全 文 ：园　艺　学　报　2000 , 27(5):313～ 316
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期:2000-02-17;修回日期:2000-05-26
基金项目:法国农科院 (INRA , TPV)Action Nouvelle Soutenue 基金资助项目;中法先进研究计划项目资助 (PRA
BT-98-02)
温度 、丙烯和 1-MCP对西洋梨果实乙烯合成
和乙烯受体 ETR1同源基因表达的影响
李正国1 　El-Sharkawy I2 　Lelievre J-M2
(1西南农业大学食品科学学院 , 重庆 400716;　2 法国图卢兹国立高等农学院乙烯与果实成熟实验室 ,
France , 31326)
摘　要:研究了贮藏温度 、 丙烯和 1-MCP (1-甲基环丙烯)处理对帕斯—卡桑 (Passe-
Crassane)西洋梨果实成熟的影响。结果表明:低温可促进果实的乙烯合成 , 未经低温处理的
果实 , 用丙烯处理 , 不能正常合成乙烯。丙烯促进乙烯合成的效应随冷藏时间延长而增强。
1-MCP处理可抑制冷藏果实的乙烯合成。定量 PCR分析结果表明 , 果实中乙烯受体 ETR1 同源
基因的表达不受低温的调节;但冷藏后升温或升温后用丙烯处理时 , mRNA 含量降低。
关键词:梨;低温;后熟;乙烯;乙烯受体
中图分类号:S 661.2;Q 945　文献标识码:A　文章编号:0513-353X (2000)05-0313-04
果实的成熟过程包括色泽 、风味 、 香味 、质地等的代谢变化 , 同时伴有大量相关基因
的表达。乙烯对呼吸跃变型果实的成熟过程起着重要的调节作用。未熟果实可以通过内源
或外源乙烯的作用而加速成熟进程〔1〕 。对于某些晚熟西洋梨品种 (如 Passe -Crassane ,
Anjou等), 果实需经过适当的低温诱导才能正常后熟〔2〕。这表明低温对果实成熟也起着重
要的调节作用。自近年从拟南芥乙烯反应突变体中分离出乙烯受体蛋白基因 ETR1以来 ,
对植物体内乙烯的接受和信号传导有了一定的认识〔3〕 。目前有关乙烯受体基因的研究多集
中于一年生植物中。为了明确帕斯 —卡桑西洋梨果实的成熟机理 , 我们研究了温度 、丙烯
和1-MCP (1-甲基环丙烯)对果实乙烯合成及乙烯受体 ETR1同源基因表达的影响 , 以期
为进一步从分子水平揭示其成熟机理奠定基础。
1　材料和方法
1.1 　材料与处理
供试材料为帕斯 —卡桑西洋梨 (Pyrus communis L.cv.Passe -Crassane)果实 , 于正
常成熟度时采自法国蒙托邦 (Montauban)Garonne valley 果园。采后经处理和预冷后贮于
0℃或20℃。1-MCP处理参照 Mansour〔4〕的方法 , 将果实置于一密闭容器中 , 在 KOH 存在
下通入 4 μL/L 的 1-MCP , 处理 12 h , 通风后 , 移入 0℃贮藏;丙烯处理于 20℃、 含丙烯
1 000μL/L气体中进行。定期测定果实的乙烯释放量 , 并取样经液氮冷冻后 , 贮于-80℃
下 , 用于提取 RNA 。
1.2 　乙烯释放量的测定
将果实置于 1 000 mL 塑料盒中密闭 1 h 后 , 取 1 mL 气样注入气相色谱仪 (Hewlett-
Packard)测定乙烯含量。色谱条件:1.5 m×3 mm的不锈钢柱填充 100-120目的活性氧化
铝 , 氢火焰离子检测器 (FID), N2 流速 45 mL/min , 柱温 150℃, 检测温度 175℃。
1.3 　果实组织 RNA的提取和 cDNA合成
果实组织总 RNA的提取参照Manning 的方法 , 并加以改进。 cDNA的合成参照Zegzouti
等〔5〕的方法:20 μg RNA , 5μL 10×RTase 缓冲液 , 2μL 0.1 mol/L DTT , 4μL 0.5 μg/μL
Oligo (dT)21 , 5 μL 10 mmol/L dNTPs , 1μL 30 U/μL Rnasin , 1 μL 20 U/μL Rtase , 用 DMDC
水调至总体积 50μL;合成条件为 65℃5 min , 置冰上 5 min , 加 Rnasin 和 Rtase 后 , 37℃
60 min;95℃5 min终止反应 。
1.4 　RT-PCR分析
RT-PCR分析参照Zegzouti等〔5〕的方法。以组成性表达的遍在蛋白 (ubiquitin extension
