全 文 ：◎研究原著 ◎ 中国临床药理学与治疗学中国药理学会主办
CN 34-1206 R , ISSN 1009-2501
E-mail:editorys@mail.wh.ah.cn
2003 Aug;8(4):381-384
2003-02-21收稿　2003-03-01修回
1卫生部资助课题(№981345);湖南省中医药科研基金重点课题
(№2000006);湖南省教委资助课题(№98B100)
庹勤慧 ,在读硕士研究生。
E-mail:qhtuo@sohu.com。
廖端芳 ,通讯作者 , 博士 ,教授 ,博士生导师 , 研究方向:心血管药理
学。
Tel:0734-8281308 　 E-mai l:dfliao@hotmail.com
金粉蕨素拮抗血管内皮细胞氧化应激损伤及机制1
庹勤慧 ,廖端芳 ,朱炳阳 ,严奉祥
南华大学基础医学院药物药理研究所 , 衡阳 421001 , 湖南
摘要　目的:研究金粉蕨素(onychin ,Ony)对血管内
皮细胞氧化应激损伤的影响及可能机制 。方法:培
养人脐静脉血管内皮细胞株(ECV304),经 Ony 处理
后 , 用过氧化氢(H2O2)对其损伤;用MTT比色法和
乳酸脱氢酶测定法分别检测损伤组和处理组细胞增
殖活性和功能状态;用 Western-Blot法检测磷酸化
ERK1 2和 p38 、P90RSK蛋白的表达。结果:不同浓
度的Ony(0.3 、1 、3 、10 μmol·L-1)促进H2O2损伤的内
皮细胞增殖 ,减少 LDH释放 ,并呈浓度依赖性 。Ony
(3μmol·L-1)抑制 H2O2 诱导的磷酸化 p38 表达 ,
30 min 时最明显 ,但并不影响 H2O2 对 ERK 的激活
以及 ERK下游蛋白激酶 P90RSK的表达 。而阳性对
照药 genistein虽可增加内皮细胞增殖活性和减少功
能损伤 ,但明显抑制 H2O2 诱导的磷酸化 ERK 表达
及其下游蛋白激酶 P90RSK。结论:Ony 拮抗血管内
皮细胞氧化应激损伤可能与抑制 p38磷酸化有关 。
关键词　药理学;金粉蕨素;内皮细胞;过氧化氢;
ERK;P38MAPK
中图分类号:R285.5;R287.71
文献标识码:A
文 章 编 号:1009-2501(2003)04-0381-04
金粉蕨素(onychin , Ony)系我室与中科院昆明
植物研究所从中国蕨科金粉蕨属金粉蕨植物中分离
获得的一种新型二氢黄酮苷[ 1] ,与羟基异黄酮化学
结构相似 。经离体血管环实验证明 , Ony 对溶血性
磷脂酰胆碱损伤的血管内皮依赖性舒张功能有保护
作用[ 2] ,其他研究人员还观察到 Ony 对抗肝脏脂质
过氧化作用[ 3] ,充分提示 Ony 有抗氧化效应。而氧
化应激引起内皮细胞受损是许多心血管疾病的触发
因素 ,并且异黄酮类物质也可以拮抗氧化应激损
伤[ 4 , 5] 。本实验以异黄酮类药物 genistein 为阳性对
照 ,体外观察 Ony 对过氧化氢(H2O2)损伤血管内皮
细胞的保护作用及其机制 ,为开发新的药理作用提
供进一步的实验依据。
1　材料与方法
1.1 　药品与试剂 　H2O2 , genistein , 二甲基亚砜
(DMSO),四甲基偶氮唑盐[ 3-(4 , 5-dimethylthiazo-2-
yl)-diphenyl-tetrazolium bromide , MTT] ,均购自 Sigma
