全 文 ：半边莲通过钙信号诱导肝癌细胞凋亡的实验研究
高　冬 ,刘如玉 ,张振林
(福建中医学院中西医结合系 ,福建 福州 350108)
　　摘要:观察半边莲通过影响胞内游离钙离子浓度进而诱导人肝癌细胞 HepG 2 发生凋亡。通过荧光分光光
度法检测胞内游离钙离子浓度 , 并采用 AO-EB 荧光染色 、流式细胞术和 DNA 琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。
结果显示半边莲可提高 HepG2 细胞胞内游离钙离子浓度 , 与对照组相比 , 差异显著(P < 0. 01),且荧光染色 、
流式细胞术和 DNA 琼脂糖凝胶电泳的结果表明经半边莲处理过的肝癌细胞出现典型的凋亡特征。结论:半边
莲可通过提高肝癌细胞胞内游离钙离子浓度诱导癌细胞凋亡
　　关键词:半边莲;肝癌细胞 HepG2 ;细胞凋亡
　　中图分类号:R285. 5　　文献标识码:A　　文章编号:1004-5627(2006)06-0032-02
收稿日期:2006-09-25
作者简介:高冬(1967 -),女 ,副教授。
　　半边莲 Lobelia chinensis Lour. 属桔梗科植
物 ,性辛 、平 ,归心 、小肠 、肺经 。《陆川本草》曰其具
有“解毒 、消炎 、利尿 、上血”的功效 ,是临床上常见
的抗癌中药 ,用于治疗肝癌 、胃癌 、肠癌 、乳腺癌等
多种恶性肿瘤。本实验从半边莲通过钙信号诱导
肝癌细胞凋亡的角度来探讨该味中药抗癌的作用
机制 ,为半边莲在肿瘤治疗中的应用提供理论
依据 。
1　材料和方法
1. 1　细胞培养和加药处理 　人肝癌细胞 HepG 2
引自中科院上海细胞生物所 。对照组细胞用含
10%新生牛血清的 DMEM 培养液 ,在 37℃、5%
CO 2条件下常规贴壁培养 。加药组细胞在培养 24h
后换含半边莲的培养液连续培养备用 ,其中半边莲
的浓度以每 4ml培养液中加入 15μl浓度为 2g /ml
的半边莲煎煮母液来计。
1. 2　试剂　吖啶橙(AO),溴化乙啶(EB),碘化丙
啶(PI)购自 Sigma 公司;DMEM 购自美国 Gibcob
公司;新生牛血清购自杭州四季青公司;胰蛋白酶
购自上海生工生物工程技术服务有限公司;化学发
光试剂购自北京中山生物公司 。
1. 3　细胞胞浆游离钙浓度的测定　参照文献[ 1] 的
测定方法 ,采用荧光分光光度法检测半边莲诱导前
后 HepG2细胞胞浆游离钙离子的浓度 。
1. 4　荧光染色　取对数生长期的对照组和加药组
细胞培养 1周后 ,加入 5μl AO-EB 染色液(100μg /
ml AO , 100μg /ml EB),封片后置荧光显微镜下观
察并拍照记录 。
1. 5　流式细胞仪检测　取空白对照组和药物组的
HepG 2细胞经胰酶消化后 , PBS 洗 2 次 ,细胞沉淀
用 70%(V /V)乙醇固定过夜。检测前细胞经 700
×g 离心 5min ,留沉淀用 1m l的 PBS 重悬 ,400目
筛网过滤 , 取 500μl 细胞悬液加 500μl 碘化丙啶
(PI)染液(20μg /m l PI , 0. 1%T ri tonX-100 , 0. 1
mmol /L EDTA , 50μg /m l RNase), 避 光染 色
15min。用 Backman Coul t XL 流式细胞仪 ,488nm
激发 ,605nm 检测 ,每次检测 104细胞。MultyCycle
软件进行 DNA 含量和细胞凋亡率分析 , DNA 含量
低于G1期二倍体 DNA 的细胞为亚二倍体细胞 。
1. 6　DNA 提取和琼脂糖凝胶电泳 　根据 Her-
rmann
[ 2] 文献:提取 DNA , 1. 5%琼脂糖凝胶(含
0. 5μg /ml溴化乙锭)以 5 V /cm 凝胶的电压电泳 2
h ,紫外灯下观察拍照 。
1. 7　统计学处理　计量资料以 x ±s 表示 ,采用
SPSS 13. 0 统计软件包中 t检验。
2　结　果
2. 1　半边莲处理前后细胞内游离钙浓度的变化　
半边莲处理后 , HepG 2细胞胞内游离钙浓度从
141. 67±3. 32 nmo l /L 升高到 232. 71±4. 13nmo l /
L ,与对照组相比 ,差异显著 , P<0. 01。
2. 2　半边莲处理前后细胞形态观察　2 组细胞均
贴壁生长 ,其中对照组细胞呈多边形铺展状态 ,细
胞质被 AO 染成绿色 ,细胞核清晰 ,呈黄绿色 ,近圆
形 ,内有 3 ～ 5个圆形的黄色核仁 ,见图 1-A 。半边
32
福建中医学院学报　2006 年 12月 第 16卷 第 6 期
Journal of Fujian College o f TCM December 2006 , 16(6)
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莲作用 7 d后 ,细胞铺展程度下降 ,趋于圆形 ,生长
停止 ,出现各阶段形态的凋亡细胞。早期凋亡细
胞 ,细胞核虽也呈黄绿色 ,但形态呈固缩状 、圆珠状
或新月状;晚期凋亡细胞 ,细胞核呈致密浓染的橘
红色 ,部分细胞核碎裂 ,胞膜芽状突起形成凋亡小
体 ,见图 1-B。
图 1　荧光显微镜观察 HepG 2细胞的形态(×400)
2. 3　DNA 倍体分析　半边莲作用 7 d后 ,在流式
细胞仪上检测可见典型的亚二倍体峰。
2. 4 　DNA 片段化分析 　半边莲作用 7 d 的
HepG2细胞 ,其 DNA 琼脂糖凝胶电泳呈现典型的
180 ～ 200bp 的 DNA 梯状条带 ,表明 DNA 链在核
小体间发生断裂 ,生成寡核小体 ,提示经半边莲作
用可导致 HepG 2细胞凋亡 ,见图 2。
图 2　HepG2细胞经半边莲作用前后 DNA 凝胶电泳图
注:a　对照组;　b　药物组;　M 　100bp 分子量标准
3　讨　论
　　细胞内钙离子在信号转导中的作用日益受到
重视 。在大多数生理条件下 ,细胞内钙离子浓度总
是保持在极低的水平 ,约为 10- 7mol /L。细胞外的
钙离子浓度稳定在(1. 1 ～ 1. 3)×10 -3mol /L 的范
围内 ,细胞内外的钙离子浓度差大约为 1万倍 。当
遇到相应的刺激时 ,细胞会通过多种途径瞬间提高
