全 文 ：◎研究原著 ◎ 中国临床药理学与治疗学中国药理学会主办
CN 34-1206 R , ISSN 1009-2501
E-mail:editorys@mail.wh.ah.cn
2003 Feb;8(1):11-14
2002-10-07收稿　2002-10-25修回
1 由国家卫生部课题(981345)、湖南省科委重点课题(98SSY1001)、湖
南省卫生厅中医药科研基金课题(2000006)共同资助。
杨 茗 ,女 ,硕士研究生 ,研究方向为金粉蕨素抑制血管平滑肌增殖作
用及相关机制。
黄红林 , 通讯作者 ,硕士生导师 , 教授 , 主要从事植物雌激素对心血
管病防治及机制方面的研究。
Tel:0734-8281408 　 E-mai l:deny1232001@yahoo.com.cn
金粉蕨素抑制大鼠主动脉平滑肌增殖作用及机制1
杨 茗 ,廖端芳 ,朱炳阳 ,黄红林
南华大学药物药理研究所 ,衡阳　421001 ,湖南
摘要　目的:观察金粉蕨素对牛血清刺激的大鼠主
动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用 ,并对其作用机制
进行初步探讨。方法:体外培养大鼠主动脉平滑肌
细胞 ,以终浓度为 10%的新生牛血清(NCS)作为刺
激因素 ,用噻唑蓝(MTT)比色法和细胞计数法观察
细胞增殖状况 ,用流式细胞仪分析细胞周期 , 用
Western blot实验测定蛋白表达 。结果:与 10%牛血
清组相比 ,不同浓度金粉蕨素组的MTT 测定值与细
胞数目均明显下降(P <0.05),其下降幅度呈浓度
依赖性;10μmol·L-1时达峰值(P <0.01);细胞周期
分析显示 ,金粉蕨素组 G1期百分比(85.1%)高于
10%牛血清组(70.0%),而 S 期比例(4.3%)低于
10%牛血清组(16.4%);Western blot结果显示给药
组P-ERK1 2蛋白表达明显低于同时间点牛血清组 。
结论:金粉蕨素能阻止细胞周期由G0 G1期向 S 期
推进 ,抑制血管平滑肌细胞增殖 ,此作用与其抑制
ERK1 2磷酸化 、影响MAPK ERK通路激活有关 。
关键词　药理学;抑制主动脉平滑肌增殖;金粉蕨
素;血管平滑肌细胞;细胞外信号调节激酶
中图分类号:R285.5
文献标识码:A
文 章 编 号:1009-2501(2003)01-0011-04
动脉粥样硬化(arteriosclerosis , AS)是严重威胁
人类健康的疾病之一 , 血管平滑肌细胞(vascular
smooth muscle cells ,VSMC)是粥样硬化斑块中最主要
的细胞成分 ,其增殖在AS 发生发展中起关键作用。
属于植物雌激素的黄酮类化合物如 genistein 具有抑
制动脉壁增生 ,抑制 VSMC 增殖的作用[ 1] 。金粉蕨
素(onychin , Ony)也属黄酮类化合物 ,它是中国蕨科
(sinopterideceae)金粉蕨属(onychium ching)栗柄金粉
蕨(onychin lncidum)植物全草中提取的一种新型二
氢黄酮甙[ 2] 。金粉蕨素与橙皮甙(hesperidin)结构相
似 ,橙皮甙曾用于高血压及动脉硬化的防治 。我室
近期研究发现 ,金粉蕨素药理活性稳定 ,具有对抗肝
脏脂质过氧化作用[ 3] ,还能促进血管内皮细胞释放
一氧化氮和前列腺素 ,保护血管内皮依赖性舒张功
能[ 4] ,对心血管系统具有较明显的保护作用。本实
验拟观察金粉蕨素对牛血清诱导的大鼠 VSMC 增殖
的抑制作用及有关信号转导机制 。
1　材料与方法
1.1　材料 　SD大鼠由南华大学实验动物中心提
供 。DMEM 购自 Gibco 公司;胰蛋白酶购自 Hyclone
公司;新生牛血清购自杭州四季清公司;噻唑蓝
(MTT), Ⅱ型胶原酶 ,弹性蛋白酶 , genistein购自 Sig-
ma公司 。磷酸化 ERK1 2一抗 、二抗购自 Canta Cruz
公司。金粉蕨素为本实验室提取(纯度>98%), 0.5
mol·L-1母液用 DMSO 溶解 ,用含 0.1%新生牛血清
的 DMEM 培养液稀释至应用浓度。
1.2　VSMC的原代培养及传代　采用本实验室建
立的复合胶原酶法培养 VSMC[ 5] 。选取 150 ～ 200 g
雄性 SD大鼠在无菌条件下取出胸主动脉 ,分离中
膜 ,用含 20%新生牛血清的 DMEM 培养液孵育过
夜 ,PBS 冲洗 2 ～ 3 次 , 然后将血管中膜置于含 2
g·L-1 Ⅱ型胶原酶和 0.25 g·L-1弹性蛋白酶的消化
液中 ,消化约 2 h 左右 ,离心收集细胞 ,以(1 ～ 3)×
