全 文 ：［收稿日期］ 20151116(007)
［基金项目］ 辽宁省十二五规划“辽宁省中药材标准”编写项目
［第一作者］ 常安，在读硕士，从事中药鉴定与品质评价，Tel:15140269906，E-mail:changan0225@ 163. com
［通讯作者］ * 康廷国，教授，博士生导师，从事中药鉴定与品质评价，Tel:0411-87586018，E-mail:kangtg@ lnutcm． edu． cn
UPLC测定狭山野豌豆中 6 种化学成分的含量
常安1，王维宁2，郝延军2，杨燕云1，许亮1，康廷国1*
(1. 辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600;2. 辽宁省药品检验检测院，沈阳 110030)
［摘要］ 目的:建立超高效液相色谱法(UPLC)同时测定狭山野豌豆中 6 种成分(绿原酸、杨梅苷、金丝桃苷、异槲皮苷、
山柰苷、槲皮苷)的含量测定方法。方法:采用 Eclipse Plus C18 ＲＲHD色谱柱(2. 1 mm × 50 mm，1. 8 μm) ，以乙腈(B)-0. 1%甲
酸溶液(A)为流动相进行梯度洗脱(0 ～ 7 min，5% ～ 10% B;7 ～ 11 min，10% ～ 12% B;11 ～ 20 min，12% B;20 ～ 25 min，12% ～
19%B;25 ～ 30 min，19% ～24%B) ，流速 0. 2 mL·min －1，检测波长 340 nm，柱温 30 ℃。结果:狭山野豌豆中 6 个成分在线性范
围内呈现良好的线性关系，r ＞ 0. 999 9，回收率均在 99. 15% ～ 101. 98%，ＲSD 0. 7% ～ 1. 7%。结论:该方法操作简便、精确，稳
定性重复性好，可用于同时测定狭山野豌豆中 6 种化学成分的含量，为狭山野豌豆的质量控制提供依据。
［关键词］ 狭山野豌豆;超高效液相色谱法;绿原酸;杨梅苷;金丝桃苷;异槲皮苷;山柰苷;槲皮苷
［中图分类号］ Ｒ284. 1 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2016)09-0048-04
［doi］ 10. 13422 / j． cnki． syfjx． 2016090048
Simultaneous Determination of Six Compounds in
Vicia amoena var． angusta by UPLC
CHANG An1，WANG Wei-ning2，HAO Yan-jun2，YANG Yan-yun1，XU Liang1，KANG Ting-guo1*
(1. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China;
2. Liaoning Institute for Drug Control，Shenyang 110030，China)
［Abstract］ Objective:To establish an UPLC method for simultaneously determining content of 6 major
compounds (chlorogenic acid，myricitrin，hyperoside，isoquercitrin，kaempferitrin，quercitrin)in Vicia amoena
var． angusta． Method:An Eclipse Plus C18 ＲＲHD column (2. 1 mm × 50 mm，1. 8 μm)was adopted，with
acetonitrile (B)-0. 1% formic acid aqueous solution (A)as mobile phase for gradient elution (0-7 min，5% -
10%B;7-11 min，10% -12% B;11-20 min，12% B;20-25 min，12% -19% B;25-30 min，19% -24% B)．
The flow rate was 0. 2 mL·min －1 ． The detection wavelength was set at 340 nm and the column temperature was at
30 ℃ ． Ｒesult:Six components of V． amoena var． angusta showed good linear relationship in the linear range
(r ＞ 0. 999 9)and the average recoveries were between 99. 15% to 101. 98% with the ＲSD of 0. 7% -1. 7% ．
