全 文 ：第 29卷
Vol.29 　
第 3期
No.3
西华 师 范 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 )
JournalofChinaWestNormalUniversity(NaturalSciences)
2008年 9月
Sep.2008
文章编号:1673-5072(2008)03-0263-06
　　收稿日期:2008-06-20
基金项目:四川省杰出青年学科带头人培养计划项目(04ZQ026 -047);四川省科技厅应用基础项目(03JY029 -021 -
22);四川省重点学科项目资助(SZD0420).
作者简介:王　箫(1980-), 女 ,山东汶上人 , 西华师范大学生命科学学院硕士研究生 , 主要从事植物组织培养研究.
通讯作者:黎云祥(1968-), 男 ,四川丹棱人 , 西华师范大学生命科学院教授 ,博士生导师 ,主要从事植物学研究.
白簕愈伤组织的诱导及褐化的防治
王　箫 ,黎云祥 ,邹利娟 ,余啊梅
(西华师范大学生命科学学院 , 四川南充　 637002)
摘　要:研究了不同培养条件 、激素和外植体对白簕愈伤组织诱导的影响 ,并探讨其愈伤组织褐化的防治.结果表
明:白簕愈伤组织诱导的适宜外植体为叶片 , 叶片愈伤组织诱导的最佳培养基为 MS+2, 4-D1.0 mg/L+ 6-BA
1.0mg/L, 诱导率高达 92.7%.在继代培养中 , 采用固体培养对防止愈伤组织的褐化效果最佳 , 在培养基中分别添
加 lg/L的活性炭 1g/LPVP,也可以有效防止褐化.
关键词:白簕;愈伤组织;外植体;褐化
中图分类号:Q944.6　　　文献标识码:B
白簕(Acanthopanaxtrifoliate(L).Merr.)是五加科五加属的一种攀援状灌木.主要分布于我国中部和南
部各省区.白簕以根 、叶或全株入药 ,具有清热解毒 ,祛风除湿 ,散瘀止痛的药用价值;朱立新通过对白簕嫩叶
的营养品质进行分析表明白簕也具有很高的营养价值 [ 1] .除此之外 ,白簕嫩叶还具有健脑和增强脑细胞呼
吸作用的功能[ 2] .因此 ,白簕是一种营养和保健价值都很高的野生蔬菜 .
近年来 ,国内外在其化学成分方面做了许多的研究 [ 3-12] ,而其组培方面仍是空白.由于植物组织 、细胞
培养具有快速 、高效 、低成本的优点 ,目前利用植物组织培养和细胞培养法生产某些药用成分的研究在国内
外应用越来越广 ,已成为植物药用成分生产的一条新途径.本研究以白簕叶片为外植体 ,探讨了不同调节因
子组合对其愈伤组织诱导的影响 ,以期采用组织培养技术对有效利用白簕资源奠定基础.
1　材料与方法
1.1　材　料
材料来源于四川省南充市金城山森林公园 (106°28′E, 30°45′N),将其移栽至西华师范大学田间试验
地.分别选取存活且生长健壮的白簕的幼嫩叶片 、茎段和叶柄为供试材料.
1.2　试验方法
1.2.1　愈伤组织的诱导
将材料取回后 ,先用自来水冲洗 2 h,在超净工作台上先用 70%的酒精浸泡 30s,再用 0.1%的升汞消毒
8 min,取出后用无菌水冲洗 5-6次 ,用无菌滤纸吸去表面水珠.叶片切成 0.5cm×0.5cm的小方块 ,茎和叶
柄切成 0.5cm的小段 ,按无菌操作要求接种于培养基上 ,分别针对外植体类型 、不同培养条件 、激素浓度及
配比等因素进行愈伤组织的诱导研究.培养温度为(24±1)℃,除非特别指明 ,一般光照强度为 1 000 -
1 500 1x,时间为 12-14 h/d, pH6.0,琼脂 0.7%,蔗糖 3%.
1.2.2　愈伤组织褐化的防止
分别采用 MS培养基附加 2, 4-D1.0mg/L, 6-BA1.0mg/L,蔗糖 30g/L,分固体培养和液体培养 2种
方式 ,固体培养附加琼脂 7 g/L, pH值 6.0,共 2个处理.采用 Ms培养基附加不同浓度的 2, 4-D和 6-BA,
蔗糖 30g/L,琼脂 7g/L, pH值 6.0,共 10个浓度处理.采用 MS培养基附加 2, 4-D1.0mg/L, 6-BA1.0mg/
DOI :10.16246/j.issn.1673-5072.2008.03.013
264　 西华师范大学学报(自然科学版) 2008年
L,蔗糖 30 g/L,琼脂 7g/L, pH值 6.0,设添加 lg/L活性炭和 lg/LPVP与不添加 4个处理.
2　结果与分析
2.1　不同处理对愈伤组织诱导的影响
2.1.1　不同外植体对愈伤组织诱导的影响
见表 1.
