全 文 ：第 26卷 ,第 4期 光　谱　实　验　室 Vol . 2 6 , No . 4
2 0 0 9年 7月 Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory July , 2 0 0 9
白 愈伤组织培养条件优化及总黄酮含量测定①
① 四川省杰出青年学科带头人培养计划项目 ( 04ZQ026-047) ; 四川省教育厅重点项目 ( 2006A078) ;四川省重点学科建设项目
( SZD0420)
② 联系人 ,手机: ( 0) 13990732181; E-mail: yx li@ 263. net; chai chun t ty@ 163. com
第一作者简介:柴淳 ( 1983— ) ,女 ,吉林省吉林市人 ,硕士研究生 ,主要从事药用学研究。
收稿日期: 2009-02-25;接受日期: 2009-03-10
柴 淳　黎云祥②　陈光登　于 涛
(西华师范大学生命科学学院　四川省南充市顺庆区师大路 1号　 637009)
(西南野生动植物资源保护教育部重点实验室　四川省南充市　 637009)
摘　要　优化了白 愈伤组织的继代培养条件并测定了白 愈伤组织总黄酮含量。结果表明 ,继代的
白 愈伤组织在激素组合 2, 4-二氯苯氧乙酸 ( 2, 4-D) 1. 0 mg /L+ 6-苄基氨基嘌呤 ( 6-BA ) 0. 6mg /L的 M S
基本培养基 ( Murashing and Skoog medium)中生长速度快 ,状态良好 ,避免了以往的严重褐化现象。按照白
叶提取总黄酮的最佳提取工艺 ,采用微波辅助法提取白 愈伤组织中的黄酮类化合物。分别以芦丁和金
丝桃苷为对照 ,采用紫外分光光度法在 260nm处测定总黄酮含量。 结果表明 ,白 愈伤组织提取总黄酮含
量为 29. 347mg /g ,高于白 叶总黄酮含量。
关键词　白 ;愈伤组织 ;总黄酮 ;微波辅助提取 ;紫外分光光度法
中图分类号: O657. 32　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1004-8138( 2009) 04-0939-06
1　引言
白 [Acanthopanax trifoliatus ( L) . M err ]为五加科五加属植物 ,攀援灌木 ,以根、叶或全株入
药 ,具有清热解毒、祛风除湿、散瘀止痛、舒筋活络、理气、止咳的药用价值。内服可用于治疗黄疸 ,肠
炎 ,胃痛 ,风湿性关节炎 ,腰腿疼 ;外用治跌打损伤 ,疮疖肿毒 ,湿疹 ,青竹蛇咬伤等。白 嫩叶还具有
健脑和增强脑细胞呼吸作用的功能 [ 1]。最近几十年 ,国内外对中草药白 颇为关注 ,在化学成分方
面研究很深 [2— 8 ]。白 叶中含黄酮、皂苷、强心苷、多糖、香豆素等药用成分 ,黄酮含量较高。现代药
理研究表明黄酮具有多种生物活性 [9, 10 ] ,主要表现在护肝、抗炎、抗菌抗病毒、免疫激活、抗氧化、抑
制肿瘤细胞、防治糖尿病及其并发症和对心血管系统的显著疗效等。
在白 组培研究中 ,虽然诱导率很高 ,但是在继代增殖过程中 ,会出现严重的褐化现象 ,使愈伤
组织受毒害而死亡。本文以白 叶片为外植体 ,诱导出的愈伤组织作为研究对象 ,探索出合理的继
代愈伤组织的激素组合 ,培养出生长状态良好的愈伤组织 ,并定量研究白 愈伤组织中总黄酮含
量 ,为利用植物组织培养法和细胞培养法生产药用成分提供优质的组培材料 ,为进一步探讨细胞培
养 ,筛选增殖快 ,药用有效成分含量高的细胞系奠定了基础。
2　实验部分
2. 1　材料与试剂
材料来源于四川省南充市金城山森林公园 ( 106°28′E , 30°45′N) ,现移栽至西华师范大学试验
田。 2008年 6月采集白 幼叶作为外植体。
德国 Eppendorf公司 Eppendrof Research移液器 ; 752型紫外可见光分光光度 (上海精密科学
