找金粉放素
最佳保护浓度组 。
1
.
5 T u n e l 法检测细胞凋亡
收集细胞 , P B S 洗 2 次 , 离心 收集细胞团 , 4 % 多
聚 甲醛固定 30 m in , 用纱布包裹 , 常规脱水 , 石蜡包
埋 ,切片。 脱腊后按 T u n e l 试剂盒说 明书操作 :样 品
加蛋白酶 K 处理 5 而 n , P B S 洗 3 次 , 用 4% 多聚 甲醛
固定 5 而 n 。 取 Td T 及 Bi o ti n 一 Hd u即 各 l 拌L , 加 s ; , L
标记缓冲液混匀后 , 加入样品 , 37 ℃ 反应 60 而 n 。 2
x
S C 浸泡 15 m in , PB S 洗后加 A v id in 一 HRP , 在 3 7℃
湿盒中反应 60 m in 。 P BS 漂洗 , D A B 显色 , 苏木素复
染 , 常规封片镜检 。 细胞核 中有棕黄色颗粒者为阳
性细胞 , 即凋亡细胞 ,在高倍 ( x 4X() )视野下每张切
片计数 5 个视野 , 每个视野 中计数 10 个细胞 中阳
性细胞的百分率 ,每组观察 3 张切片。
1
.
6 W七s et m b l o t 测定蛋白的表达
收集不同条件处理的血管内皮细胞 (金粉族素
组采用最佳保护浓度孵育细胞 ) , 用三去污剂裂解缓
冲液裂解细胞 , 4 仪。 g 离心 15 而 n , 收集上清 , B以
试剂测定蛋白含量 , 1 x SD s( 十二烷基硫酸钠 )凝胶
加样缓冲液调蛋 白浓度使各组一致 , 经 12 % SD S 一聚
丙稀酸胺凝胶 电泳 , 然后将蛋 白电转移至 PV DF 膜
上 , 竹粥 T 缓冲液 ( 20
~
U L irT
s bas e
、
p7H
.
6
,
50
~
UL N a CI
,
0
.
1% T w e en )配制的 5% 脱脂牛奶 室温
封闭 1 . 5 一 Z h , 一抗 4 ℃过夜 , BT ST 洗膜 3 次 , 每次
10 n l i n
, 二杭室温孵育 l h , BT ST 洗膜 ,发光剂孵育 ,
显影 。 用 L山卿ksr 图像分析系统对 W七s et m b lot 结
果进行灰度扫描 , 以对照组无活性 c as pas e . 3 和有活
性 e asP ~ 3 的面积灰度值分别为 1
.
0 和 。 , 与实验
组进行比较和半定量分析。
1
.
7 统计学处理
所有实验结果以 x 士 : 表示 , 组 间差异性比较
采用单因素方差分析 , 由 S玲51 1 . 0 统计软件完成 。
2 结 果
2
.
1 四甲基偶氮哇盐还原法检测内皮细胞活性
玫仇 孵育 24 h 的内皮细胞活性明显下降 ;不同
浓度的金粉藏素与 从 q 共同孵育内皮细胞 ,呈浓度
依赖性的增加内皮细胞活性 , 3 和 10 脚 0 1/L 金粉藏
素保护细胞作用显著 , 其作用强度与对照药物金雀
异黄酮相似 , 而溶媒对照组 DM SO 没有任何保护效
应 (表 l 扩n以 e l ) 。
表 1 . 金粉旅素对内皮细胞增殖活性的影响 临 士 : . n = 4)
T ab l
e 1
.
T h e e肠ec t of 仪 y1 曲血抓 e旧 0山心al c e l七 访曲山妙
分 组
空白对照组
过氧化氢处理组
细胞存活率
L酗耐酬金粉蔗素 0
10 拜m o ll L
金雀异黄酮
济媒对照组
10
.
0% 士 2 . 1%
23
.
3% 士 2 . 1% .
26
.
4% 士 5
.
2%
48
.
7% 士 7 . 2% `
6 1
,
5% 土 5
.
8% L
69
.
3% 士 3
.
4% L
68
.
1% 土 3 . 6% L
7 0
.
2% 士 10 . 3% L
30
.
1% 士 7 . 1 %
a : 尸 < 0 05 , 与空 白对照组比较 ; b : 尸 < 0 , 01 , 与过氧化氢处理组
比较
CN 43
一
12 62 / R 中国动脉硬化杂志 2以又 年第 12 卷第 3期 2 85
2
.