Conclusion:The developed method is convenient， rapid and accurate with high repeatability and stability，
suitable for simultaneously determining contents of 6 compounds in V． amoena var． angusta and can provide basis
for the quality control of V． amoena var． angusta．
［Key words］ Vicia amoena var． angusta; UPLC; chlorogenic acid; myricitrin; hyperoside;
isoquercitrin;kaempferitrin;quercitrin
狭山野豌豆多生于较干燥地，例如固定沙丘、沙
地、向阳山坡等。其小叶为延长的长圆形或长圆状
线形、近线形，其余特征与山野豌豆相同［1］。2010
年版《中国药典》一部附录Ⅲ收载其与山野豌豆、毛
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山野豌豆、假香野豌豆、广布野豌豆干燥地上部分作
为透骨草药用［2］，主要功效祛风除湿、活血止痛，临
床上用于湿疼痛、疮疡肿毒等［3］。野豌豆属植物全
草和叶含有多种黄酮类成分［4-5］，现代药理研究表
明野豌豆属植物具有抗炎镇痛、抗肿瘤、体外抗真菌
活性、有抗氧化、清除自由基、抗疲劳以及抗过敏等
作用［6］。透骨草药材几乎全部依赖野生资源，随着
透骨草药材在各地区使用情况不一，野生资源也正
慢慢受到破坏，同时在辽宁省中药资源普查中发现
辽宁地区市场上流通的透骨草药材主要以狭山野豌
豆入药居多，但是目前关于狭山野豌豆研究甚少。
因此，其化学成分及质量控制具有重要的意义。本
课题组通过 UPLC-Q-TOF-MS 对狭山野豌豆化学成
分进行定性研究并通过对照品对比确认可知狭山野
豌豆中含有绿原酸、杨梅苷、金丝桃苷、异槲皮苷、山
柰苷、槲皮苷，因此，本试验采用 UPLC 同时测定狭
山野豌豆中 6 种化学成分的含量，为狭山野豌豆质
量控制提供科学依据［7-13］。
1 仪器与试药
1290 Infinity系列超高效液相色谱仪(美国安捷
伦公司，配备高压二元梯度泵、可控温自动进样器和
二极管阵列检测器) ，ACCULAB ALC-11C 4 型电子
天平(德国赛多利斯集团) ，DFT-200 型粉碎机(温
岭市林大机械有限公司) ，HH-4 型数显恒温水浴锅
(上海蓝凯仪器仪表有限公司)。
对照品槲皮苷(批号 111538-200504) ，金丝桃
苷(批号 111521-201406) ，杨梅苷(批号 111860-
201102) ，绿原酸(批号 110753-201314) ，异槲皮苷
(批号 111809-201403) ，山柰苷 (批号 111775-
200701)均购于中国食品药品检定研究院。乙腈、
甲酸为色谱纯，纯净水(杭州娃哈哈集团有限公
司) ，其他试剂均为分析纯。狭山野豌豆 10 批样品
均采自不同产地，经辽宁省药品检验检测院中药室
主任药师王维宁鉴定为狭山野豌豆 Vicia amoena
var． angusta的干燥地上部分，样品标本保留在辽宁
省药品检验检测院。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 Eclipse Plus C18 ＲＲHD 色谱柱
(2. 1 mm ×50 mm，1. 8 μm) ，流动相乙腈(B)-0. 1%
甲酸溶液(A)梯度洗脱(0 ～ 7 min，5% ～ 10% B;
7 ～ 11 min，10% ～ 12% B;11 ～ 20 min，12% B;20 ～
25 min，12% ～ 19% B;25 ～ 30 min，19% ～ 24% B) ，
柱温 30 ℃，检测波长 340 nm，流速 0. 2 mL·min －1，
进样量 2 μL。见图 1。上述色谱条件下，样品各色
谱峰保留时间适中，样品中各组分的色谱峰分离度
良好。
A．混合对照品;B．供试品;1. 绿原酸;2. 杨梅苷;3. 金丝桃苷;4. 异
槲皮苷;5. 山柰苷;6. 槲皮苷
图 1 狭山野豌豆 UPLC色谱
Fig． 1 Chromatograms of sample from Vicia amoena var． angusta
2. 2 对照品溶液制备 精密称定对照品绿原酸、杨
梅苷、金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷适量，加
入甲醇分别制备含 0. 024，0. 052，0. 033，0. 062，
0. 075，0. 114 mg·L －1的混合对照品溶液，摇匀，
备用。
2. 3 供试品溶液制备 取样品粉末(过 40 目筛) ，