公司;DMEM培养基为 GIBCO产品;新生牛血清(杭
州四季清产品);兔抗人 P-p38 、p38 、P90RSK单抗 ,鼠
抗人 P-ERK1 2 单抗(Santa Cruz Biotechnology);BCA
蛋白含量测定试剂 ,Western-Blot 荧光检测试剂盒
(购自 Hyclone-Pierce 公司);Ony 为本实验室提取并
鉴定(纯度>98%),溶于二甲基亚砜(DMSO),二甲
基亚砜最终浓度<0.01%。
1.2　细胞培养及处理　自武汉大学细胞馆藏中心
购人脐静脉内皮细胞 ECV304 ,用含有10%新生牛血
清的 DMEM培养基 ,同时加入 100 U·L-1链霉素和
100U·L-1青霉素 ,在37 ℃、5%CO2 饱和湿度的CO2
培养箱中培养。实验分 5组 ,空白对照组:弃原培养
液并重新加入含 1%新生牛血清的 DMEM培养基继
续培养;H2O2 损伤组:在含 1%新生牛血清的 DMEM
培养中加入 2 mmol·L-1 H2O 2;Ony 组:在加入 H2O2
前30 min 分别加入不同浓度 Ony (0.1 、0.3 、1 、3 、
10μmol·L-1);溶媒对照组:在含 1%新生牛血清的
DMEM培养中加入 0.01%DMSO;阳性药物对照组:
在加入 H2O 2前 30 min加入 100μmol·L-1 genistein。
1.3　四甲基偶氮唑盐(MTT)还原实验　细胞以 2
·381·
×105 ml的密度铺种于 96孔板 ,待融合后按以上分
组处理 ,4 h后弃原培养液 ,各孔加入含MTT(终浓度
0.5 mg·L-1)、1%新生牛血清的 DMEM 培养基 ,培养
4 h后 ,弃培养液加入 100μl的 DMSO 原液 ,37 ℃培
养 10 min , 待结晶完全溶解后 , 用酶联免疫仪于
570 nm 波长处测定吸光度(OD);并根据吸光度 ,计
算细胞存活率(细胞存活率=给药组吸光度 空白组
吸光度×100%)。
1.4　细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)测定　细胞
以2×105 ml的密度铺种于 24孔板 ,待融合后按以
上分组处理 ,4 h后取培养液 ,应用全自动生化分析
仪(HITACHI717)测定 LDH含量。
1.5　Western-Blot测定蛋白的表达　收集不同条件
处理的血管内皮细胞 ,MBST 裂解液裂解细胞(MBST
裂解液:25 mmol·L-1 MBS , pH 6.5 , 0.15 mmol·L-1
NaCl2 ,1%Triton X-100),4 000×g 离心15 min ,收集
上清 , BCA 试剂测定蛋白含量 , 1×SDS 凝胶加样缓
冲液调蛋白浓度使各组一致 ,经 10%SDS-聚丙稀酰
胺凝胶电泳 ,然后将蛋白电转移至 PVDF 膜上 ,TBST
(20 mmol·L-1 tris base pH 7.6 , 50 mmol·L-1 NaCl ,
0.1%tween)配制的 5%脱脂牛奶 ,室温封闭 1.5 ～
2 h ,一抗 4 ℃过夜 ,TBST 洗膜 3次 ,每次 10 min ,二
抗室温孵育 1 h ,TBST 洗膜 ,发光剂孵育 ,显影 。用
Labworks图像分析系统对Western blot结果进行灰度
扫描 ,以对照组的面积灰度值为 1.0 与实验组进行
