全 文 ：第 28卷　第 1期 经　济　林　研　究 Vol. 28　 No. 1
　 2010年 3月 Nonwood　 Forest　 Research Mar. 2010　
高粱泡组织培养技术
李海燕 ,王小敏 ,李维林 ,吴文龙
(江苏省中国科学院植物研究所 ,江苏 南京 210014)
摘　要:　为了加快高粱泡的开发利用 ,以 M S为基本培养基 ,以高粱泡的带芽茎段为外植体进行组织培养研究。结果
表明:不同种类和浓度的激素对高粱泡不定芽增殖和生长的影响不同。最佳启动培养基为 M S+ 0. 5 mg· L- 1 6-BA,最
佳增殖培养基为 MS+ 6-BA 0. 5 mg· L- 1+ N AA 0. 1 mg· L- 1 ,最佳生根培养基为 1 /2M S+ 0. 05 mg· L- 1 NAA。
关键词: 　高粱泡 ;组织培养 ;激素
中图分类号: 　 S663. 2　　　　　文献标志码: 　 A　　　　　文章编号: 1003- 8981( 2010) 01- 0051- 05
Tissue culture techniques in Rubus lambertianus Ser.
LI Hai-yan, W ANG Xiao-min, L I Wei-lin, W U Wen-long
( Institute o f Bo tany , Jiang su Province and Chinese Academy o f Sciences, Nanjing 210014, Jiang su, China )
Abstract: In o rder to speed up development and utilization in Rubus lambertianus Ser. , taking M S as basic medium,
the stem segments with aux ilia ry buds in R . lambertianus Ser. wer e cultured as explants. The results showed tha t
effects o f diffe rent kinds and concent rations o f ho rmones on shoo t pr olifer ation and g row th w ere differ ent. It w as
concluded tha t the optimum medium fo r explants g ermination and g row th w as MS supplemented with 0. 5 mg· L- 1 6-
BA , the one fo r pr olifera tion w as M S supplemented with 6-BA 0. 5 mg· L- 1 and N AA 0. 1 mg· L- 1 , and the one fo r
tr ansfe rring plantlets r oo ting was 1 /2MS supplemented with 0. 05 mg· L- 1 NAA.
Key words: Rubus lambertianus Ser. ; tissue cultur e; ho rmones
　　高粱泡 Rubus lambertianus Ser.是蔷薇科悬钩子
属 Rubus L.植物 ,其聚合浆果橙红色 ,柔软多汁 ,营养
丰富 ,具有较高的营养价值和医疗保健功效 ,适宜加
工成果汁、果酒等 ,其所含红色素稳定性好 ,是果汁饮
料的优质添加剂 [ 1- 2]。高粱泡的根和叶可入药 ,有活
血调经、消肿解毒的作用 ,可用于产后腹痛、血崩、产
褥热、痛经、坐骨神经痛、风湿关节痛、偏瘫的治疗 ,叶
外用可治创伤出血 [3 ]。高粱泡是悬钩子类果树 (树莓 )
优良的育种材料 [4 ]。因此 ,研究高粱泡的组织培养和
快速繁殖技术 ,对其开发利用有一定的应用价值。
1　材料与方法
1. 1　材　料
野生悬钩子高粱泡采自南京紫金山。
1. 2　方　法
1. 2. 1　初代培养
剪取高粱泡 1年生未木质化枝条 ,用自来水冲洗
10 min后 ,剪成长 2～ 3 cm、带 1个腋芽的茎段 ,加少
