全 文 ：收稿日期:2014-01-02 接受日期:2014-05-13
基金项目:湖南省高校科技创新团队支持计划(2012-318) ;湖南省
重点学科建设项目(2011-76)
* 通讯作者 E-mail:jiangxinyi477@ sohu． com
天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2015，27:865-869
文章编号:1001-6880(2015)5-0865-05
半边莲总黄酮提取工艺及抑菌活性的研究
蒋琼凤1* ，温拥军2，袁志辉1
1湖南科技学院，永州 425199;2 湖南化工职业技术学院，株州 412004
摘 要:研究了乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间对半边莲中总黄酮提取率的影响，并通过正交实验优化
了半边莲中总黄酮的提取工艺条件，结果表明:当乙醇浓度 60%，料液比为 1∶ 40(g /mL) ，提取温度 60 ℃，提取
时间 2． 5 h，从半边莲中提取总黄酮的得率为 1． 69%。考察了半边莲总黄酮提取物对几种常见微生物的抑菌作
用，结果表明半边莲总黄酮提取物具有一定的抑菌活性，对革兰氏阴性菌的抑制作用大于革兰氏阳性菌，低浓
度下对青霉菌和酵母菌抑制效果不明显。
关键词:半边莲;总黄酮;提取;抑菌活性
中图分类号:Ｒ931． 6 文献标识码:A DOI:10． 16333 / j． 1001-6880． 2015． 05． 022
Study on the Extraction Process and Antibacterial
Activity of Total Flavonoids from Lobelia chinensis
JIANG Qiong-feng1* ，WEN Yong-jun2，YUAN Zhi-hui1
1Hunan University of Science and Engineering，Yongzhou 425199，China;
2Hunan Chemical Industry Vocational Technology College，Zhuzhou 412004，China
Abstract:Four factors，namely ethanol concentration，solid-liquid ratio，extraction temperature and extraction duration
were optimized for the extraction of total flavonoids from Lobelia chinensis through orthogonal design，The results showed
that under the condition of ethanol concentration of 60 %，solid-liquid ratio of 1∶ 40 (g /mL) ，extraction temperature of
60 ℃ and extraction duration of 2． 5 h，the highest yield of total flavonoids was obtained (1． 69%)． The antimicrobial
activities of flavonoids were studied by plate count and disk diffusion method． The results showed that flavonoids had cer-
tain antimicrobial activities，its inhibitory effect on gram negative bacteria was better than gram positive bacteria，and had
little inhibitory effect on Penicillium and yeast with low concentration．
Key words:Lobelia chinensis;total flavonoids;extraction;antibacterial activity
半边莲(Lobelia chinensis lour)为桔梗科半边莲
的干燥全草，为中国药典收录的常用中药，含生物
碱、黄酮甙、皂甙、氨基酸［1，2］等多种活性成分，既可
内服又可外用，疗效较好，具有显著的抗肿瘤、抗氧