10
7·L-1的密度接种于 25 ml培养瓶中 ,置于 37 ℃,
5%CO2 培养箱中培养。待细胞融合后按常规方法
传代 ,传代细胞用含 10%新生牛血清的 DMEM培养
液培养 。取第三代用 α-actin 免疫组化法鉴定
·11·
VSMC ,实验用 3 ～ 8代的传代细胞 。
1.3　噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖　取生长
良好的 3 ～ 8代细胞制成细胞悬液 ,以 5×107 密度
接种于96孔板 ,待细胞长至 70%融合状态时 ,用含
0.1%新生牛血清的DMEM 培养 48 h ,随机分为对照
组(10%牛血清组)、不同浓度金粉蕨素给药组(牛血
清终浓度为10%)和 genistein阳性药物对照组 ,每组
设6个平行孔 ,加入不同的处理因素继续孵育 24 h ,
金粉蕨素与 genistein在给牛血清前 30 min加入(以
下实验皆同)。在培养结束前 4 ～ 6 h 每孔加入 5
g·L-1 MTT 10μl ,二甲基亚砜终止反应 ,震荡混匀后
用酶免疫仪在 570 nm读取吸光度值 ,以吸光度(A)
值反映细胞的增殖情况。
1.4　细胞计数　取处于对数生长期的平滑肌细胞
以5×107 均匀接种于24孔板中 ,每孔 0.5 ml(2.5×
10
4个细胞), 24 h 后加入不同处理因素 ,分别培养
24 h ,48 h后收集细胞 ,经 0.5%台盼蓝染色后进行
细胞计数 。
1.5　VSMC 增殖周期观察　收获细胞 , PBS 洗 2
次 ,4 ℃ 1000 r·min-1离心 5 min , 弃上清 ,用 50 μl
PBS将细胞吹打成单细胞悬液 ,加入 75%乙醇 4 ℃
固定 24 h 。用 PBS洗细胞 2次 ,加 PI荧光染料(5 m
g·L-1 PI ,20 mg·L-1 RNase A)于 4 ℃冰箱中放置 45
min ,300目尼龙网滤过 ,用流式细胞仪检测分析 。
1.6　Western blot法测定 P-ERK1 2　配制 10%的
SDS-PAGE分离胶和 3%的浓缩胶 ,每孔加入 20 μg
蛋白样品 ,置电泳缓冲液中 , 60 V电泳约 30 min ,待
样品进入分离胶后 ,120 V电泳至所需时间 。将蛋
白转印至硝酸纤维素膜 , PBST 配制的 5%脱脂牛奶
室温封闭 1.5 ～ 2 h ,一抗 4 ℃过夜 , TBST 洗膜 3
次 ,每次 10 min ,二抗室温孵育 2 h ,TBST 洗膜 ,发光
剂孵育 ,显影 ,计算机灰度扫描处理 。
1.7　统计分析　实验数据以 x ±s表示 ,采用SPSS
软件分析组间差异。
2　结果
2.1　金粉蕨素对牛血清诱导的 VSMC增殖的影响
　噻唑蓝比色分析法和细胞计数结果见表 1。经
0.1%牛血清 DMEM培养液静止于 G0 G1期的大鼠
胸主动脉平滑肌细胞重新换以含 10%新生牛血清
DMEM培养液后平滑肌细胞对 MTT 的代谢率显著
增高 ,细胞数目明显增多 。与之相比 ,含有不同浓度
金粉蕨素的各组细胞 MTT 代谢率与细胞数目增高
幅度有不同程度的降低 ,当药物浓度为 10μmol·L-1
时 ,增高幅度最小 。与 genistein组相比 ,其抑制增殖
的效果相当 ,数值上无显著差别 。此结果提示 ,金粉
蕨素对大鼠胸主动脉平滑肌细胞的增殖有抑制作
用 ,药物浓度为 10μmol·L-1时作用达峰值。
2.2　金粉蕨素对 VSMC周期分布特征的影响　
10%新生牛血清与不同浓度的金粉蕨素共同作用于
血管平滑肌 24 h后 ,细胞周期分布表明金粉蕨素能
够使牛血清刺激下的 VSMC 大部分集中在 G0 G1
期 ,与对照组相比 ,差异显著(图 1)。
图 1　不同浓度的金粉蕨素对大鼠胸主动脉平滑肌细胞周
期分布的影响
A:0.1%NCS组;B:10%NCS 组;C:Ony 10μmol·L-1 +10%NCS
组;D:Genistein 10μmol·L-1+10% NCS组
2.3　金粉蕨素对 VSMC ERK1 2磷酸化的抑制作
用　Western blot结果(图 2)显示 ,经 0.1%牛血清同
步化的平滑肌细胞 ERK磷酸化程度低 ,加入 10%牛
血清5 min时 ERK磷酸化程度即达到高峰 。我们观
察了 5 ,10 ,20 min 3个时间点 ,结果发现 ,药物保护
组(onychin 10 μmol·L-1)与同时间点 10%牛血清组
相比 ,ERK1 2磷酸化程度减弱 ,提示金粉蕨素能抑
制 ERK1 2磷酸化 ,影响MAPK信号转导途径 。