2 流式细胞术检测 内皮细胞凋亡
1
~ lo几 H Z 0 2 与内皮细胞孵育 24 h后 ,明显诱
导细胞凋亡 ( 尸 < 0 . 01 ) , 0 . 王 1 . 0 和 3 . O JlnL ol L/ 金粉
蔽素呈浓度依赖性降低细胞凋亡率 。 3 l’ no l-I/ 金粉
威素保护强度与金雀异黄酮相似 , 而溶媒对照组 没
有任何保护效应 (表 2 , 1、 b l e 2) 。
2
.
3 T ln[ e l 法检测内皮细胞凋亡
正常细胞核呈蓝色 , 而 1 ~
l儿 氏 0 2 作用 24 h
后部分细胞核呈棕褐色 ,镜下凋亡细胞计数增多 (尸
< 0
.
01 )
, 金粉获素呈浓度依赖性地抑制细胞凋亡
(图 l 和表 2 , F i邵二 l 阴d aT b l (: 2 ) 。
表 2 . 金粉蔗素对过氧化氢诱导内皮细胞凋亡的影响
l b b le Z
,
E盛狡d of o n y c h in 妞 I几q i记u c ed a op P砚。 目s of e n d o-
Ul e l ial c e l s (
、 士 、 , ; , 二 2 )
分 fI[
空自对照组
过氧化氢处理组
金粉旅素 0 . 3 ,, , , , ,一z一J
1 2朋` ,i / L
3 2小 1吸、 l / l
金雀异黄酮
溶媒对照夕}i
流式细胞术检测
细胞凋亡 率
2
.
2 % 士 0
.
4 %
22 7 % 土 3
.
9 %
`
]7 5 % 士 1 . 2 % b
12
.
6 % 土 0
.
9 % 卜
8
.
2 % 土 0
.
8% `
8 3% 士 0 4% 卜
2 1
.
0 % 土 0
.
7 %
飞,u n e l检测
细胞凋亡率
6
.
6% 士 ]
.
5%
25
.
5% 士 2
,
1%
日
17
.
5 % 士 1
.
2 % l
`
15
.
6 % 士 1
.
5 % 卜
1 1
.
5 % 士 1
.
5 % b
10
.
5% 士 0
.
7 % 卜
2 3
.
3% 士 4 . 2%
a :
P < 0
.
0 1
, ,
j 空 l’ J又J照组比较 ; b : I , < 0 0 1 , ` j过氧化氢处理组
比较 ,
图 1 . T 。词 法检测细胞凋亡 ( x 粼X ) ) A 为空自对照组 ; ” 为过氧化氢处理组 ; c 为溶媒对照贡组 ; 1) 为金粉威素组 ; E 为金雀异黄酮组 。
iF g u理 1 . eR P r e 沈 n t a t iv e onI rP h o l哈司 ch an g es of a卿 P t o石c E C d e te m止n de by l , u l l e l s怕 i厂111. 9
2
.
4 金粉蔗素对天冬氨酸凋亡蛋白酶 3 活性影响
经 H Z ()z 处理细胞后 , 酶原形式的 a(t s aP 、 一 3 、犯
kl ) 表达信号非常弱 , 17 kD 的断裂带非常清晰 。 金
粉蔽素 ( 3 20 110 1/ L )抑制 e州 〕a s e 一 3 活化 , 断裂带信号
较弱 , 而没有 活性 的 。、朋因 S c 一 3 酶原 表 达增 多 , 与
H: 0
2 组比较有显著性差异 (图 2 和表 3 , FI urE 「e Z an d
『
lh l
,
1
。、 3 )
、
表 3 . 金粉蔗素对天冬氨酸凋亡蛋白酶 3 活性的影响
aT bl e3
.
E月飞c t of on y c】l in on 玫 q 加 d u cde e x Per 对 o n of
G】s P睽一 3
分 全】l
C、 I、 。 e 一 3 酶 jJ;t
丰{l又·上吸光度
3 2叔Da
空自又了{!广艺组
过氧化氢处理组
3 ,
, , , 1,、 } 21
』 金段荞)威素
金雀与节黄瀚i]
溶媒又」}鱿立全11
0 0 1 士 0 X() l
“
0
.
68 土 0
.
12 .
0
.
88 土 0
.
23
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·
0
.
1 1 土 ( j
.
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C努1一洲 e一 3
幸IJ沐」吸 光度
O
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.
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.