化、镇痛消炎等药理作用［3-5］，是一类值得大力开发
应用的植物。目前有关半边莲的药效研究主要集中
在半边莲生物碱上，对黄酮的研究鲜有报道。黄酮
类化合物具有清除自由基、抗衰老、抗癌、抗病毒、抗
菌消炎等［6，7］多种生物活性，由于合成食品添加剂
的毒副作用，从植物当中提取黄酮作为天然抑菌剂
或防腐剂越来越受到人们的青睐［8］。本研究对半
边莲中总黄酮进行提取，并优化其工艺条件，同时考
察半边莲黄酮提取物对常见细菌、真菌的抑制作用，
旨在为开发半边莲天然食品保鲜剂提供理论依据，
也为拓宽医疗病种提供一定参考思路，使半边莲更
广泛地应用于临床。
1 材料与方法
1． 1 材料与仪器
半边莲(湖南永州中草药材市场采购) ，洗净后
干燥至水分含量在 0． 5%以下，粉碎过 40 目筛备
用。芦丁标准品(中国药品生物制品检验所) ;硝酸
铝、亚硝酸钠、95%乙醇、氢氧化钠、磷酸氢二钾、硫
酸镁(MgSO4·7H2O)、氯化钾、硫酸亚铁、蔗糖等均
为分析纯。供试菌株:金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、
枯草芽孢杆菌、变形杆菌、青霉菌、酵母菌等均由湖
南科技学院微生物实验室提供。
752 型紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪
器有限公司) ，AY220 型电子分析天平(岛津国际贸
易公司) ，WD800GL 型微波炉(格兰仕微波炉电器
有限公司) ，旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公
司) ，自动型手提式灭菌锅 YXQ-LS-18SI(上海博迅
实业有限公司) ，恒温光照培养箱 MJX-250B-Z(上
海博迅实业有限公司) ，超净工作台 ZHJH-1109(上
海制成分析仪器制造有限公司)等。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 半边莲总黄酮的提取
精密称取半边莲粉末 0． 500 g 于烧杯中，加入
一定量一定浓度的乙醇，在一定水浴温度下提取一
定时间，提取液经旋转蒸发仪干燥、浓缩至膏状，得
总黄酮粗提物。单因素实验分别考察不同乙醇浓
度、提取温度、料液比、提取时间对半边莲总黄酮得
率的影响，在单因素实验基础上，选取乙醇浓度、料
液比、提取温度、提取时间中影响较大的三个水平进
行 L9(3
4)正交实验设计，见表 1。
1． 2． 2 标准曲线的绘制
精密称取芦丁标准品 0． 020 g，用 70%乙醇溶
解于 100 mL的容量瓶中，定容配制成 0． 20 mg /mL
芦丁标准溶液。精确吸取标准溶液 0． 0、1． 0、2． 0、
3． 0、4． 0、5． 0、6． 0 mL于 10 mL的容量瓶中，加入
表 1 正交实验因素水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment
水平
Level
A
提取温度
Extraction temperature
(℃)
B
提取时间
Extraction duration
(h)
C
料液比
Solid-liquid ratio
(g /mL)
D
乙醇浓度
Ethanol concentration
(%)
1 50 2 40 50
2 60 2． 5 50 60
3 70 3 60 70
0． 5 mL 5%的亚硝酸钠和 0． 5 mL、10%的硝酸铝分
别静置 6 min，再加入 2 mL 1 mol /L的氢氧化钠溶液
并用 70%乙醇定容，静置 15 min，以 70%乙醇液作
空白溶液，用 752 型分光光度计在 510 nm处测定吸
光度值［9］。然后以芦丁浓度 C(mg /mL)为横坐标，
吸光度值 A 为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程
为 y = 10． 3x-0． 002，Ｒ2 = 0． 9989。
1． 2． 3 样品液总黄酮的测定
精密吸取样品液于 25 mL 的容量瓶中，按标准
曲线法在 510 nm处测定吸光度，并以下式计算总黄
酮提取率(%) :
总黄酮提取率% =(C × VM × N ×10
-3)× 100%
式中:C-为总黄酮质量浓度(mg /mL) ;V-半边莲
总黄酮提取液的体积(mL) ;N-为稀释的倍数;M-为
半边莲样品质量(g)。
1． 2． 4 半边莲黄酮的抑菌作用
1． 2． 4． 1 总黄酮提取物的制备
称取半边莲粉末，以料液比 1 ∶ 50，加入 70%乙