比较和半定量分析。
1.6　统计方法　实验数据以 x ±s表示 ,组间差异
性比较采用单因素方差分析 ,由 SPSS 11.0软件进行
统计分析 。
2　结果
2.1　Ony对 H2O2 损伤的内皮细胞的影响　H2O2
孵育 4 h后 ,内皮细胞增殖活性明显下降 ,培养液中
LDH释放由正常时 35.0±1.0 U·L-1升高到 48.3±
3.1 U·L-1(P<0.01)。不同浓度的Ony(0.1 、0.3 、1 、
3 、10μmol·L-1)与 H2O2 共同孵育内皮细胞 4 h后 ,
呈浓度依赖性的增加内皮细胞活性和减少 LDH 释
放。3μmol·L-1 Ony 保护作用最明显 ,细胞增殖活
性上升到(95±14)%(P <0.01), LDH 释放减少为
38.7±1.5 U·L-1(P<0.01)(表 1)。倒置显微镜下
也可观察到Ony 对细胞形态也有保护作用。
2.2　Ony 对内皮细胞 P-ERK蛋白表达的影响 　
H2O2 孵育 15 min后 ,明显激活磷酸化 ERK的表达 ,
Ony(3μmol·L-1)与H2O2 共同孵育内皮细胞 15 min ,
不影响 H2O2 对 ERK 的激活作用(图 1 ,A), 30 min
时仍不影响 ERK活性(图 1 , B);但 genistein通过抑
制酪氨酸激酶 ,而抑制H2O2对ERK的磷酸化(图1 ,A)。
表 1　Ony 对 H2O2 损伤的内皮细胞活性的影响(x±s , n=
4)
组别 浓度 μmol·L-1
细胞增殖活性
%
乳酸脱氢酶
U·L-1
对照组 - 100±9 35.0±1.0
H2O2 - 73±14c 48.3±3.1c
Ony 0.1 74±5 43.7±0.6
Ony 0.3 83±5e 43.3±3.8
Ony 1.0 90±8f 41.0±6.2e
Ony 3.0 95±14f 38.7±1.5f
Ony 10 94±8 41.3±0.6e
DMSO - 74±10 47.3±7.3
genistein 100 92±6f 40.0±5.2f
Ony:金粉蕨素;DMSO:二甲基亚砜;与对照组比较c P<0.01;与
H2O2 比较eP<0.05, f P<0.01
图 1　Onychin(3μmol·L-1)对内皮细胞 P-ERK蛋白表达的
影响(n=3)
2.3　Ony对内皮细胞 P90RSK蛋白表达的影响　
P90RSK是 ERK的下游蛋白激酶 ,随 ERK 的活化而
表达增加 。见图 2 ,H2O2 作用 15 min后 ,P90RSK表
达增加 ,Ony对此没有影响 ,但 genistein与H2O2 共同
孵育内皮细胞 15 min , P90RSK表达明显下调 。说明
genistein通过抑制 ERK的磷酸化而下调了 P90RSK
蛋白表达 ,对 ERK 信号通路的作用与 Ony 有差异 ,
Ony 在短时间内并不影响 ERK 通路 , 但随时间延
长 ,于4 h后可以促进 ERK活化 ,可能与拮抗内皮细
胞凋亡有关 ,(文章待发表)。
2.4　Ony对内皮细胞 P-p38 MAPK蛋白表达的影
响　图 3 , H2O2 作用 15 、30 min ,激活内皮细胞 p38
的磷酸化(2.00±0.02 , 2.20±0.04 vs 1.00±0.12 ,
P<0.01),Ony可抑制磷酸化 p38的表达 ,30 min时