仪器有限公司 ) ; G8023CSL-K3格兰仕微波炉 (中国佛山市格兰仕微波炉电器有限公司 ) ;北京赛多
利斯 BT124S型电子天平。 芦丁标准品 (中药固体制剂制造技术国家工程研究中心 ,编号:
1097-060918) ;金丝桃苷标准品 (中国药品生物制品检定所 ,编号: 111521-200303) ,实验用水为蒸
馏水。
2. 2　愈伤组织的诱导
外植体用自来水冲洗 3— 4h,然后在超净工作台上先用 0. 1%升汞消毒 90s,再用 2%次氯酸钠
溶液消毒 1min,期间不断摇动。取出后用无菌水冲洗 6— 8次 ,用无菌滤纸吸去表面水珠 . 叶片切成
5mm× 5mm ,培养在附加 2, 4-D 1. 0mg /L+ 6-BA 1. 0mg /L组合的 MS培养基上 ( p H= 6. 0) [11 ] ,接
种 100瓶 ,每瓶 4个外植体 ,重复 3次。培养温度为 ( 24± 1)℃ ,光照强度为 1000— 1500 lx ,时间为
14h /d。 20d后观察结果 ,统计出愈率。
2. 3　愈伤组织的继代培养
将初代培养得到的愈伤组织 ,分割成为体积大小 1cm3的愈伤组织团 ,接种到添加 6-BA的不
同浓度 0, 0. 2, 0. 4, 0. 6mg /L, 2, 4-D的不同浓度 0. 5, 1. 0, 1. 5, 2. 0mg /L交叉实验的 16种组合的
培养基上。 每个处理 10瓶 ,每瓶 3— 4个愈伤组织团。分别置于黑暗和光照中培养 (光照强度为
1000— 1500 lx ,时间为 14h /d)。 观察统计不同激素组合中愈伤组织的颜色 ,质地 ,生长情况和褐变
数据。
2. 4　样品处理和校准曲线
2. 4. 1　样品处理和提取液制备
分别取继代培养 5次 , 6次 , 7次的淡黄色、疏松的白 愈伤组织在 60℃烘箱中隔夜烘至恒重 ,
研细 ,过 40目筛。按料液比 1∶ 10用石油醚浸泡脱脂、脱色 24 h,样品置于通风处干燥。称取烘至
恒重白 叶粉末 2g ,过 100目筛 ,置索氏提取器中 ,用石油醚 ( b. p. 30-60℃ )连续回流脱脂、脱色
20h,通风干燥。
准确称取干燥的愈伤组织样品各 0. 1000g置于 50mL锥形瓶中 ,按料液比 1∶ 20加 50%乙醇 ,
微波功率 480W间歇提取 2次 ,每次 50s,合并提取液 ,在 5000r /min下离心 10min,取上清液。上清
液在 5000r /min下离心 5min。取上清液。用 50%乙醇溶解 ,定容于 10mL容量瓶中 ,作为提取液。再
从提取溶液中取 0. 5mL,稀释至 5mL,在 260nm波长下测定样品吸光度。
精确称取脱脂脱色素的白 叶粉 1. 000g,参考白 叶总黄酮提取工艺测定总黄酮含量 [ 12]。
2. 4. 2　标准溶液的配制及波长选择
精确称取 5. 0000mg芦丁标准品 ( 120℃减压干燥至恒重 )和 5. 0000mg金丝桃苷标准品 ,各用
50%乙醇溶解后 ,分别定容于 50mL容量瓶中 ,即得芦丁对照品液和金丝桃苷对照品液 ( 0. 1
mg /mL)。
在 240— 370nm内测定吸收值 ,选择芦丁、金丝桃苷和样品均有的最大或较大吸收波长 ,作为
紫外光分光光度法的测定波长。
2. 4. 3　校准曲线制作
取对照品溶液 0. 00、 0. 50、 1. 00、 1. 50、 2. 00 2. 50、 3. 00、 3. 50mL分别放入 1— 8号 10mL容量
940 光谱实验室 第 26卷
瓶中 (稀释后的浓度分别为 0. 000、 0. 005、 0. 010、 0. 015、 0. 020、 0. 025、 0. 030、 0. 035mg /mL) ,用紫
外光分光光度法测定吸光度。以吸光度 A为纵坐标、芦丁 (或金丝桃苷 )浓度 C为横坐标绘制校准
曲线。
2. 4. 4　精密度 ,稳定性 ,回收率测定