表 1　不同外植体类型对白簕愈伤组织诱导的影响
Tab.1　EfectofdiferentexplantsoncalusinductionofA.trifoliate
外植体 接种数 出愈率(%) 出愈量 愈伤组织颜色 质地
茎段 60 80.2 + 浅绿色绒毛状 坚硬 不透明
叶柄 60 33.3 ++ 白色略黄 疏松 透明
叶片 60 87.4 +++ 淡黄色 较疏松 半透明
注:培养 30d后进行数据统计.愈伤组织的生长量分 3级:+生长量小;++生长
量中等;+++生长量大.
　　由表 1可知:以叶片 、茎段和叶柄为外植体 ,接种于 MS+2, 4-D1.0 mg/L+6-BA0.5 mg/L+
NAA0.1mg/L培养基上 ,结果显示:外植体类型不同 ,愈伤组织的诱导率不同 ,叶和茎都具有较高的诱导率 、
叶柄的只有 33.3%,但是 3种外植体诱导出的愈伤组织在颜色和质地上有一定的差异 ,叶柄诱导出的愈伤
组织呈白色略黄 ,疏松.叶诱导出的愈伤组织呈淡黄绿色 ,较疏松.茎段由于木质化较重诱导出的愈伤组织呈
浅绿色绒毛状 ,坚硬而致密 ,而且很难增长 (见图 1:A:叶片 B:叶柄 C:茎段).
2.1.2　不同激素组合对愈伤组织诱导的影响
见表 2.
表 2　不同激素浓度及配比对白簕愈伤组织诱导的影响
Tab.2　EfectofdiferenthormonecombinationsoncalusinductionofA.trifoliate
激素组合(mg/L)
6-BA 2, 4-D NAA 接种数 出愈率(%) 出愈率量 愈伤组织颜色 质地
0 0 0 40 0 - - -
0.6 0.5 0 40 60 ++ 淡黄绿色 较疏松 半透明
0.6 1.0 0 40 91 ++++ 淡黄绿色 较疏松 半透明
0.6 1.5 0 40 78 +++ 淡黄绿色 较疏松 半透明
0.5 0.5 0 40 54 ++ 淡黄绿色 较疏松 半透明
1.0 1.0 0 40 　92.7 ++++ 淡黄绿色 较疏松 半透明
1.5 1.5 0 40 75 ++++ 淡黄绿色 较疏松 半透明
0.5 1.0 　0.1 40 　　87.4% ++ 淡黄色 疏松 透明
0.5 1.5 　0.1 40 　66.3 ++ 淡黄色 疏松 透明
注:培养 30d进行数据统计;愈伤组织的生长量分 3级:++生长量中等;+++生长量较大;
++++生长量大.
　　由表 2可知:不同的激素组合对愈伤组织的诱导率 、出愈量及质地均有差异.其中 2, 4-D有较高的诱
导率 ,而加入适当低浓度的 NAA诱导率反而降低.这说明 2, 4-D对白簕外植体形成愈伤组织具有强诱导
作用 ,而 NAA的作用却不显著 ,但 NAA的有无可以使愈伤组织的颜色发生改变并且质地更疏松成颗粒状 ,
当培养基中有 NAA存在时愈伤组织由淡黄绿色变为淡黄色.此外 2, 4-D与 6-BA比值为 1时形成的愈伤
组织后期会褐化并生出许多透明的不定根(见图 1:D),且 6-BA在较高浓度(1.0mg/L以上)时形成的愈伤
组织不仅生长缓慢 ,呈灰褐色 ,而且很容易褐化死亡.同时我们也进行了光照和黑暗条件下对照培养实验 ,结
　第 29卷第 3期　　　　　　　　　王　箫 ,等:白簕愈伤组织的诱导及褐化的防治 265　
果显示 ,黑暗条件下愈伤组织生长较慢且褐化较快 ,呈黄褐色.
2.1.3　培养条件对愈伤组织诱导的影响
2.1.3.1　pH值对愈伤组织诱导的影响
见表 3.
表 3　pH值对白簕愈伤组织诱导的影响
Tab.3　EfectofdiferentpHvalueoncalusinductionofA.trifoliate
pH 接种数 出愈率(%) 出愈率量 愈伤组织颜色 质地
5.8 60 89 ++++ 黄绿色 水浸状 、疏松 , 半透明
6.0 60 　92.7 ++++ 淡黄绿色 疏松 、颗粒状 ,透明
6.2 60 75 +++ 焦黄色 坚硬致密 、颗粒状 , 不透明
注:MS+6-BA1.0+2, 4-D1.0;培养 30d进行数据统计.愈伤组织的生长量分 2级:
+++生长量中等;++++生长量大.
