全 文 ：作者简介:马鑫鑫(1985-),女 ,汉 ,辽宁大连人 ,辽宁师范大学生命科学学院学生。 　　收稿日期:2007-07-19
荚果蕨叶柄的组织培养及无性系建立
马鑫鑫　杜　滨　赵　静　佟少明　姜长阳
(辽宁师范大学生命科学学院 ,辽宁大连　 116029)
摘　要:以荚果蕨叶柄为外植体 ,以 1/2MS、1/3MS为基本培养基 , 附加不同浓度的 BA、2, 4 -D、IAA、NAA,诱导叶柄
形成愈伤组织 , 并使愈伤组织分化形成幼叶 , 培养成生根试管苗 , 建立起荚果蕨无性系。结果表明:1/2MS+
NH4H2PO4 150 mg· L-1 +BA0.5 mg· L-1 +2, 4-D1.4mg· L-1 +NAA1.4 mg· L-1是诱导叶柄形成具有分化能力愈
伤组织的理想培养基;1/2MS+BA0.5 mg· L-1 +NAA0.1 mg· L-1是愈伤组织分化培养的理想培养基;1/3MS+
IAA0.9 mg· L-1这一培养基是荚果蕨试管苗生根培养的理想培养基;移栽到田间的试管苗长势旺盛 、整齐 , 根茎上的
须根比附近的野生植株增加 1-1.5倍。
关键词:荚果蕨;组织培养;愈伤组织;无性系
中图分类号　S188　　　文献标识码　A　　　文章编号　1007-7731(2007)15-21-03
TissuecultureandEstablishmentofAsexualLineofPetiolefromMateucciastruthiopteris
MaXinXinDuBinZhaoJingTongShaoMingJiangChangYang　(ColegeofLifeSciences, LiaoningNormalUniver-
sityLiaoningDalian116029)
Abstract:ThepetiolewastheexplantsfromtheMatteucciastruthiopteris, taken1/2MS, 1/3MSasthebasicculturemedium
whichwereaddeddiferentconcentrationofBA, 2, 4-D, IAA, NAAfortheinductionofcalus.Theyoungleavesweredif-
ferentiatedfromthecallusandthenrootedandgrewaseedling.Theresultsshowedthattheoptimummediawhichinduced
caluswas1/2MS+NH4H2PO4 150 mg· L-1 +BA0.5mg· L-1 +2, 4 -D1.4 mg· L-1 +NAA1.4 mg· L-1;1/2MS+
BA0.5 mg· L-1 +NAA0.1 mg· L-1 wastheoptimumforcallusdiferentiation;
Keywords:
　　荚果蕨(Mateucciastruthiopteris)又称黄瓜香 、荚果观
众 ,属于球子蕨科荚果蕨属多年生草本蕨类植物 ,我国在
华北 、东北 、陕西 、四川等地有分布 ,主要生长于林下 、山脚
下阴湿地和小溪边等 [ 1] 。荚果蕨含有狗脊蕨酸 、麦角甾 、
芹菜素 、核黄素等成分 [ 2] ,因其具有清热解毒 、止血驱虫等
药效 ,近年来辽宁南部地区人们经常采集供药用或观赏栽
培 ,使原本分布数量就较少的荚果蕨野生资源遭到了破
坏 ,导致野生资源分布区域和数量迅速减少。为了满足人
们药用的需要 ,有人开始进行人工栽培。但由于荚果蕨的
孢子在人工条件下不易萌发 ,只能挖取野生植株作为人工
栽培的种源 ,这不仅使已经非常有限的野生资源又遭到了
破坏 ,而且也很难挖到满足人们栽培需要的大量种苗 。为
此 ,我们进行了荚果蕨的组织培养和无性系建立的研究 ,