精密度: 分别准确吸取芦丁、金丝桃苷对照品溶液 1mL,在测定波长下重复测定 6次 ,计算
RSD。
稳定性:准确吸取 2. 4. 1制备的第五代愈伤组织提取溶液和上述两标准液各 0. 5mL,在测定
波长下每 5min测定 1次吸光度 ,考察 ( 40min) ,计算 RSD。
回收率:准确吸取 1. 4. 1制备的第五代愈伤组织提取液 6份 ,每份 0. 5mL,分别置 10mL容量
瓶中 ,加入一定量芦丁或金丝桃苷对照品 ,按测定波长项下处理 ,计算平均回收率和 RSD。
3　结果与讨论
3. 1　白 初代培养中愈伤组织诱导
实验发现 ,外植体植入 7d后 ,叶片开始卷曲。 14d后 ,外植体伤口处开始膨大 ,并出现淡绿愈伤
组织。 接种 25d后 ,培养基中的愈伤组织大量生长。出愈率达 92. 1% 。
3. 2　光照对愈伤组织诱导及增殖生长的影响
白 幼叶在光照和黑暗条件下都能诱导出愈伤组织 ,光照条件下比黑暗条件下愈伤组织的诱
导率高 ,出愈时间短 ,且出愈量多 ,质地佳 [11 ]。在以后继代培养时发现 ,在黑暗条件下的愈伤组织生
长缓慢 ,甚至停止生长 ,逐渐褐化死亡 ;而在光照条件下的愈伤组织生长较快。因此 ,选择光照条件
下诱导愈伤组织对以后继代增殖和保存愈伤组织十分有利。如图 1,是在光照条件下生长状态良好
的愈伤组织。
图 1　生长状态良好的白 愈伤组织
3. 3　不同激素浓度及配比对继代愈伤组织的影响
实验结果表明 ,初代白 愈伤组织在植物生长调节剂 6-BA和 2, 4-D不同浓度及配比进行交
叉实验中 ,继代的愈伤组织生长情况具有一定的差异性 (表 1)。 16种组合中 ,以添加 2, 4-D1. 0
mg /L+ 6-BA0. 6mg /L组合的培养基中愈伤组织生长最好 ,接种 10d后愈伤组织生长旺盛 ,黄绿
色 ,疏松 ,实验后期褐化率很小 ,仅有 1. 54% 。因此选择 2, 4-D1. 0mg /L+ 6-BA0. 6mg /L作为白
愈伤组织继代培养的最佳激素组合。 从表 1可见 ,提高 2, 4-D浓度加重愈伤组织褐化。从 16种组
合对应的褐化率来看 ,在 6-BA一定时 ,高浓度 2, 4-D会使白 愈伤组织产生褐化。 在培养 30d左
941第 4期 柴淳等:白 愈伤组织培养条件优化及总黄酮含量测定
右 ,少数愈伤组织团因为营养物质耗竭有玻璃化的倾向。 所以为了保持愈伤组织生长的良好状态 ,
选择 20— 25d继代一次。
表 1　不同激素浓度及配比对继代愈伤组织的影响
实验组 6-BA 2, 4-D 出愈量 愈伤组织颜色质地 褐化率 (% )
1 0 0. 5 + 浅绿色 ,疏松 8. 9
2 0 1. 0 + + 黄绿色 ,致密 16. 2
3 0 1. 5 + + 黄褐色 ,坚硬 37. 9
4 0 2. 0 + + + 黄褐色 ,坚硬 33. 7
5 0. 2 0. 5 + 浅绿的 ,疏松 3. 2
6 0. 2 1. 0 + + 浅绿色 ,疏松 8. 9
7 0. 2 1. 5 + + + + 黄绿色 ,水浸状 13. 6
8 0. 2 2. 0 + + + 黄褐色 ,致密 37. 8
9 0. 4 0. 5 + 浅绿色 ,疏松 21. 3
10 0. 4 1. 0 + + 黄绿色 ,致密 41. 2
11 0. 4 1. 5 + + 黄褐色 ,坚硬 53. 8
12 0. 4 2. 0 + + + 黄褐色 ,坚硬 57. 3
13 0. 6 0. 5 + + 淡绿色 ,致密 5. 4
14 0. 6 1. 0 + + + + 黄绿色 ,疏松 1. 54
15 0. 6 1. 5 + + 黄绿色 ,水浸状 31. 7
16 0. 6 2. 0 + + 浅褐色 ,坚硬 35. 4
3. 4　波长确定和校准曲线绘制
经测定 ,在波长 260nm处芦丁和金丝桃苷均有最大吸收、样品也有较大吸收 ,测定波长为