收稿日期: 2009-10-17
基金项目: 江苏省农业高科技项目“低山丘陵地区适栽果品—— 黑莓优良新品种选育” ( BG2007311) ;江苏省科技基础设施建设计划项目
“江苏省溧水黑莓产业公共技术服务中心” ( BM2008101)。
作者简介: 李海燕 ( 1984- ) ,女 ,山西大同人。 硕士研究生 ,主要从事植物栽培与生物技术方面的研究。
通讯作者: 李维林 ( 1966- ) ,男 ,陕西洋县人。 研究员 ,博士研究生导师 ,主要从事经济林和要用植物方面的研究。
E-mail: lwlcnbg@ mail. cnbg. net。
DOI : 10. 14067 /j . cnki . 1003 -8981. 2010. 01. 015
量洗衣粉浸泡 5 min,再用自来水冲洗 45 min,转入超
净工作台进行后期消毒。用 75%的酒精浸泡 45 s,无
菌水冲洗 3～ 4次 ,然后用 0. 1%的 HgCl2浸泡 5 min,
再用无菌水冲洗 3～ 4次。取出茎段在吸水纸上吸干
外部水分 ,切去基部 ,接种到添加不同浓度 6-BA和
NAA的 MS培养基 (培养基含蔗糖 25 g· L- 1 ,琼脂
5. 8 g· L- 1 )中 ,置于培养温度 ( 25± 1)℃、光照强度
2 000 lx、光照时间 12 h /d的培养室内 (培养条件下
同 )。 20 d后统计萌发率、增殖系数和平均芽长。
1. 2. 2　继代培养
( 1)单因素试验　选择初代培养的健壮植株 ,分
别剪取带 2个茎节的茎段和不定芽作为增殖培养的
材料 ,接种在添加不同种类和浓度激素的 MS培养基
中 , 30 d后观察统计增殖系数和平均芽长。每处理接
种 10管 ,每管 1个材料 ,重复 2～ 3次。
( 2)正交试验　选用 L9 ( 34 )正交表进行试验设
计 ,以筛选适合不定芽增殖和生长的最佳条件。 试验
因素和水平分别为基本培养基 ( M S、 3 /4M S、 B5 )、蔗
糖质量浓度 ( 20、 30、 40 g· L- 1 )、 6-BA( 0. 5、 1. 0、 1. 5
mg· L- 1 )、NAA( 0. 1、 0. 3、 0. 5 mg· L- 1 )。接种材料
为初代培养的不定芽 ,每处理接种 5瓶 ,每瓶 2个材
料 ,重复 3次 , 30 d后观察统计增殖系数和平均芽长。
1. 2. 3　生根培养
丛生芽在增殖培养基上生长 3～ 4周后 ,选择长
势较好的不定芽 ,转入以 1 /2M S为基本培养基并添
加不同质量浓度 NAA的生根培养基上。 30 d后观察
并统计试管苗生根情况。
1. 2. 4　数据处理
应用 Excel 2007软件进行数据的统计分析。
2　结果与分析
2. 1　初代培养条件的筛选
带腋芽的茎段接种到不同激素配比的培养基上 ,
2 d侧芽开始萌动 , 7 d开始展叶。初代培养的结果如
表 1所示。
从表 1可以看出 ,在不同激素配比的培养基中外
植体的萌发率、增殖系数和平均芽长各不相同。 从萌
发率来看 , 10个处理的萌发率均较高 ,其中处理 2和 4
萌发率达100%。从平均芽长和增殖系数来看 ,在不添
加 6-BA和 NAA的培养基中 ,侧芽很快萌动 ,萌芽率
较高 ,平均芽长较长 ,但增殖系数最低 ;在只添加 6-
BA的处理 2、 5和 8中 ,随着 6-BA质量浓度的升高 ,
平均芽长和增殖系数的变化趋势为先上升后下降 ,处
理 5与处理 2和 8之间存在极显著差异 , 3个处理在培
养 20 d后增殖系数均大于 2;当 6-BA质量浓度为 0. 2
mg· L- 1和 0. 5 mg· L- 1时 ,单独使用 6-BA的处理 2
和 5在各自的质量浓度梯度下增殖系数和平均芽长
均最高 ,且与其它处理存在显著差异。 在试验中还发
现 ,培养基中 6-BA质量浓度为 1. 0 mg· L- 1时 ,萌发
的芽形态异常 ,芽体较细弱 ,不利于后续培养。因此 ,
以高粱泡茎段为外植体进行培养时 ,采用 MS培养
基 ,添加 6-BA即可满足需要 ,添加 NAA后反而不利
于腋芽的生长和增殖 ,添加 6-BA的质量浓度以 0. 5
mg· L- 1为最佳。
表 1　不同激素配比对初代培养的影响†
Table 1　 Effect of diff erent combination of hormones