以满足人们的需要 。
1　材料与方法
1.1　材料及灭菌　将采自庄河市步云山上生长非常旺盛
的荚果蕨植株叶柄 、叶片和根茎用清水冲洗 30 min左右
后 ,在 500 ml的磨口广口瓶中用 0.05%的安利液振荡洗
涤 3次 ,再用蒸馏水洗涤 2次 ,然后将材料移到超净工作
台上 ,在无菌条件下用 75%的乙醇振荡灭菌 30s后 ,用
0.05%的 HgCl2溶液振荡灭菌 2min,再用 0.03%的 HgCl2
溶液振荡灭菌 10min,最后用无菌水振荡洗涤 5次即获得
无菌材料。
1.2　培养条件 　
1.2.1　培养基及培养条件　以 1/2MS为基本培养基 ,附
加不同种类 、不同浓度的细胞分裂素和生长素。固体培养
基琼脂含量为 6g· L-1 , pH值为 5.6-5.8;诱导愈伤组织
培养基含蔗糖 30g· L-1 ,生根培养基为 15g· L1,光照强
度 2000Lx左右 ,光照时间 12 h/d,培养温度 23℃。
2　结果与分析
2.1　不同培养基对叶柄 、叶片与根茎愈伤组织诱导的影
响　将材料接种在附加不同浓度生长素配比的 1/2MS+
NH4H2 PO4150mg.L-1(单位下同略)+BA0.5培养基上
暗培养 ,由于切口损伤部位直接接触到培养基 ,培养 40d
左右 ,切口表面长出松散的愈伤组织。接着继续培养 30d
观察统计。由表 1可见 ,在不含生长素和生长素的含量低
于 0.4的培养基上 ,几乎不能诱导形成愈伤组织;在 2, 4-
D、NAA单独使用 ,含量在 0.6 -2.2的范围内 ,随着生长
素含量的增加 ,愈伤组织的诱导率不断提高 。在同时含有
2, 4-D、NAA的培养基上 、且总浓度达到 1.2时 ,随着生
长素浓度的增加 ,愈伤组织的诱导率也随着增加。但当两
种生长素配合使用 ,其浓度超过 1.8时 ,愈伤组织诱导率
出现降低的趋势。从 3种不同材料的愈伤组织的诱导率
看 ,叶柄的诱导率最高 ,根茎次之 ,叶片最差;在以叶柄为
21安徽农学通报 , AnhuiAgri.Sci.Bul.2007, 13(15):21-23
DOI :10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2007.15.058
材料 ,同时含有浓度均为 1.4的 2, 4 -D与 NAA培养基
上 ,不仅愈伤组织的诱导率达到了 89%,而且愈伤组织生
长速度快 。观察表明 ,在这一培养基上诱导生长的愈伤组
织初期为略带黄色不规则形 ,当培养到 70d时生长为黄色
的颗粒状。将在 1/2MS+NH4H2 PO4 150+BA0.5 +2, 4 -
D1.4+NAA1.4培养基上诱导培养的叶柄愈伤组织接种
到相同的培养基上 ,转到光照条件下进行继代培养。培养
10d左右 ,黄色的颗粒状愈伤组织逐渐变成了浅绿色的颗
粒状 ,并开始迅速生长增殖;当培养到 50d时 ,愈伤组织平
均生长增殖率为 22倍 ,连续继代培养 12代 ,愈伤组织的
生长增殖速度与外部形态基本保持不变 。这种愈伤组织
为具有分化能力的愈伤组织 [ 3, 4] 。这说明 1/2MS+
NH4 H2PO4150+BA0.5+2, 4-D1.4+NAA1.4这一培养
基为诱导荚果蕨根茎形成具有分化能力愈伤组织的理想
培养基 。
表 1　不同浓度生长素对愈伤组织诱导的影响
生长素
(mg· L-1)
NAA 2, 4-D
根茎
诱导数
根茎
诱导
率(%)
叶片
诱导数
叶片
诱导
率(%)
叶柄
诱导数
叶柄
诱导
率(%)
0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
0
0
0
0
0
0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.2
0
0
0