260nm。经计算得到校准曲线 (芦丁 )的回归方程为 y= 33. 387C+ 0. 0062,相关系数 r= 0. 9999,在
0. 005— 0. 035mg /mL范围内呈良好的线性关系。校准曲线 (金丝桃苷 )的回归方程为 y= 46. 343C
+ 0. 0028,相关系数 r= 0. 9999,在 0. 005— 0. 035mg /mL范围内呈良好的线性关系。
3. 5　精密度、稳定性、加样回收率试验结果
以芦丁为标准品时 ,精密度和稳定性试验的 RSD分别为 1. 124%和 0. 135% ,以金丝桃苷为标
准品时 ,精密度和稳定性试验的 RSD分别为 0. 424%和 0. 238% 。如表 2,芦丁和金丝桃苷的平均回
收率为 98. 1%和 98% 。以上结果表明两种测定方法的精密度、稳定性良好 ,经回收率试验证明都具
有良好的准确度和重现性 ,都适用于白 总黄酮的测定。
表 2　加样回收率实验结果
样品
总黄酮含量
(mg)
芦丁 金丝桃苷
加标量
( mg)
芦丁 金丝桃苷
加标后总黄
酮含量 ( mg)
芦丁 金丝桃苷
回收率
(% )
芦丁 金丝桃苷
平均回收率
(% )
芦丁 金丝桃苷
RSD
(% )
芦丁 金丝桃苷
1 0. 293 0. 212 0. 0526 0. 0515 0. 338 0. 258 97. 7 98. 0
2 0. 293 0. 212 0. 0526 0. 0515 0. 339 0. 257 98. 1 97. 5
3 0. 293 0. 212 0. 0526 0. 0515 0. 342 0. 256 98. 8 97. 3 98. 1 98. 0 0. 545 0. 629
4 0. 293 0. 212 0. 0526 0. 0515 0. 338 0. 261 97. 9 99. 0
5 0. 293 0. 212 0. 0526 0. 0515 0. 341 0. 259 98. 7 98. 2
6 0. 293 0. 212 0. 0526 0. 0515 0. 337 0. 257 97. 4 97. 6
3. 6　不同继代次数的白 愈伤组织总黄酮含量
测定不同继代次数的愈伤组织样品和叶片样品中芦丁和金丝桃苷的含量 (图 2) ,愈伤组织中
芦丁和金丝桃苷含量随继代的次数增加而略有降低。本试验测定愈伤组织总黄酮含量高于叶片含
量。以芦丁为标准品时 ,第五代愈伤组织总黄酮含量比叶片总黄酮含量高 31. 67% 。以金丝桃苷为
标准品时 ,第五代愈伤组织总黄酮含量比叶片总黄酮含量高 31. 63% 。
942 光谱实验室 第 26卷
图 2　不同继代次数的愈伤组织和叶片中
总黄酮含量比较
本文参考微波法提取白 叶总黄酮的最佳工艺条
件 ,本试验结果证实此方法也适用于提取白 愈伤组织
中的黄酮类化合物 ,而且提取的黄酮含量较高。 状态良
好的愈伤组织总黄酮含量 ( 2. 935% )高于白 叶总黄酮
的含量 ( 2. 228% )。但随着继代次数的增加 ,总黄酮含量
略有下降。也有类似的情况 ,如淫羊藿愈伤组织总黄酮
含量为 5. 36% ,愈伤组织继代半年后 ,总黄酮含量为 5.
01%
[13 ]。但这种下降不影响以白 总黄酮为目的的细胞
培养 ,可以选择继代次数低时提取总黄酮。
4　结论
在白 愈伤组织继代培养过程中 ,愈伤组织能在激
素组合 2, 4-D 1. 0mg /L+ 6-BA 0. 6mg /L的 MS培养基中生长速度快 ,状态良好。避免了白 愈伤
组织继代中高褐化的问题。 光照和适宜的温度 ( 24℃ )有利于诱导和增殖愈伤组织。以芦丁为标准
品 , 本实验诱导出的愈伤组织总黄酮含量较高 ( 29. 347mg /g ) ,高于白 叶总黄酮含量
( 22. 278mg /g) ,这样增殖培养出的愈伤组织有利于建立悬浮培养的白 总黄酮细胞体系。
参考文献