protein , 未发表)特异引物作对照 (Ubil , 5′-ACTTTCATGGCGAACCACTTCGAC-3′, 和 Ubi 2 ,
5′-AATTAGGGTAATCATTCCATCTGG-3′)。用克隆的帕斯 —卡桑西洋梨果实乙烯受体基因 —
ETR1 特 异 引 物 (RTetrl , 5′-ATACATGAAAGGTTCACAAAACGC-3′, 和 RTetr 2 ,5′-
TGCTCTTCACAGGCCAGCGCCATC-3′)进行 RT-PCR分析。PCR反应总体积 50 μL , 其中 1.0
μL cDNA , 1×PCR缓冲液 (Promega), 1.5μmol MgCl2 , 200μmol dNTPS , 引物各 1 μmol , 2
个单位的 Taq酶 (Promega)。扩增条件为:94℃, 3 min , 热启动;94℃, 变性 30 s;56℃,
退火 1 min;72℃, 延伸 1 min;30轮循环;最后一轮延伸 5 min。
2　结果与分析
2.1 　不同处理对西洋梨果实乙烯生成的影响
帕斯 —卡桑果实采收时以及经 20℃贮藏 100 d后 , 均检测不到乙烯释放 。0℃贮藏 100
d后 , 则检测到乙烯生成量为 50.4 nL·g-1·s-1;当 0℃贮藏的果实经 20℃回温 4 d后 , 乙
烯生成量迅速升高 , 达 420 nL·g-1·s-1 。说明低温对帕斯 —卡桑梨果实乙烯的合成是十分
重要的 , 低温贮藏后的回温处理可显著地增加乙烯的生成 。
经1-MCP 处理后于 0℃贮藏 100 d的果实 , 20℃加温 4 d后 , 未能检测到乙烯的生成 ,
　　　　　也不能正常成熟 。说明 1-MCP 强烈抑制了
果实的乙烯生成 。
果实采后分别在 0℃贮藏 0 、 20 、 30 、
50 d 后 , 20℃下经丙烯 1 000μL/L 处理
20 d , 乙烯生成量如图 1 所示 。未经低温
处理的果实用丙烯处理 , 乙烯的生成量仅
为5 nL·g-1·s-1 。随着低温贮藏时间的延
长 , 乙烯合成能力迅速增强 , 至 50 d 时 ,
乙烯生成量达 482 nL·g-1·s-1 , 几乎所有
果实均具备了乙烯的自我合成能力 , 可以
图 1　低温和丙烯处理对梨果实乙烯生成的影响
Fig.1　Effects of cold storage and propylene treatment
on ethylene production in pear fruit
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正常成熟 。由此表明丙烯对西洋梨果实乙烯生成的影响依赖于果实接受低温处理的程度 。
2.2 　不同处理对西洋梨果实乙烯受体基因 ETR1表达的影响
西洋梨果实乙烯受体基因 ETR1的表达结果如图 2 所示。20℃贮藏 80 d , 果实 ETR1
的mPNA水平与对照无明显差异 (A);经 1-MCP 处理后 0℃贮藏的果实 , 贮至 120 d ,
ETR1的 mRNA水平也无明显变化 (C);0℃贮藏 130 d后 , ETR1的表达强度也没有变化 ,
但贮至 160 d , 20℃回温 4 d后 , ETR1的表达水平迅速降低 (B);经 0℃贮藏后 , 在 20℃
用丙烯处理的果实 , 随着低温贮藏时间的延长 , ETR1的 mRNA水平明显降低 (D)。这说
明帕斯—卡桑梨果实中 ETR1基因的表达受低温处理后升温和丙烯的调节 。
图 2　梨果实中 ETR1同源基因的 RT-PCR分析
A.果实贮于 20℃;B.贮于 0℃(＊贮于 0℃ 160 d , 然后 20℃回温 4 d);C.经 1-MCP 处理后贮于 0℃;
D.贮于 0℃, 然后在 20℃下用C3H6 处理 (＊＊0℃天数+20℃丙烯处理天数)。
Fig.2　RT-PCR analysis of ETR1 homolog gene expression in pear fruit
A.at 20℃;B.at 0℃(＊at 0℃ for 160 days , rewarming at 20℃ for 4 days);C.at 0℃ af ter treatment with 1-MCP;
D.stored at 0℃ and treated with C3H6 at 20℃(＊＊days at 0℃+days at 20℃ in propylene).