0
0
0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.2
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.2
0
0
8
22
37
43
0
12
17
47
61
68
0
21
48
66
55
19
0
0
8
22
37
43
0
12
17
47
61
68
0
21
48
66
55
19
0
0
4
5
23
33
0
0
7
16
28
24
0
32
50
54
28
14
0
0
4
5
23
33
0
0
7
16
28
24
0
32
50
54
28
14
0
0
11
18
34
58
0
14
24
51
59
77
2
16
67
89
45
22
0
0
11
18
34
58
0
14
24
51
59
77
2
20
67
89
45
22
　　注:接种数量均为 100
2.2　愈伤组织的继代培养与分化培养　把经过上述继代
培养的浅绿色的颗粒状愈伤组织 , 接种到以 1/2MS、 1/
3MS为基本培养基 , 附加不同激素浓度 BA、 NAA的分
化培养基中进行颗粒状愈伤组织的分化培养 。接种后
25d有的培养基上可见分化出幼叶 , 随着培养时间的延
长 , 愈伤组织的表面逐渐分化出布满培养基表面的丛生
叶 。培养到 65d时进行统计 。由表 2表明 , 在 BA含量为
0.2、 NAA的含量分别为 0.1、 0.2、 0.5、 1的培养基上 ,
以及在 BA含量为 0.5、 NAA的含量分别为 0.1、 0.2、
0.5的培养基上和在 BA含量为 1、 NAA的含量为 0.1的
培养基上 , 能诱导愈伤组织分化。其中在 1/2MS+
BA0.5+NAA0.1这一培养基上不仅愈伤组织颗粒分化率
达 94%, 而且分化的丛生叶长势旺盛 。把在这一培养基
上分化的丛生叶 , 切成具有 3-4个叶 、 基部具有愈伤组
织叶丛 , 接种到相同培养基上进行分化继代培养。经过
50d的培养 , 能分化出生长较为旺盛的丛生嫩叶 , 平均
分化增殖率为 24.5倍 。经过连续 9次的继代培养 , 其分
化率和长势基本不变。这说明 1/2MS+BA0.5+NAA0.1
这一培养基是荚果蕨愈伤组织分化和丛生叶分化培养的
理想培养基 。
表 2　不同激素配比对颗粒愈伤组织分化的影响
激素
(mg· L-1)
BA NAA
分化颗
粒数
1/2MS
分化率
(%)
长势 分化颗粒数
1 /3MS
分化率
(%)
长势
0.0 0.0 0 0 0 0.0 0
0.2 0.1 112 56 +++ 104 52.0 +++
0.2 0.2 128 64 ++ 70 35.0 ++
0.2 0.5 86 43 + 16 8.0 +
0.2 1.0 37 18.5 + 13 6.5 +
0.5 0.0 0 0 0.0 0
0.5 0.1 188 94 +++ 56 28.0 ++
0.5 0.2 77 35.5 ++ 42 21.0 +
0.5 0.5 47 23.5 6 3.0 +
0.5 1.0 0 0 0.0 0
1.0 0.0 0 0 0.0 0
1.0 0.1 28 14 + 36 18.0 +
1.0 0.2 0 0 0.0 0
1.0 0.5 0 0 0.0 0
1.0 1.0 0 0 0.0 0
　　注:接种颗粒数均为 200;+++为长势好 , ++为长势较好;+
为长势一般。
2.3　不同浓度激素对生根培养的影响　将在分化培养基
上继代分化培养生长较为旺盛的分化叶丛 ,切成基部由愈
伤组织块连接的 3-5个分化叶后 ,接种到附加不同浓度
IAA、NAA的 1/3MS为基本培养基的培养基上 ,进行生根
培养。接种 7-10d后 ,在有的培养基上培养的材料能形