·12· Chin J Clin Pharmacol Ther 2003 Feb;8(1)
表 1　不同浓度的金粉蕨素对大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖的影响(x±s , n=6)
组别 浓度 μmol·L-1
细胞计数(×104)
　　　　24 h　　　 　　　　　48 h　　　　 MTT 测定(A)
Control 0.1%NCS 　　- 　　- 0.44±0.04
10%NCS 3.87±0.57 5.84±0.98 1.21±0.06
金粉蕨素 1 3.66±0.24b 5.50±0.26b 1.13±0.09b
5 3.18±0.70c 4.94±0.13c 0.95±0.47c
10 2.83±0.51c 4.29±0.56c 0.71±0.51c
50 2.92±0.91c 4.38±0.23c 0.75±0.04c
Genistein 10 2.79±0.77c 4.48±0.45c 0.72±0.06c
与 10%NCS组比较bP<0.05 , cP<0.01
图 2　金粉蕨素影响平滑肌细胞 ERK1 2 磷酸化的影响
1:Control;2:Gen 10 min;3:10%NCS 2 min;4:Ony 2 min;5:10%NCS
5 min;6:Ony 5 min;7:10%NCS 10 min;8:Ony 10 min;与同一时间
10%NCS组比较 , bP<0.05
3　讨论
金粉蕨素是我室与云南昆明植物研究所共同开
发研制的一种新型二氢黄酮甙类化合物 。与同类化
合物相比 ,它来源广泛 ,化学结构稳定 , 据初步研究
发现有一定心血管保护作用。我室曾用离体血管环
实验测定金粉蕨素对血管内皮舒张功能的保护作
用 ,结果发现 ,金粉蕨素对溶血性磷脂酰胆碱损伤血
管内皮依赖性舒张功能具有明显的保护作用[ 4] 。本
实验发现 , 金粉蕨素能抑制牛血清刺激引起的
VSMC 的增殖 ,进一步肯定了金粉蕨素在心血管疾
病防治方面的药用价值。
VSMC的增殖是高血压 、动脉粥样硬化 、血管再
狭窄等多种心血管疾病的共同病理特征 。抑制
VSMC增殖是心血管疾病防治的一个重要靶点。细
胞增殖是外界增殖信号作用于细胞膜或胞浆受体 ,
经细胞内信号传递进而影响细胞周期的结果;具有
分裂能力的细胞均通过进入细胞周期而增殖。一般
情况下 , 细胞无增殖活动时皆停留 于G0 G1期 , 在
某些因素激活下 , 启动DNA合成进入 S期及M 期 ,
使细胞增殖分化。细胞的增殖和分化是一个极其复
杂和有序的过程 ,在这一过程中周期的调控是一个
关键环节 ,它是在各期的控制点(checkpoints)上进行
的 。目前认为主要存在两个控制点:G1※S 及G2※
M ,其中G1 S 交界处在酵母菌中称为 start 点 ,而在
哺乳类动物细胞中称为限制点(restrictionpoint),只
要 G1期内的正调节因子累积达到一定程度 ,周期
越过该点 ,以后细胞就不再依赖于细胞外促生长因
子而顺序完成整个细胞周期 ,可见该限制点是影响
细胞周期的最关键点。本实验结果显示 ,金粉蕨素
作用组细胞在接受牛血清刺激 24 h后 ,与对照组相
比仍主要集中在 G0 G1期 ,S 期比例明显低于对照
组 。说明金粉蕨素能有效抑制 VSMC 的增殖 ,并主
要使细胞阻滞在G0 G1期 ,抑制细胞进入 S期 ,阻断
细胞周期进程。
细胞的增殖是由细胞周期决定的 ,细胞周期的
顺利进行有赖于细胞在周期的转换过程中受到适当
的信号刺激 。MAPK家族中的 ERK信号转导通路是
最为普遍的促进细胞增殖和分化的信号途径[ 6] ,能
被多种生长因子 、细胞因子及促分裂剂激活 。细胞
因子与其相应受体结合后能通过膜上的蛋白酪氨酸
受体将信号传给 Ras ,Ras发生膜转位并激活丝氨酸
苏氨酸激酶 Raf ,然后通过 MEK使 ERK1 2磷酸化
而激活 ,后者又激活转录因子并促使周期蛋白 cyclin
D1表达[ 7] 。有实验表明 cyclin D1在G1 S过渡中起
关键作用 ,它与相应的周期蛋白激酶 4 , 6结合成为
视网膜细胞瘤蛋白(Rb)激酶使 Rb磷酸化 ,解除 Rb
对转录因子 E2F的抑制作用 ,促使多种G1 S期转换
·13·中国临床药理学与治疗学 2003 Feb;8(1)
及DNA复制所需基因的表达[ 8] ,从而使整个细胞周
期向前推进 。我们在实验中发现 ,当有金粉蕨素存
在时 ,磷酸化 ERK1 2蛋白表达减少 ,提示金粉蕨素
影响细胞周期进程 、抑制平滑肌细胞增殖与阻碍
ERK1 2磷酸化有关。MAPK ERK 通路是 Ras 、PKC 、