作用最显著(1.70±0.06 vs 2.20±0.04 , P<0.01)。
·382· Chin J Clin Pharmacol Ther 2003 Aug;8(4)
图2　Onychin(3 μmol·L-1)对内皮细胞 P90RSK 蛋白表达
的影响(n=3)
图3　Onychin(Ony)对内皮细胞 P-p38 MAPK蛋白表达的影
响(n=3)
与对照组比较c P<0.01;与H2O2 组比较f P<0.01
3　讨论
Ony 是从蕨科金粉蕨属粟柄金粉蕨植物中提
取 、分离的新型二氢黄酮苷单体化合物 ,结构类似异
黄酮类植物雌激素。异黄酮类植物雌激素如
genistein , daidzein 等可显著降低脂质过氧化物的形
成 ,保护血管内皮细胞 ,使其不被氧化破坏 ,有抗动
脉粥样硬化的作用[ 6 , 7] ,药效与雌二醇相当而没有明
显的毒副作用 。以异黄酮类植物雌激素的代表药
genistein为阳性对照 ,采用体外内皮细胞培养方法 ,
发现Ony呈浓度依赖性的对抗 H2O2 造成的血管内
皮细胞损伤 ,降低内皮细胞乳酸脱氢酶的释放 ,能够
保护血管内皮细胞 ,拮抗氧化损伤 。
MAPK家族信号通路与内皮细胞的增殖和凋亡
关系密切 , 其中 ERK1 2 通路又称分裂原激活的
MAPK通路 ,主要与细胞增殖 、分化有关 ,核糖体 S6
激酶(ribosomal S6 kinase , RSK)是 MAPK 的底物[ 8] ,
激活的 ERK和 RSK能转入核中 ,通过使一些转录因
子的磷酸化 ,促进细胞增殖 ,MEK 阻断剂 PD98095
能共同抑制 ERK 和 P90PSK 的活化[ 9] 。p38 MAPK
为应激激活的MAPK通路之一 ,与内皮细胞损伤 、凋
亡联系密切 , 如氧自由基 、Adenosine[ 10] 等都可通过
激活 p38 MAPK 激酶而诱导内皮细胞损伤或凋亡。
在细胞内维持p38 MAPK与 ERK通路平衡可保护内
皮[ 11] ,协调内皮凋亡与增殖 。H2O2 是体内氧化代谢
的中间产物 ,同时又是一种活性氧 ,能够诱导磷酸化
ERK和 p38的表达 ,这种促进作用在 10 ～ 30 min达
高峰[ 12] ,并且 p38 MAPK活化是 H2O2增加内皮细胞
渗透性 ,损伤内皮的主要原因[ 13] 。
本实验观察到 H2O2 孵育内皮细胞 15 min ,明显
激活 ERK 及下游蛋白激酶 P90RSK ,Ony 对此无影
响 ,而 genistein为酪氨酸激酶抑制剂 , 抑制 ERK 的
活化 ,与文献报道一致[ 14] ,相应下调 P90RSK蛋白表
达 。在 30 min时 ,Ony 仍不影响 H2O2 激活 ERK ,提
示 Ony 对氧化应激暂时诱导的 ERK 磷酸化没有影
响 ,与 genistein作用环节有差异。H2O 2 也明显促进
p38MAPK磷酸化 ,而Ony 能抑制 p38MAPK的活化 ,
在 30 min 时最明显。说明 Ony 拮抗血管内皮细胞
氧化应激损伤与抑制 p38 MAPK活化有关 。
参 考 文 献
1　许云龙 ,郑兴 ,何以能.粟柄金粉蕨素黄酮成分[ J] .云南
植物研究 , 1999;15:497-504
2　庹勤慧 , 廖端芳 ,黄红林 , 等.金粉蕨素对溶血性磷脂酰胆
碱损伤血管内皮依赖性舒张功能的保护作用及机制[ J] .