on in itial culture
处理
T reatment
激素质量浓度
Mass concent ration
of ho rmone
/( mg· L- 1)
6-BA NAA
萌发率
Germina tion
ra te /%
增殖系数
Pro lif era tion
coef ficient
平均芽长
Average
leng th
o f bud
/cm
1 0. 0 0. 00 95 1. 00 gE 1. 32 aA
2 0. 2 0. 00 100 2. 12 dB 1. 15 bB
3 0. 2 0. 05 80 1. 42 fD 1. 02 cC
4 0. 2 0. 10 100 1. 55 ef CD 1. 00 cCD
5 0. 5 0. 00 95 2. 70 aA 1. 27 aA
6 0. 5 0. 10 85 2. 45 bAB 1. 02 cC
7 0. 5 0. 20 95 1. 75 eC 0. 87 eE
8 1. 0 0. 00 85 2. 20 cdB 0. 99 cCD
9 1. 0 0. 10 90 2. 37 bcB 0. 79 f F
10 1. 0 0. 20 90 1. 63 ef CD 0. 94 dD
† 　同一列中不同字母表示差异显著 (α= 0. 05和α= 0. 01) ,下同。
The dif ferent let ters i n the same column indica te the signi ficant
dif ference at 0. 05 and 0. 01 lev els. The same as below.
2. 2　继代培养条件的筛选
2. 2. 1　细胞分裂素对不定芽诱导的影响
以带 2个茎节的茎段为培养材料时 ,不定芽诱导
和增殖的情况如表 2所示。
从表 2可以看出 ,不同种类的细胞分裂素对不定
芽诱导和增殖的影响明显不同。从诱导率和增殖系数
来看 , 3种细胞分裂素中 6-BA的效果最好 ,诱导率均
高于 90% ,最高达到 100% ,其次是 TDZ, K T的效果
最差 ,且 KT在所试验质量浓度范围内的增殖系数与
6-BA和 TDZ相比存在极显著差异。 从平均芽长来
看 , 3种细胞分裂素中 K T的效果稍好于 6-BA和
TDZ。同时在试验中观察到 ,在添加 TDZ的培养基
中 ,无菌茎段高度愈伤化 ,萌发的芽形态异常 ,叶片卷
曲。所以 , 3种细胞分裂素中 6-BA更有利于不定芽的
诱导和增殖。 因此 ,以高粱泡无菌茎段为材料进行继
代增殖时 ,应选 6-BA为最佳细胞分裂素 ,质量浓度以
1. 5 mg· L- 1为佳。
52 经　济　林　研　究 第 28卷
表 2　不同细胞分裂素对不定芽诱导的影响
Table 2　 Effect of diff erent cytokinins on induction of adventit ious bud
处理
Treatment
激素
Hormones
质量浓度
Mass concen t ration / ( mg· L- 1)
诱导率
Induction rate /%
增殖系数
Prolif eration coeff icient
平均芽长
Averag e length of buds /cm
1 KT 2. 0 69. 70 1. 00 dE 0. 56 a A
2 KT 3. 0 88. 34 1. 09 dDE 0. 51 abcABCD
3 KT 4. 0 51. 67 1. 25 cD 0. 53 abABC
4 TDZ 0. 5 96. 67 1. 93 a AB 0. 43 dCDE
5 TDZ 1. 0 88. 34 1. 69 bBC 0. 42 dDE
6 TDZ 1. 5 86. 08 1. 16 cdDE 0. 45 cdBCD
7 6-BA 0. 5 100. 00 1. 87 a AB 0. 47 bcdABCD
8 6-BA 1. 0 93. 34 1. 62 bC 0. 34 eE
9 6-BA 1. 5 100. 00 1. 94 aA 0. 55 aAB
2. 2. 2　细胞分裂素对不定芽增殖和生长的影响
以不定芽为培养材料时 ,培养基中添加不同种类