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比较
1 7 k Da
八 匕 七 U
图 2 . w 。 旧 1、 仙 , 检测天冬氨酸凋亡蛋 白酶 3 活性 气为
丫自对川!组 ; 竹过 械化从处理组洲 : 为溶嵘对 11犷戈组 ; D 勺金粉献索
子{l ; 卜; 为 i于雀异黄户汗{才}{
iF朗理 2 . F ll论d o1’ 0侧 ch in ()n H O , ind uc ed exP r踢 ion ()ft
cas P睽一 3 b y W e ste m b l )` t
3 讨 论
异黄酮类植物雌激 素如金雀异黄酮 、 da idZ ie n 等
可显著降低脂质过 氧化物的形成 , 保护血管内皮细
胞 ,使其不被氧化破坏 ,有抗动脉粥样硬化损伤的作
用 7 · 卜 ’ ,药效与雌二醇相当 , 几没有明显的毒副作用 。
本研究以异黄酮类植物雌激素的代表药金雀异黄酮
为仪}性对 !!代, 在 H Z () 2 诱导的内皮细胞凋亡模型 L ,
2 6 8 1骆 l N() X7一 3 4 9 9C h inJ Ar t er isc o lr e, 丫b l lZ , No 3
采用 M l , T法 、 流式细胞术 J b n e l 法检测了金粉燕素
对内皮细胞凋亡的影响 。 结果发现 , 金粉蔗素呈浓
度依赖性地增加内皮细胞活性 , 降低内皮细胞凋亡
率 。 毛m e l 法显示 氏仇 处理的细胞呈棕褐色深染 ,
而金粉荻素组阳性细胞显著减少 , 镜下凋亡细胞计
数与流式细胞计数相似 , 且金粉破素作用强度与金
雀异黄酮相仿 , 说明金粉藏素可以拮抗 玩仇 诱导的
内皮细胞凋亡 。
玫仇作为氧化应激源处理细胞诱导内皮细胞
凋亡 ,启动的信号通路非常复杂 。 因为玩仇 既是体
内氧化代谢的中间产物 , 也可 以代谢产生活性氧和
经自由基 ,这些物质都可以通过不同的信号通路启
动细胞凋亡途径9[J , 所以 践仇 诱导细胞凋亡既可
通过激活相应的蛋白激酶〔l0J , 也可通过线粒体 、 细
胞色素 C 途径 。 玫仇 可以渗人细胞膜内 ,直接破坏
线粒体 , 促进细胞色素 C 的释放 , 激活 c aS aP s e 级
联 [” , ’幻 。 cas aseP 是天门冬氨酸特异性半胧氨酸蛋白酶超家族 ,平时以活性很低的酶原形式合成 ,通过
蛋白水解酶水解去除氨基端的一段序列而被激
活〔la] 。 。as asP o 3是其中的一个重要成员 , 活化后使
特异性底物如 D郊 ’ 4J 裂解 ,切断目标细胞与周围细
胞的联系 , 细胞骨架改变 , DN A 复制和修复能力降
低 ,最终使细胞解体形成凋亡小体 。 本实验中采用
W
e s
emt b l
o t 观察到无活性 的 cas p出犯一3 酶原 ( p ID -
c韶钾哭` 3 )在未经处理的内皮细胞中表达最强 ,凡仇
处理组因 C as p 蛤 e 一3 活化而 cas p斑犯 一3 酶原表达很少 ,
有活性的 c as 拌此 一3 断裂带清晰可见 。 金粉旅素孵
育组 c as p~ 3 酶原表达 比较多
, 断裂带很弱 , 提示
金粉蔽素通过抑制 姨仇 对 c as p as e 一3 的活化而保护
内皮细胞 。
本研究结果表 明 ,金粉获素保护氧化应激诱导
的血管内皮细胞凋亡与抑制 c朋 p斑犯一 3 活性有关 。
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(此文编辑 文玉珊 )
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血小板与动脉粥样血栓
何继强 ` 摘 译 , 秦彦文 , 审 校
(首都医科大学附属北京安贞医院 1 . 心 内科 ; 2 . 动脉粥样硬化研究室 , 北京 1X(] 02 9
动脉血栓是动脉粥样硬化 ( a山e ID cs lerD is s , sA )慢性损害
发展的急性并发症 ,可导致心脏病和中风的发作 , 已成为 目
前发达国家死亡最常见的原因 。 同纤维蛋白一样 , 血小板是
阻塞性动脉血栓的主要成分 ,但是血小板又参与龙 的形成
和进展 。 因此 ,血小板在 灿 血栓形成中起到重要作用 。 如
果能明确血小板粘附 、 活化和聚集的作用机制 , 有助于提高
抗血栓治疗能力 ,甚至可能阻止 sA 的发展 。
l 血小板粘附 、 活化和聚集
血小板膜受体介导血小板粘附于受损血管壁 。 内皮细
胞表面完整性破坏 , 蛋白聚糖 、 胶原 、 巢蛋白 (或网蛋白 ) 、层
粘连蛋白和纤连蛋白等主要内膜成分暴露于循环血流中 ,从
而导致血小板与血管内膜的相互作用 。 (下转第 304 页 )