中国动脉硬化杂志 , 2001;9:27-30
3　严奉祥 , 朱炳阳 ,郑兴.金粉蕨素对小白鼠实验性肝损伤
脂质过氧化的保护作用[ J] .南华大学学报 , 2002;30:4-
6
4　Vedavanam K , Srijayanta S , O Reilly J , et al.Antioxidant ac-
tion and potential antidiabetic properties of an isoflavonoid-con-
taining soyabean phytochemical extract (SPE)[ J] .Phytother
Res , 1999;13:601-8
5　Wei H , Zhang X , Wang Y, et al.Inhibition of ultraviolet
light-induced oxidative events in the skin and internal organs of
hairless mice by isoflavone genistein[ J] .Cancer Lett , 2002;
185:21-9
6　Kapiotis S , HermannM , Held I , et al.Genistein , the dietary-
derived angiogenesis inhibitor , prevents LDL oxidation and pro-
tects endothelial cells from damage by atherogenic LDL[ J] .Ar-
terioscler Thromb Vasc Biol , 1997;17:2868-74
7　Carbajal JM , Schaeffer RC Jr.H2O2 and genistein differentially
modulate protein tyrosine phosphorylation , endothelial morpholo-
gy , and monolayer barrier function[ J] .Biochem Biophys Res
Commun , 1998;249:461-6
·383·中国临床药理学与治疗学 2003 Aug;8(4)
8　Yu Y , Sato JD.MAP kinases , phosphatidylinositol 3-kinase ,
and p70 S6 kinase mediate the mitogenic response of human en-
dothelial cells to vascular endothelial growth factor[ J] .J Cell
Physiol , 1999;178:235-46
9　Baliga RR, Pimental DR , Zhao YY.NRG-1-induced cardio-
myocyte hypertrophy.Role of PI-3-kinase , p70(S6K), and
MEK-MAPK-RSK[ J] .Am J Physiol , 1999;277:2026-37
10 Harrington EO , Smeglin A , Parks N , et al.Adenosine induces
endothelial apoptosis by activating protein tyrosine phosphatase:
a possible role of p38 alpha[ J] .Am J Physiol Lung Cell Mol
Physiol , 2000;279:733-42
11 Wang Z , Jiang C , Ganther H , et al.Antimitogenic and pro-
apoptotic activities of methylseleninic acid in vascular endotheli-
al cells and associated effects on PI3K-AKT , ERK , JNK and
p38 MAPK signaling[ J] .Cancer Res , 2001;61:7171-8
12 Kathryn Z , Guyton , Yusen Liu , et al.Activation of mitogen-
activated protein kinase by H2O2[ J] .J Biol Chem , 1996;271:
4138-42
13 Niwa K , Inanami O , Ohta T.p38 MAPK and Ca2+ contribute
to hydrogen peroxide-induced increase of permeability in vascu-
lar endothelial cells but ERK does not[ J] .Free Radic Res ,
2001;35:519-27
14 Frey RS , Singletary KW.Genistein activates p38 mitogen-acti-
vated protein kinase , inactivates ERK1 ERK2 and decreases
Cdc25C expression in immortalized human mammary epithelial
cells[ J] .J Nutr , 2003;133:226-31
Protective effects of onychin on vascular endothelial cell injured by oxida-
tive stress
1
TUO Qin-Hui , LIAO Duan-Fang , ZHU Bing-Yang , YAN Feng-Xiang
Institute of Pharmacy &Pharmacology ,Nanhua University , Hengyang 421001 , Hunan , China
ABSTRACT　AIM:To study the protective effects and
mechanism of onychin against vascular endothelial cell
damage induced by oxidative stress.METHODS:Cul-
tured human umbilical vein endothelial cells (ECV304)
and incubated them for 30 min with either vehicle (DM-
SO), genistein or different concentrations of onychin
(0.1 , 0.3 , 1 , 3 , and 10μmol·L-1)before being dam-
aged with 2 mmol·L-1 H2O2.Cell viability was measured
by the MTT assay and LDH assay , and cell morphologic
changes were determined under microscope.Meanwhile ,
and the western blot was used to measure the expression of
phospho-ERK , P90RSK , and phospho-p38 of endothelial
cells.RESULTS:Different doses of onychin obviously
inhibited cell viability and increased LDH release (P <
0.01).Onychin (0.3 , 1 , and 3 μmol·L-1)improved
the cell proliferation with the growth rate from 73.4% to
82.9%, 90.1% and 95.2%, respectively.Onychin al-
so attenuated the release of LDH(H2O2-induced)and in-
hibited H2O2-induced phosphorylation of p38MAPK(P<
0.01).Onychin showed no effect on phosphorylation of
ERK and P90RSK.CONCLUSION:Onychin prevents
H2O2-induced endothelial cell injury by inhibiting the
phosphorylation of p38 MAPK.
KEY WORDS 　pharmacology;onychin;endothelial
cells;hydrogen peroxide;p38 MAPK;ERK
·384· Chin J Clin Pharmacol Ther 2003 Aug;8(4)