精密称定 1 g，加入 70%甲醇 80 mL，回流 2 h，提取
液蒸干，残渣加 70%甲醇溶解，定容至 10 mL 量瓶
中，摇匀，过 0. 22 μm微孔滤膜，得供试品溶液。
2. 4 标准曲线绘制 精密吸取 2. 2 项下混合对照
品溶液，用 70%甲醇稀释配制系列梯度浓度的对照
品混合溶液，依法测定峰面积，以对照品的峰面积
(Y)对相应的浓度(X)进行线性回归，得回归方程、
相关系数及线性范围，结果见表 1。
表 1 6 种主要成分的线性方程、相关系数、线性范围
Table 1 Linear equations，correlation coefficients，linear ranges of
six constituents
成分 标准曲线
线性范围
/μg·L －1
绿原酸 Y = 12 337X － 1. 333 0. 012 ～ 0. 144
杨梅苷 Y = 9 042. 8X + 1. 081 0. 026 ～ 0. 312
金丝桃苷 Y = 10 759X － 5. 594 3 0. 017 ～ 0. 198
异槲皮苷 Y = 9 656. 1X － 12. 611 0. 031 ～ 0. 372
山柰苷 Y = 7 328. 20X － 4. 253 0. 038 ～ 0. 451
槲皮苷 Y = 9 713. 4X － 10. 344 0. 057 ～ 0. 684
注:r均为 0. 999 9。
2. 5 精密度试验 取同一供试品溶液 S1(朝阳县
木头城子)2 μL，重复进样 6 次，测定各组分的峰面
积值，计算得绿原酸、杨梅苷、金丝桃苷、异槲皮苷、
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山柰苷、槲皮苷 ＲSD 分别为 0. 2%，0. 5%，1. 0%，
0. 4%，1. 8%，0. 8%。显示仪器精密度良好。
2. 6 稳定性试验 取同一供试品溶液 S1(朝阳县
木头城子)分别于 0，4，8，12，24，48 h 进样 2 μL，记
录峰面积。结果绿原酸、杨梅苷、金丝桃苷、异槲皮
苷、山柰苷、槲皮苷峰面积的 ＲSD 分别为 1. 2%，
2. 1%，1. 7%，1. 9%，1. 6%，1. 7%，表明狭山野豌豆
供试品溶液在 48 h内稳定性良好。
2. 7 重复性试验 取同一供试品 S1(朝阳县木头
城子)约 1 g，共 6 份，精密称定，按 2. 3 项下方法平
行操作，制备 6 份供试液，按 2. 1 项下方法测定，结
果绿原酸、杨梅苷、金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲
皮苷的平均质量分数分别为 0. 49%，1. 37%，
0. 33%，0. 66%，1. 39%，1. 43%，ＲSD 分 别 为
1. 0%，1. 3%，1. 5%，0. 9%，1. 1%，1. 6%，表明该方
法重复性良好。
2. 8 加样回收率试验 取同一供试品 S1(朝阳县
木头城子)6 份，每份约 0. 5 g，精密称定，分别精密
加入混合对照品溶液适量，按 2. 3 项下方法制备供
试溶液并依法测定，计算加样回收率，结果见表 2。
表 2 狭山野豌豆中 6 个化学成分加样回收率试验数据
Table 2 Ｒecovery data for six constituents in Vicia amoena var． angusta
成分
样品中量
/μg
加入量
/μg
测得量
/μg
回收率
/%
平均值
/%
ＲSD
/%
成分
样品中量
/μg
加入量
/μg
测得量
/μg
回收率
/%
平均值
/%
ＲSD
/%
绿原酸 0. 245 0. 249 0. 498 101. 61 101. 98 0. 7
0. 250 0. 247 0. 504 103. 02
0. 259 0. 257 0. 520 101. 48
0. 258 0. 242 0. 506 102. 10
0. 248 0. 245 0. 499 102. 54
0. 256 0. 257 0. 516 101. 14
杨梅苷 0. 679 0. 667 1. 332 97. 90 99. 15 1. 7
0. 623 0. 611 1. 220 97. 75
0. 627 0. 619 1. 258 101. 95
0. 62 0. 622 1. 242 100. 02
0. 669 0. 661 1. 316 97. 90
0. 650 0. 656 1. 302 99. 38
金丝桃苷 0. 167 0. 167 0. 333 99. 54 101. 16 1. 3
0. 170 0. 163 0. 338 103. 00
0. 174 0. 171 0. 348 101. 40
0. 170 0. 165 0. 339 102. 27
0. 173 0. 170 0. 343 100. 29
0. 171 0. 169 0. 340 99. 77