和浓度的细胞分裂素对不定芽增殖和生长的影响结
果如表 3所示。从表 3可以看出 ,就不定芽的增殖系数
来说 , 6-BA的效果明显好于 KT,在添加 6-BA的培养
基中不定芽的增殖系数是添加 KT的培养基中的 2～
3倍 ,差异达极显著水平 ;就不定芽的平均长度来说 ,
KT的效果明显好于 6-BA,且两者之间存在极显著差
异。同一种激素的不同质量浓度对不定芽的增殖效果
也不同。以 6-BA来分析 ,处理 3中不定芽的增殖系数
最高 ,达到 4. 00,但平均芽长最小 ,并出现轻微玻璃
化 ,处理 1和 2中 ,虽然增殖系数较处理 3的低 ,但植
株生长健壮 ,且平均芽长较长 ,说明高质量浓度的 6-
BA抑制不定芽的生长。 KT在所试验的质量浓度范
围内 ,对不定芽的增殖效果的影响不明显 ,增殖系数
太小 ,不能满足快速繁殖的需要 ,因此不适合作为诱
导高粱泡不定芽增殖的激素。因此 ,高粱泡不定芽的
继代增殖应选择 6-BA作为细胞分裂素 ,且质量浓度
应低于 2. 0 mg· L- 1。
表 3　不同细胞分裂素对不定芽增殖的影响
Table 3　 Ef fect of diff erent cytokinins on
prolif eration of adventitious bud
处理
Treatment
激素
Hormones
质量浓度
Mass concent ra tion
/ (mg· L- 1 )
增殖系数
Pro lif era ti on
coefficient
平均芽长
Average leng th
o f buds /cm
1 6-BA 1. 0 3. 40 bA 1. 51 cBC
2 6-BA 1. 5 3. 70 abA 1. 47 cC
3 6-BA 2. 0 4. 00 aA 1. 20 dD
4 KT 1. 0 1. 20 cB 1. 69 abA
5 KT 1. 5 1. 30 cB 1. 63 bAB
6 KT 2. 0 1. 50 cB 1. 77 aA
2. 2. 3　生长素对不定芽增殖和生长的影响
以不定芽为培养材料时 ,培养基中添加不同种类
和浓度的生长素对不定芽增殖和生长的影响结果如
表 4所示。 从表 4可以看出 ,在所试验质量浓度范围
内 ,相同质量浓度的 NAA和 IBA对不定芽增殖和生
长的影响差别不大 ,均未达到显著水平。经统计分析
发现 , N AA 3种质量浓度之间、 IBA 3种质量浓度之
间对不定芽增殖的影响均无显著差异 ; N AA 3种质
量浓度之间、 IBA 3种质量浓度之间对不定芽平均芽
长的影响存在显著差异 ,且均在 0. 5 mg· L- 1时不定
芽平均芽长达到最高 ,不定芽整体长势最好。试验中
还发现 ,在添加 NAA的培养基中不定芽基部产生少
量黄色愈伤组织。 因此 ,在高粱泡不定芽继代增殖过
程中可以从 NAA和 IBA中任选 1种作为生长素。
表 4　不同生长素对不定芽增殖的影响
Table 4　 Ef fect of dif f erent auxins on prolif eration
of adventitious bud
处理
Treatment
激素
Hormones
质量浓度
Mass concent ration
/( mg· L- 1)
增殖系数
Proliferation
coefficient
平均芽长
Average length
of buds /cm
1 NAA 0. 3 1. 53 ab A 0. 97 bcA
2 NAA 0. 5 1. 36 ab A 1. 14 ab A
3 NAA 1. 0 1. 62 aA 0. 94 cA
4 IBA 0. 3 1. 17 bA 0. 92 cA
5 IBA 0. 5 1. 37 ab A 1. 16 aA
6 IBA 1. 0 1. 40 ab A 1. 07 abcA
2. 2. 4　不定芽增殖和生长最佳条件的筛选
利用正交设计法 [L9 ( 43 ) ]研究了基本培养基、蔗
糖质量浓度、 6-BA和 NAA 4种因素对高粱泡不定芽
增殖和生长的影响 ,试验结果见表 5和图 1。
图 1　高粱泡的增殖培养
Fig. 1　 Prolif eration culture in Rubus lambertianus Ser.