PKA 、G 蛋白 、酪氨酸蛋白磷酸酶和丝 苏氨酸蛋白磷
酸酶等多条信号通路的汇聚点 ,金粉蕨素经何种途
径影响MAPK ERK磷酸化仍有待进一步研究。
参 考 文 献
1　Dubey RK , Gillespie DG , Imthurn B , et al.Phytoestrogens in-
hibit growth and MAP kinase activity in human aortic smooth
muscle cells[ J] .Hypertension , 1999;33:177-82
2　许云龙 ,郑兴 , 何以能.粟柄金粉蕨素黄酮成分[ J] .云南
植物研究 , 1999;497-540
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Effects and mechanism of onychin on proliferation of rat vascular smooth
muscle cells
1
YANG Ming , LIAO Duan-Fang , ZHU Bing-Yang , HUANG Hong-Lin
Institute of Pharmacy &Pharmacology , Nanhua University , Hengyang 421001 , Hunan
ABSTRACT　AIM:To investigate the effects of on-
ychin (Ony)on proliferation of cultured aortic smooth
muscle cells.METHODS:Cell culture technique was
used in vitro.The inhibited effect of Ony on the prolifer-
ation of SMC was observed by measuring MTT metabolism
and cell counting.Flow cytometry was performed to track
cell cycle progression.Western blots were performed to
examine ERK1 2 phosphorylation.RESULTS:The me-
tabolism of MTT by VSMC and cell number of onychin
group are declined markedly .There were dose-dependent
inhibited effects on VSMC in four different concentrations
of Onychin.This inhibited effect reached plateau at 10
μmol·L-1.As compared with those of the control group ,
differences were significant(P <0.01).Flow cytometry
analysis indicated that the G1-Phase fraction ratios of on-
ychin group(85.1%)were higher than that of 10%NCS
group (70.0%) while its S-Phase fraction ratios
(4.3%)were lower than that of 10%NCS group
(16.4%).Western blot results displayed that Ony inhib-
ited the phospphorylation of ERK1 2 compared to control
group.CONCLUSION:Onychin can inhibit the prolif-
eration of VSMC through G1 phase cell cycle arrest.This
effect may be related to influence on MAPK ERK trans-
duction by inhibiting the phosphorylation of ERK1 2.
KEY WORDS　pharmacology;onychin;aortic vascular
smooth muscle cells;MAPK ERK
·14· Chin J Clin Pharmacol Ther 2003 Feb;8(1)