醇，在 60 ℃下提取 2． 5 h，经旋转蒸发仪干燥、浓缩
至膏状，得总黄酮粗提物，密封，于 0 ～ 4 ℃保存。使
用前准确称取膏状物样品用 0． 85%生理盐水配制
成 1 g /mL和 0． 1 g /mL 样品溶液，置于紫外灯下照
射 1 h灭菌后备用。
1． 2． 4． 2 菌悬液的制备
细菌培养采用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌采用
察氏培养基。将供试的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、
枯草芽孢杆菌、变形杆菌、酵母菌分别移接入相对应
的培养基上培养，细菌 37 ℃培养 24 h，真菌 30 ℃培
养 48 h。取活化好的菌种斜面，分别溶于 50 mL 无
菌生理盐水中，充分振荡摇匀，平板计数法制成含菌
数 1． 0 × 106 cfu /mL 的菌悬液，并稀释至 1． 0 × 103
cfu /mL，留存备用。
1． 2． 4． 3 抑菌活性的测定
将直径 90 mm培养皿上的培养基分为 3 个区，
用移液器吸取 0． 1 mL 的菌悬液，涂布均匀后，每个
区分别用 8 mm 的打孔器打孔，其中 2 孔为平行，1
孔无菌生理盐水为对照，每孔加入 0． 2 mL的半边莲
黄酮提取液。细菌置于 37 ℃恒温培养箱内培养 1 d
后，测定抑菌圈直径大小;青霉菌及酵母菌于 30 ℃
培养 3 ～ 5 d后测定抑菌圈直径。
1． 2． 4． 4 半边莲总黄酮的最低抑菌浓度(MIC)测
定
取 0． 1 g /mL的半边莲总黄酮样品液，采用二倍
稀释法［10］稀释为:100、50、25、12． 5、6． 25、3． 125、
1. 5625、0 mg /mL 并加入到培养基中，将浓度为 1． 0
668 天然产物研究与开发 Vol. 27
×103 cfu /mL菌悬液接种到各试管内，细菌置于 37
℃恒温培养箱内培养 1 d后，霉菌及酵母菌于 30 ℃
培养 3 ～ 5 d，观察结果。以完全无菌生长的最高稀
释度为半边莲总黄酮对该菌的最低抑菌浓度
(MIC)。
2 结果与分析
2． 1 单因素实验
2． 1． 1 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响
在提取时间 2 h、料液比 1 ∶ 40、水浴温度 60 ℃
条件下，分别用 50%、60%、70%、80%、90%的乙醇
进行提取，考察乙醇浓度对总黄酮提取率的影响，结
果见图 1(A)。
由图 1(A)可知，随着乙醇浓度的增大，总黄酮
的提取率也增加，当乙醇浓度为 70%时总黄酮提取
率最大;乙醇浓度继续增大，总黄酮提取率反而减
少。可能是由于乙醇浓度不同，相对杂质含量不同，
其极性也不一样，在乙醇浓度为 70%时，极性相似，
使黄酮提取率最高。
2． 1． 2 料液比对总黄酮提取率的影响
分别以 1∶ 30、1∶ 40、1∶ 50、1∶ 60、1∶ 70 的料液比，
在提取时间 2 h、乙醇浓度 70%、水浴温度 60 ℃下
进行提取，考察料液比对总黄酮提取率的影响，结果
见图 1(B)。
由图 1(B)可知，随着溶剂量的增加，总黄酮提
取率逐渐升高，到 50 倍量以后基本持平。由于料液
比增加，会给后续处理工序增加困难，在保证提取效
果的前提下，为节约成本，应尽量减少溶剂用量和降
低蒸发浓缩负荷，故选用 1∶ 40、1∶ 50、1∶ 60 进行正交
实验。
2． 1． 3 提取温度对总黄酮提取率的影响
在料液比 1 ∶ 40、乙醇浓度 70%，提取时间 2 h
条件下，分别以水浴温度 40、50、60、70、80 ℃下进行
提取，考察水浴温度对总黄酮提取率的影响，结果见
图 1(C)。
由图 1(C)可知，当温度低于 60 ℃时，总黄酮提
取率随着温度的升高而增加，可能温度的升高，溶剂
的粘度减小，分子运动速度加快，浸提液的扩散系数
增加，促使浸提速度加快，提取率升高;温度高于 60
℃时，黄酮提取率反而降低，可能温度的升高使黄酮
化合物结构遭到破坏，故提取率降低。
2． 1． 4 提取时间对总黄酮提取率的影响
在水浴温度 60 ℃、料液比 1∶ 40、乙醇浓度 70%
条件下进行提取，分别提取 1、1． 5、2、2． 5、3 h，考察
提取时间对总黄酮提取率的影响，结果见图 1(D)。
由图 1(D)可知，随着提取时间的延长，总黄酮
提取率先升高后下降。可能提取时间越长，总黄酮
在乙醇溶液中充分溶解，提取率最高;但提取时间过
长，会导致部分总黄酮的氧化分解，从而提取率降