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Optimization of Callus Culture Condition and Determination
of Total Flavonoids in Callus of Acanthopanax Trifoliatus
CHAI Chun　 LI Yun-Xiang　 CHEN Guang-Deng　 YU Tao
(Col lege of Lif e Science,China West N ormal University ,N anchong , Sichuan 637009, P. R. China )
(Key Laborator y o f Southwest Ch ina W ildl if e Resources Conservat ion (China West Normal University,
Ministr y of Education ,N anchong , Sichuan 637009, P. R. China )
943第 4期 柴淳等:白 愈伤组织培养条件优化及总黄酮含量测定
Abstract　 In this paper, callus of Acanthopanax trif ol iatus subculture conditions w ere optimized
and content of total flavonoids in callus w ere determined. The result shows that subculture callus grow
fast and keep callus in good condition in the M S culture medium with ho rmone combination
2, 4-D1. 0mg /L+ 6-BA0. 6mg /L. This hormone combination can prevent former serious brow ning
phenomenon. In this paper, acco rding to optimal ext raction process in leaves of ifoliatus, the total
f lavonoids in callus of A. t rifoliatus were ex tracted by means of microwave-assisted. The content of
total flavonoids in callus of A. t rifoliatus w as determined at 260nm by ultraviolet spectrophotometry
w ith rutin and was hyperoside as standard control. The result show ed that the content of total
f lavonoids of callus was 29. 347mg /g and was higher than the content of total f lav onoids in leaves of
Acanthopanax Tri fol iatus.
Keywords　 Acanthopanax Trifoliatus; Callus; Total Flavonoids; Microwave-Assisted Ex traction;
Ult raviolet Spect rophotometry
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8 分析试验室 17 分子催化 26 核化学与放射化学
9 色谱 18 化学研究与应用
944 光谱实验室 第 26卷