成可见根原基 , 30d时观察统计。由表 3可见 ,在附加不
同浓度 IAA或 NAA的 1/3MS生根培养基上 ,除了 NAA的
含量为 1.5的培养基外 ,其他均可诱导生根 。但是 ,在附
加不同浓度 NAA的生根培养基上 ,不仅诱导生根率较低 、
生根数较少 ,而且所生出的根多数是由基部愈伤组织发出
的 ,在移栽中这样的根都属于无效根 [ 5] 。而在附加不同浓
度 IAA的生根培养基上 ,不仅诱导生根率较高 、生根数较
多 ,而且所生出的根多数是由分化叶叶柄基部发出的。尤
其是在 IAA浓度为 0.9的生根培养基上 ,不仅接种材料的
生根率达到了 93%,平均生根数为 7.8条 ,而且生根苗生
长较为旺盛 。把在这一培养基上培养的生根试管苗继续
培养 30d,约 80%生根试管苗可以长出长 0.3 cm左右的
直立根茎。上述说明 1/3MS+IAA0.9这一培养基是荚果
蕨试管苗生根培养的理想培养基。
2.4　试管苗的移栽　选择根数多 、有根茎 、试管苗生长较
旺盛的培养瓶 ,打开瓶塞 ,放到强度为 4000Lx左右的光照
下炼苗 3-4d后 ,将试管苗从培养瓶中取出 ,立刻用净水
洗去基部的培养基 ,然后移栽到铺有约 10 cm厚河沙 、珍
珠岩 、炉灰渣或肥沃园土 4种不同基质的温室苗床上。在
保持温度 18℃-28℃、湿度 90%左右 、没有直射光照的条
件下 ,移栽后 15d成活 , 25d左右开始正常生长。 30d时观
察统计证明 ,移栽到于炉灰渣为基质的苗床上 ,不仅移栽
成活率都在 91%以上 ,而且试管苗生长旺盛整齐 ,根系较
发达。
22
表 3　不同浓度激素对生根的影响
激素
(mg· L-1)
BA NAA
根数 生根率(%) 平均生根条数 /叶丛
0.0 0.0 0 0 0.0
0.3 0.0 27 27 2.6
0.6 0.0 69 69 4.2
0.9 0.0 93 93 7.8
1.2 0.0 37 37 3.5
1.5 0.0 11 11 2.3
0.0 0.3 8 8 2.8
0.0 0.6 35 35 4.4
0.0 0.9 26 26 3.0
0.0 1.2 9 9 4.3
0.0 1.5 0 0 0.0
　　注:接种数量均为 100。
5月中旬把在温室中移栽成活的试管苗移栽到田间 ,
到 10月下旬 ,试管苗长势旺盛 、整齐 ,根茎上的须根比附
近的野生植株增加 1-1.5倍。
3　讨论
尽管目前已经多有蕨类植物组织培养及无性系建立
的报道 [ 5-11] ,但迄今未见荚果蕨组织培养的报道。
本研究以荚果蕨的叶柄为材料 ,进行了组织培养研
究 ,成功地诱导了愈伤组织 ,建立起荚果蕨的无性系 ,不仅
可以提供长势旺盛 、整齐的荚果蕨种苗 ,而且为荚果蕨的
种质保存提供了可能。由此还能证明 ,荚果蕨非分生组织
和细胞也具有全能性。
荚果蕨叶柄诱导的颗粒状愈伤组织 ,在继代培养 50d
可增殖 24.5倍 ,这说明通过这种人工方法 ,荚果蕨可以繁
殖出大量无性系后代 ,从而满足了生产上对大量种苗的需
求 ,而且也可以把这种愈伤组织作为转基因研究材料 ,对
荚果蕨进行基因工程的研究。
在进行愈伤组织的诱导中 ,接种的 3种非分生材料 ,
叶柄的诱导率最高 ,这种结果一方面说明荚果蕨叶柄的分
生力较强 ,另一方面也可能与叶柄较大 ,在灭菌中受到的
损伤较小有关。
移栽到田间的试管苗长势旺盛 、整齐 ,根茎上的须根
比附近的野生植株增加 1 -1.5倍 ,一方面与在培养过程
中使用生长素 ,移栽到田间后 ,生长素仍在发挥后效作用
有关 ,另一方面也可能与研究所用的材料具有生长旺盛的
遗传性有关 。
参考文献
[ 1]中国科学院植物研究所主编.中国高等植物图鉴(第一册)[ M]
.北京科学出版社.1972.220
[ 2]杨岚 ,王满元 ,赵玉英 ,屠呦呦.荚果观众化学成分的研究 [ M] .