异槲皮苷 0. 357 0. 351 0. 707 101. 48 99. 97 0. 9
0. 347 0. 349 0. 701 98. 89
0. 357 0. 355 0. 708 99. 33
0. 359 0. 360 0. 717 100. 17
0. 355 0. 350 0. 706 100. 16
0. 361 0. 362 0. 724 99. 77
山柰苷 0. 765 0. 752 1. 524 100. 93 100. 59 1. 0
0. 838 0. 821 1. 668 101. 22
0. 773 0. 783 1. 545 98. 72
0. 785 0. 772 1. 568 101. 29
0. 833 0. 818 1. 653 100. 24
0. 817 0. 802 1. 628 101. 12
槲皮苷 0. 725 0. 712 1. 445 101. 15 100. 67 0. 8
0. 757 0. 752 1. 508 99. 81
0. 747 0. 736 1. 494 101. 52
0. 749 0. 735 1. 494 101. 42
0. 760 0. 751 1. 509 99. 66
0. 754 0. 745 1. 502 100. 44
2. 9 样品测定 分别取狭山野豌豆 10 批样品，按
2. 3 项下方法分别制备供试品溶液，按 2. 1 项下色
谱条件分别平行测定 3 份，计算样品含量，结果见
表 3。
3 讨论
3. 1 提取条件考察 本试验对提取溶剂(60%，
70%，75%，80% 甲醇) ，溶剂用量 (60，70，80，
100 mL) ，提取时间(1，1. 5，2，2. 5 h)和提取方法
(回流法、超声法、索式提取法)进行考察，结果发
现，试验采用 70%甲醇 80 mL，回流 2 h 的为最佳提
取方法。
3. 2 色谱条件选择 本试验选择了甲醇-水、甲醇-
0. 1%甲酸溶液、乙腈-水及乙腈-0. 1%甲酸溶液为
流动相梯度洗脱，各色谱峰的峰形和分离度为最佳。
3. 3 结果分析 对 10 批狭山野豌豆进行含量测
定，由表 3 可知绿原酸、杨梅苷、金丝桃苷、异槲皮
苷、山柰苷、槲皮苷的质量分数分别为 0. 39 ～ 1. 03，
0. 28 ～ 1. 67，0. 2 ～ 1. 93，0. 4 ～ 3. 17，0. 43 ～ 2. 6，
0. 62 ～ 5. 77 mg·g －1，狭山野豌豆中 6 种化学成分总
含量由高到低依次为槲皮苷(23. 94 mg·g －1)＞山柰
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表 3 狭山野豌豆中 6 个成分的含量测定 (n = 3)
Table 3 Contents of six constituents in samples of Vicia amoena
var． angusta (n = 3) mg·g － 1
No． 来源 绿原酸杨梅苷
金丝
桃苷
异槲
皮苷
山柰苷槲皮苷
S1 辽宁朝阳县 0. 49 1. 37 0. 33 0. 66 1. 39 1. 43
S2 辽宁建平县 0. 42 1. 20 0. 52 1. 10 3. 44 5. 77
S3 辽宁大连市 0. 53 0. 28 0. 20 0. 48 0. 46 0. 62
S4 辽宁鲅鱼圈 0. 39 0. 33 0. 23 0. 40 0. 49 0. 63
S5 辽宁大石桥 1. 03 0. 36 1. 35 1. 70 0. 43 1. 09
S6 辽宁千山景区 0. 67 1. 67 1. 93 3. 17 2. 19 4. 52
S7 辽宁辽阳县 0. 47 1. 11 0. 47 0. 80 2. 60 2. 37
S8 辽宁岫岩县 0. 44 1. 25 0. 40 0. 80 2. 25 3. 28
S9 辽宁抚顺县 0. 59 1. 53 1. 18 1. 92 1. 85 3. 00
S10 辽宁新宾县 0. 77 0. 61 0. 84 1. 17 0. 73 1. 23
苷(15. 84 mg·g －1)＞异槲皮苷(12. 18 mg·g －1)＞杨
梅苷(9. 72 mg·g －1)＞金丝桃苷(7. 46 mg·g －1)＞
绿原酸(5. 79 mg·g －1)。研究结果表明 10 批不同产
地狭山野豌豆 6 中化学成分含量存在差异，不同的
产地、生态环境及采收时间对狭山野豌豆含量的影
响较大。因此，本试验对狭山野豌豆中 6 种化学成
分进行含量测定研究，为狭山野豌豆的质量控制提
供依据，以保证药材的质量。
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［责任编辑 顾雪竹］
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