低。
1.7
1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0总
黄
酮
提
取
率（
%
） 1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0总
黄
酮
提
取
率（
%
） 1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0总
黄
酮
提
取
率（
%
） 2.0
1.9
1.8
1.7
1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0总
黄
酮
提
取
率（
%
）
50% 60% 70% 80% 90
乙醇浓度（%）
30% 40% 50% 60% 70
料液比（1：X）
40% 50% 60% 70% 80
温度（℃）
1.0% 1.5% 2.0% 2.5% 3.0
提取时间（h）
A B C D
图 1 乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取温度(C)、提取时间(D)对总黄酮提取率的影响
Fig. 1 Effects of ethanol concentration (A) ，solid-liquid ratio (B) ，extraction temperature (C)and extraction duration (D)on the
extraction yield of total flavonoids
2． 2 正交实验优化提取工艺
按 1． 2． 1 中表 1 进行实验，结果见表 2。
由正交试验的极差分析可知，乙醇浓度、料液
比、提取温度、提取时间对半边莲中总黄酮的提取率
均有不同程度的影响，其中提取时间影响最大，料液
比影响最小，各因素的影响顺序依次是:B ＞ A ＞ D ＞
C，即提取时间 ＞提取温度 ＞乙醇浓度 ＞料液比。
综上所述分析可得半边莲中总黄酮的提取工艺
最佳组合是:A2B2C1D2，即提取温度 60 ℃、提取时
间 2． 5 h、料液比为 1∶ 40、乙醇浓度为 60%。采用上
述最优工艺条件进行验证试验，最终得到半边莲中
总黄酮提取率为 1． 69%。
2． 3 半边莲总黄酮提取物的抑菌效果
2． 3． 1 抑菌活性
由表 3 可知，半边莲提取物溶液对 6 种供试菌
均有一定的抑制作用，提取液浓度在 1． 0 g /mL时对
768Vol. 27 蒋琼凤等:半边莲总黄酮提取工艺及抑菌活性的研究
表 2 正交实验结果
Table 2 Ｒesults of orthogonal experiment
试验号
No． A B C D
提取率
Extraction yield(%)
1 1 1 1 1 1． 37
2 1 2 2 2 1． 63
3 1 3 3 3 1． 25
4 2 1 2 3 1． 57
5 2 2 3 1 1． 69
6 2 3 1 2 1． 55
7 3 1 3 2 1． 51
8 3 2 1 3 1． 74
9 3 3 2 1 1． 34
k1 1． 417 1． 483 1． 553 1． 467
k2 1． 603 1． 687 1． 513 1． 563
k3 1． 530 1． 380 1． 483 1． 520
Ｒ 0． 186 0． 307 0． 07 0． 096
各菌的抑菌作用明显大于 0． 1 g /mL;提取物对各供
试菌的抑制效果不同，其强弱顺序为:大肠杆菌 ＞变
形杆菌 ＞金黄色葡萄球菌 ＞枯草芽孢杆菌 ＞青霉菌
＞酵母菌。黄酮类化合物属于酚类衍生物，可以通
过破坏细胞壁以及细胞膜结构的完整性，导致微生
物细胞释放胞内成分，引起膜的电子传递、ATP活性
等功能障碍［8］，从而抑制微生物的生长。
表 3 半边莲总黄酮提取物对各供试菌的抑菌效果
Table 3 The bacteriostatic effect of total flavonoids from L． chinensis on the tested microbateria
提取物浓度
Extract
concentration
抑菌圈直径 Bacteriostatic diameter(mm)
大肠杆菌
Escherichia
coli
变形杆菌
Proteusbacillus
vulgaris
金葡球菌
Staphylococcus
aureu
枯草杆菌
Bacillus
subtilis
青霉菌
Penicillium
酵母菌
Yeasts
1． 0 g /mL 16． 0 14． 4 11． 6 10． 4 9． 1 8． 8