53第 1期 李海燕 ,等:高粱泡组织培养技术
由表 5中因素内水平极差大小可以看出 , 4个因
素对于增殖系数影响的主次顺序为基本培养基> 6-
BA> N AA> 蔗糖 ,对平均芽长影响的主次顺序为基
本培养基> N AA> 蔗糖> 6-BA。说明培养基中盐的
浓度影响着不定芽的分化和生长 , 6-BA主要影响芽
的增殖 , N AA主要影响芽的伸长生长。采用直观分
析法分析 ,确定有利于提高不定芽增殖系数的最优水
平组合为: M S, 20 g· L- 1蔗糖 , 0. 5 mg· L- 1 6-BA,
0. 1 mg· L- 1NAA;有利于不定芽伸长生长的最优水
平组合为: M S, 20 g· L- 1蔗糖 , 0. 5 mg· L- 1 6-BA,
0. 3 mg· L- 1 NAA。综合考虑增殖系数、平均芽长以
及不定芽的生长情况 ,最终选择添加 20 g· L- 1蔗糖、
0. 5 mg· L- 1 6-BA和 0. 1 mg· L- 1 NAA的 MS培养
基为最佳增殖培养基。
2. 3　生根培养条件的筛选
在添加不同质量浓度 NAA的 1 /2 M S培养基
中 ,高粱泡组培苗的生根诱导结果如表 6所示。
表 5　不定芽增殖正交试验结果
Table 5　 Result of the orthogonal test for proliferat ion of adventitious bud
处理
Treatment
基本培养基
Basic media
蔗糖质量浓度
Mass concen t ration
of sugar / ( g· L- 1)
激素质量浓度
Mass concent ration
of ho rmones /( mg· L- 1 )
6-BA NA A
增殖系数
Proli feration
coef ficient
平均芽长
Averag e length
of buds /cm
1 1( M S) 1( 20) 1( 0. 5) 1( 0. 1) 3. 14 1. 18
2 1 2( 30) 2( 1. 0) 2( 0. 3) 2. 48 1. 15
3 1 3( 40) 3( 1. 5) 3( 0. 5) 2. 25 1. 08
4 2( 3 /4M S) 1 2 3 1. 83 1. 08
5 2 2 3 1 1. 67 1. 07
6 2 3 1 2 2. 33 1. 11
7 3( B5 ) 1 3 2 1. 37 1. 07
8 3 2 1 3 1. 94 1. 02
9 3 3 2 1 1. 58 1. 04
k1 2. 623 2. 113 2. 470 2. 130
k2 1. 943 2. 030 1. 963 2. 060
k3 1. 630 2. 053 1. 763 2. 007
R 0. 993 0. 083 0. 707 0. 123
k′1 1. 137 1. 110 1. 103 1. 097
k′2 1. 087 1. 080 1. 090 1. 110
k′3 1. 043 1. 077 1. 073 1. 060
R′ 0. 094 0. 033 0. 030 0. 050
表 6　不同质量浓度 N AA对试管苗生根诱导的影响†
Table 6　 Effect of dif ferent mass concentrations of NAA in medium on seedling rooting
处理
Treatment
N AA质量浓度
Mass concent ration of N AA / ( mg· L- 1)
生根率
Rooting rate /%
平均生根数
Averag e number of roots
根长
Leng th of root
愈伤组织体积
Size of callu s
1 0. 01 100 4. 53 bB ★★★★ -
2 0. 05 100 6. 50 aA ★★★★★ ★
3 0. 10 95 4. 41 bB ★★★ ★★
4 0. 50 90 4. 47 bB ★★ ★★★★
5 1. 00 81 3. 69 cB ★ ★★★★★
† 　“★”越多代表愈伤组织体积越大或生根苗的根长越长。
Th e“★” number s tanding for th e size of cal lus o r the leng th of root.