西安 ,西安交通大学出版社 , 2004:35-40
[ 3]安利佳 ,姜长阳.植物组织培养导论 [ M] .大连:辽宁师范大学
出版社 , 1996, 67-72
[ 4]胡尚连 ,王丹.植物生物技术 [ M].西安 ,西安交通大学出版社 ,
2004:35-40
[ 5]李文安等 .狼尾蕨的离体培养 [ J] .上海:植物生理学通讯 ,
1993, 29(3):44
[ 6]尹怀约.贯众叶片愈伤组织的诱导和植株再生 [ J] .上海:植物
生理学通讯 , 1989, (4):39-45
[ 7]郑若仙.彩叶凤尾蕨孢子离体繁殖与组织培养 [ J] .上海:植物
杂志 , 1992, 28(2):8
[ 8]金建平等.皱叶肾蕨卷曲叶尖的离体培养 [ J].上海:植物生理
学通讯 , 1992, 28(5):359-360
[ 9]黄韶玲等 .鹿角蕨的组织培养 [ J] .上海:植物生理学通讯
.1993, 29(1):25
[ 10]秦廷豪 ,邹宗兰.鸟巢蕨的组织培养 [ J] .上海:植物生理学通
讯 , 2004, 40(3):349
[ 11]彭晓明 ,曾宋君.铁线蕨的组织培养及植株再生 [ J] .上海:植
物生理学通讯 , 2004, 40(5):575 (胡克玲编 , 张琪琪校)
(上接 27页)有的性状就是系统外性状。
从中可以得知 ,生物系统外系性状让某个生物系统所
具备 、表达的并不多 ,否则 ,生物就不能称其为生物了。
从近年来人类的科学实践和研究中可以看到 ,凡是生
物系统内性状 ,对于这些目的性状基因 ,欲要得到理想的
预期的转基因生物的确很难 ,至今 ,取得成功的事例不多。
为什么呢 ?前文已提到 ,属于系统内性状的外源基因 ,一
旦转入受体植物 ,那对原生态的原生命系统是无端的介入
和干预 ,整个生命系统要重新调整 ,因为介入的性状与原
系统的性状相同或相似 ,一个成分的多 、少都影响了原生
命系统的平衡和稳定。由于受到基因互作 ,基因多效性等
因素的影响 ,很难精确地预测外源基因在新的遗传背景中
可能产生的表型效应和副作用 ,也不了解它们对人类健康
和环境产生何种影响。
　　如果转基因生物的目标是针对生物系统内性状(期望
在新的转基因品种中提升该性状值),其实 ,我们也可以通
过物种性状的多态性或生物的多样性来解决同样问题 。
如果人类专门为了获取某些特定的生化产物而采用转基
因手段 ,目标和方向完全变了 ,这是转基因手段另外性质
的应用 。
3　转基因生物的前景展望　
实践表明 ,转基因生物较成功的是能充分转入受体生
物 “生物系统外 ”性状。因此 ,人们最好不要把希望放在
转基因这条途径来改变生物固有的性状 ,如农作物的产
量 、品质等 ,效果不理想 。转基因作物所能完成的只是适
应或表达人为造成的少许生物系统外的性状 ,其种类很有
限 ,而且发展面积也是有限的 ,过量发展 ,肯定会破坏生物
界多样性及生态平衡。 (张琪琪编 , 魏凤校)
外文字母的大小写
1.中国人名用汉语拼音拼写时 ,姓和名的第一个字母均大
写;若是双名 ,第二个名字小写 ,双名连写 ,中间不加连线 ,如
ZouShuming。2.国家、国际组织 、国际会议 、条约 、文件等用大
写开头(缩写亦然)。3.书名、期刊名 、作品等英文除前置词、虚
词以外 ,每个词均大写开头;俄文则只是第一个词大写开头。
23