0． 1 g /mL 14． 1 12． 6 10． 3 9． 2 － －
无菌盐水 Sterile saline － － － － － －
注:“-”表示无抑菌圈出现。
Note:“-”indicates no inhibition zone．
2． 3． 2 半边莲总黄酮的最低抑菌浓度
由表 4 可知，半边莲黄酮提取物对各供试菌的
抑制作用随着浓度的增大而增加;样品溶液为 100
mg /mL和 50 mg /mL 时各供试菌株均不能生长，在
25 mg /mL时枯草芽孢杆菌少量生长，在 12． 5 mg /
mL时金黄色葡萄球菌少量生长，在 6． 25 mg /mL 时
大肠杆菌与变形杆菌均可生长，故半边莲总黄酮提
取物对大肠杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草
芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别为:12． 5、12． 5、25、50
mg /mL;提取物浓度为 100 mg /mL 时，对青霉菌和
酵母菌抑制作用均不明显。
3 结论与讨论
本研究以总黄酮提取量为技术指标，采用热水
辅助乙醇提取法，通过单因素和正交实验，得到了半
边莲中总黄酮的最佳提取工艺条件为:以 60%乙醇
作为溶剂，料液比为 1∶ 40(g /mL) ，水浴温度 60 ℃，
水浴处理时间是 2． 5 h。此条件下，总黄酮提取率
为:1． 69%。半边莲总黄酮提取物具有一定的抑菌
活性，对大肠杆菌的抑制效果最好，其次为变形杆
菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、青霉菌和酵母
菌。在半边莲提取物溶液浓度为 100 mg /mL或低
868 天然产物研究与开发 Vol. 27
表 4 半边莲总黄酮提取物对各供试菌的最低抑菌浓度
Table 4 The MIC of total flavonoids from L． chinensis on the tested microbateria
供试细菌
Strains tested
提取物浓度 Extract concentration (mg /mL)
100 50 25 12． 5 6． 25 3． 125 1． 563 0
大肠杆菌 Escherichia coli － － － － + + + + + + + + +
变形杆菌 Proteusbacillus vulgaris － － － － + + + + + + + + +
金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureu － － － + + + + + + + + + + +
枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis － － + + + + + + + + + + + + + +
青霉菌 Penicillium + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
酵母菌 Yeasts + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
注:肉汤清亮透明表示无菌生长(-) ;肉汤少量浑浊表示有少量菌生长(+) ;肉汤有部分浑浊或沉淀表示有部分菌生长(+ +) ;肉汤有大部分
浑浊或大量沉淀表示菌大量生长(+ + +)。
Note:“-”indicates no bacteria growth;“ +”indicates a few bacteria growth;“ + +”indicates some bacteria growth;“ + + +”indicates many bacteria
growth．
于 100 mg /mL时，对青霉菌和酵母菌抑制作用不明
显。
研究中半边莲总黄酮提取物对大肠杆菌等革兰
氏阴性菌的抑制效果大于其他两种革兰氏阳性菌，
此结果与徐金龙等［11］人研究南酸枣黄酮提取物的
抑菌活性结果有出入，可能是黄酮类化合物在半边
莲中存在的形式与其不同，详尽原因还有待进一步
研究。半边莲属植物品种繁多，分布广泛，我国共有
20 多种，资源相当丰富，且半边莲提取物对细菌、霉
菌均有抑制作用，说明半边莲黄酮是值得大力推广
的天然抑菌剂和保鲜剂。
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