3　讨论
帕斯—卡桑西洋梨的成熟需要有适当的低温诱导〔2〕。在其它梨品种中也有类似的报
道。Gerasopoulos等研究表明 , `Anjou 梨采后未经低温处理的比经 115 d 低温处理的果
实 , 用丙烯处理后乙烯的生成量约低 10倍〔6〕。本试验也得到相似的结果。采后果实用丙
烯处理并不能有效促进乙烯合成 , 但低温结合丙烯处理却能有效地促进乙烯合成 , 这说明
适当的低温是诱导果实乙烯合成的必要条件 。Lelievre 等认为低温促进乙烯合成的主要原
因是促进ACC合成酶和ACC氧化酶活性〔7〕 。
自Chang 等从拟南芥中分离乙烯受体基因 ETR1以来 , 已相继从番茄 、 甜瓜等植物中
分离了乙烯受体的同源基因〔3 ,8～ 10〕 。我们在梨果实中也分离了 ETR1的同源基因 。研究结
果显示其表达过程不受低温的调节 , 但受低温后升温和丙烯的调节 , 随乙烯合成能力增
强 , ETR1的 mRNA水平下降。这与最近Hua等在拟南芥上的研究结果相吻合 。他们认为 ,
乙烯受体是乙烯信号传导过程中的负调节因子 , 在缺乏乙烯时它调节 CTR1 , 当与乙烯结
合后则对 CTR1的调节作用减弱〔11〕。但 Zhou等在番茄中的研究结果则显示 ETR1在番茄中
是组成型表达的〔8〕。Wilkinson则认为番茄NR基因的表达受果实成熟和乙烯调节〔9〕 。Sato
3155期　李正国等:温度 、丙烯和1-MCP 对西洋梨果实乙烯合成和乙烯受体 ETR1同源基因表达的影响　　　
等发现 ETR1同源基因在甜瓜果实成熟过程中的表达随乙烯合成能力增强而增强〔10〕。这说
明乙烯受体基因在不同植物中可能存在着不同的表达模式 。对此尚有待更深入的研究。
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Effects of Temperature , Propylene and 1-MCP on Ethylene Biosynthe-
sis and Expression of Ethylene Receptor Homolog Gene ETR1 during
Ripening of Pear Fruit
Li Zhengguo1 , El-Sharkawy I2 , and Lelievre J-M2
(1Food Science College , Southwest Agricultural University , Chongqing 400716;　2UA-INRA Maturation des Fruits ,
Ecole Nationale Supérieure Agronomique de Toulouse , France 31326)
Abstract:Passe-Crassane pear (Pyrus communis L.)was used to investigate the effects of
temperature , propylene (an analogue of ethylene)and 1-MCP (an inhibitor of ethylene action)on
ethylene biosynthesis and expression of ethylene receptor homolog gene ETR1 during fruit ripening.It
was found that ethylene production was induced by cold storage , and remained low in unchilled fruits
held in air or in propylene at 20℃.Along with an increase in the number of days of cold treatment ,
ethylene production increased in the fruit treated by propylene.Treatment with 1-MCP prior to cold
storage blocked irreversibly the increase in ethylene concentration during cold storage and after rewar-
ming.Quantitative PCR analysis of total cDNA indicated that expression of ETR1 homologous gene was
not modified during cold storage.However , the level of ETR1-like mRNA was lowered when the fruits
rewarmed or treated by propylene in rewarmed fruits after cold storage.
Key words:Pyrus communis L.;Cold storage;Ripening;Ethylene;Ethylene receptor
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