　　在添加 N AA质量浓度为 0. 01 mg· L- 1和 0. 05
mg· L- 1的培养基中 ,转接后第 6天根即开始萌动 ,且
较粗壮 ,基部无或有少量愈伤组织 ,苗健壮 ;在添加
NAA质量浓度为 0. 10 mg· L- 1、 0. 50 mg· L- 1和
1. 00 mg· L- 1的培养基中 ,培养 12 d后根才开始萌
动 ,且根较细 ,基部愈伤化严重 ,苗长势较差 (见图 2)。
可以看出 ,当 NAA质量浓度超过 0. 05 mg· L- 1时 ,试
管苗的生根率、根数及根长均降低 ,不利于组培苗根的
诱导和生长。因此 ,确定诱导高粱泡试管苗生根的培养
条件为添加 0. 05 mg· L- 1 NAA的 1 /2 M S培养基。
图 2　高粱泡的生根培养
Fig. 2　 Root inducing culture in Rubus lambertianus Ser.
54 经　济　林　研　究 第 28卷
3　讨论与结论
以高粱泡茎段为外植体进行初代培养时 ,培养基
中只添加细胞分裂素与同时添加细胞分裂素和生长
素相比 ,前者更有利于外植体的萌发和生长 ,可能是
外植体本身所含有的生长素满足了起始培养需求。本
研究中确定高粱泡初代培养的条件为:以茎段为外植
体 ,培养基为 MS+ 0. 5 mg· L- 16-BA。
植物激素的种类、浓度及配比是影响植物组织培
养最重要的因素 ,细胞分裂素能促进芽的分化。 在高
粱泡的继代增殖过程中 ,分别选择无菌茎段和不定芽
作为增殖培养的材料 ,研究结果表明 ,不同种类和浓
度的细胞分裂素对于 2种增殖培养材料的影响不同 ,
其中 , TDZ更有利于愈伤组织诱导 ; KT在所试验的
质量浓度范围内更有利于组培苗的伸长生长 ,与 6-
BA相比不定芽的增殖系数太小 ,不能满足大规模生
产的需要 ,这一点与前人的研究观点一致 [ 5- 8] ; 6-BA
是 3种细胞分裂素中增殖效果最好的 ,有利于不定芽
的诱导和增殖。其中培养材料为无菌茎段时 ,诱导产
生的不定芽长势相对较弱 ,植株矮小 ,增殖系数低。因
此 ,在高粱泡继代培养过程中 ,应选不定芽作为增殖
培养的材料 ,选 6-BA作为添加激素。本研究中确定高
粱泡继代增殖的条件为:以不定芽作为增殖培养的材
料 ,培养基为 MS+ 6-BA 0. 5 mg· L- 1+ N AA 0. 1
mg· L- 1。
生根是试管繁殖的第 3阶段 ,也是最后一道工
序 ,是能否进行大量生产和实际应用的又一重要问
题 ,同时也是商品化生产取得效益的最终环节。 本试
验中研究了不同质量浓度的 NAA对组培苗生根的
影响 ,结果发现高粱泡在 NAA质量浓度较低时极易
生根 ,生根率达到 100% ,组培苗基部不产生或产生少
量愈伤组织 ; N AA质量浓度过高时 ,组培苗基部产
生大量愈伤组织而不易生根 ,生根率低 ,且根多短粗 ,
近似愈伤组织。这与徐桂娟在黑树莓的生根培养中的
研究结果 [9 ]相似。 因此 ,高粱泡的最佳生根培养基为
1 /2 M S+ 0. 05 mg· L- 1 NAA。
参考文献:
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[本文编校:闻　丽 ]
55第 1期 李海燕 ,等:高粱泡组织培养技术