胞内局部或全部的钙离子浓度至 10- 6 mol /L 甚至
更高[ 3] ,其浓度的变化在一系列生理和病理过程中
发挥重要作用 。
　　自 1978年 ,Kaise和 Edelman因在研究糖皮质
激素刺激未成熟胸腺细胞发生凋亡过程中发现胞
外钙离子内流 ,同时发生内质网中钙离子耗竭的现
象 ,首次提出胞质内钙离子浓度的增加与细胞凋亡
相关。之后 ,大量实验结果进一步证明 ,在大多数
细胞凋亡过程中 ,胞质内游离的 Ca2+浓度均有所
增加[ 4] 。虽然钙离子信号的确参与了早期的凋亡
活动 ,但是 ,对于钙离子信号如何激发早期凋亡活
动的确切机理仍然不清楚 。人们只知道钙离子的
作用很可能是通过钙离子依赖的酶起作用 ,至于通
过哪种酶及酶的底物 ,则仍需要进一步的探索 。本
实验结果证明半边莲可显著升高肝癌细胞胞内游
离的 Ca2+浓度 , Ca2+浓度的稳态失调激活了核酸
内切酶 ,使脱氧核糖核酸裂解 ,出现 DNA Ladder ,
并使癌细胞出现典型的凋亡形态学改变 ,说明半边
莲通过影响胞内钙信号进而诱导癌细胞凋亡。联
系笔者以前工作中发现的半边莲可升高宫颈癌细
胞胞内游离 Ca2+浓度的实验结果[ 5] ,提示我们半
边莲在临床治疗各种恶性肿瘤可能存在共同的机
制:通过提高癌细胞胞内游离 Ca2+浓度进而发挥
作用 ,确切的结论还需要进一步的实验说明 。
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Influence of Aging on Expression of Immune Cytokins in SD Rats
CHEN Xiao-feng1 , HUA Bi-chun2 , ZHENG Liang-pu1 , et al
(1. The Second Affil iated Hospital , FCTCM , Fuzhou , Fujian 350003 , China;
2. Fujian College of Traditional Chinese Medicine , Fuzhou , Fujian 350108 , China)
　　Abstract:To investig ate inf luence of aging on the expression of cy tokins. 8 15-month-old male SD
rats w ith clean and healthy w ere selected as experimental group , the RNA s w ere ex tracted f rom their
spleens af ter three months , 8 3-month-o ld male SD rats as young control g roup. The cy tokines w ere de-
termined w ith rat cytokines antibody array by Affymetrix of USA. The resul ts showed that the expres-
sions of IL-1α, IL-1β , IL-6 and TNF-αin experimental g roup declined compared w ith young contro l
group. Conclusion:The decline o f expression of cy tokines wi th aging is manife sted as one of the syn-
drome of immunosenescence ,which resembles to kidney def iciency wi th aging.
　　Key words:kidney def iciency;cy tokine;immunosenescence
(上接第 33页)
Experimental Study of Hepatoma Cells Apoptosis Induced
by Lobelia Chinensis Lour. through Calcium Pathway
GAO Dong , LIU Ru-yu , ZHANG Zhen-lin
(Department of Integrative Medicine , FCTCM , Fuzhou , Fujian 350108 , China)
　　Abstract:To inve stig ate the hepatoma cells apopto sis induced by Lobelia chinensis Lour. through the
calcium pathw ay. The level of cy toplasmatic free Ca
2+
was de tected by f luorescent colo rimetry . The ap-
optot ic cells w ere detected by AO-EB double f luo rescent staining , flow cy tome try and DNA agarose gel e-
lect ropho resis. The results show ed that Lobel ia chinensis Lour. could significant ly increases the level of
cy toplasmatic f ree Ca2+ in HepG 2(P <0. 01), and HepG2 show ed typically apopto tic character. Conclu-
sion:Lobel ia chinensis Lour. can induce HepG 2 apopto sis by increasing the level of cy toplasmatic
f ree Ca
2+
.
　　Key words:Lobel ia chinensis Lour. ;HepG 2 ;apoptosis
49第 6期　 　　　　　陈小峰等:增龄对 SD大鼠免疫细胞因子表达的影响