　　由表 3可知 pH值为 5.8,所诱导出的愈伤组织颜色较深呈黄绿色 ,质地呈水浸状 、疏松 ,半透明.pH值
为 6.2时 ,愈伤组织呈焦黄色 ,且质地坚硬致密 、颗粒状 ,不透明;这说明 pH值过高 ,导致培养基过硬 ,从而
使外植体不能与培养基紧密接触 ,导致外植体不易吸收营养而变黄.而当 pH值为 6.0时 ,愈伤组织颜色呈
淡黄绿色 ,质地疏松 、颗粒状 ,透明;且生长比较快.
2.1.3.2　不同光照处理对愈伤组织诱导的影响
见表 4.
表 4　不同光照处理对白簕愈伤组织诱导的影响
Tab.4　Efectofdiferentsun-shadingtreatmentsoncalusinductionofA.trifoliate
处理 接种数 出愈率(%) 出愈率量 出愈时间 愈伤组织颜色 质地
光培养 93 +++ 11 淡黄绿色 疏松颗粒状透明
暗培养 　39.5 + 24 黄褐色 坚硬致密不透明
光照 12h/d 91 +++ 14 淡黄绿色 疏松颗粒状透明
暗培 7 d 60 75 ++ 16 淡黄色 疏松颗粒状透明
暗培 14 d 60 56 ++ 20 淡黄色 疏松颗粒状透明
暗培 21 d 60 48 ++ 24 淡黄色 疏松颗粒状透明
注:MS+6-BA1.0+2, 4-D1.0;培养 30d进行数据统计.愈伤组织的生长量分 3级:+生长量小;
++生长量中等;+++生长量大.
　　由表 4可知:全光照培养或光暗交替培养诱导率都高达 90%以上;随着暗培养天数的增加出愈率也随
之下降;当完全暗培养时出愈率达到最低.这说明光照在白簕愈伤组织的诱导中起着重要的作用.
2.1.3.3　其它培养条件对愈伤组织诱导的影响
以 MS为基本培养基 ,通过改变无机盐的浓度 、糖的浓度和添加活性炭来研究愈伤组织的诱导情况(表 5).
表 5　盐浓度 、糖及活性炭对白簕愈伤组织诱导的影响
Tab.5　Efectofinorganicsaltconcentration, massfractionofsugarandActiveCarbon
处理 培养基(盐浓度) 糖含量(g/L) 活性炭 出愈率 /% 愈伤组织颜色 愈伤组织生长状况 质地
A1 MS 30 0 92 淡黄绿色 ++++ 疏松颗粒状透明A2 1/2MS 30 0 78 淡黄色 ++++ 疏松颗粒状透明
A3 2MS 30 0 　22.7 焦黄色 + 坚硬 ,致密
A4 MS 20 0 　86.3 淡黄色 ++++ 坚硬 ,致密
A5 MS 40 0 　35.7 焦黄色 + 坚硬 ,致密A6 MS 30 1g 0 - - -
A7 MS 30 5g 0 - - -
　　注:MS+6-BA1.0+2, 4-D1.0;培养 30 d进行数据统计.
266　 西华师范大学学报(自然科学版) 2008年
　　从以上试验结果来看 ,对形成愈伤组织因素的影响力大小为活性炭 >糖质量分数 >盐质量分数.活性炭
作为吸附剂虽然可以有效抵抗褐化但它同时吸收培养基内的有效物质使其浓度降低 ,从而严重抑制愈伤组
织的形成.糖含量以 30g/L为宜 ,浓度过高会对愈伤组织的形成产生抑制作用;盐浓度以 1/2 MS或 MS为
好 , 2MS会显著抑制愈伤组织的形成.
2.2　愈伤组织褐化的防治
2.2.1　不同培养方式对愈伤组织褐化的影响
采用液体培养对防止愈伤组织褐化效果较差 ,其褐化率明显高于固体培养方式.而且采用 MS液体培
养 ,愈伤组织接入 8d即出现褐化(表 6).该结论与红豆杉细胞继代培养中液体悬浮培养有助于减轻褐化的
理论不相符 [ 13] .
表 6　不同培养方式对白簕愈伤组织褐化的影响
Tab.6　EfectofdiferentcultureconditiononcalusbrowningofA.trifoliate
培养方式 基本培养基 愈伤组织个数 褐化数 褐化率 始现褐化物时间
固培 MS 30 7 　 23.3 15
液培 MS 30 30 100 8
　　　　　　　　　注:MS+6-BA1.0+2, 4-D1.0;培养 30d进行数据统计.
2.2.2　不同激素浓度和配比对愈伤组织褐化的影响
在 MS基本培养基上 ,附加不同浓度的 6-BA、NAA及 2, 4-D对白簕愈伤组织褐影响的差异(表 7).
表 7　不同激素浓度和配比对白簕愈伤组织褐化的影响
Tab.7　EfectofdiferenthormonecombinationsoncalusbrowningofA.trifoliate
植物激素(mg/L)
6-BA NAA 2, 4-D 愈伤组织褐化程度 愈伤组织颜色 愈伤组织生长量 质地
1.0 0 0 ++++ 褐色 + 坚硬
2.0 0 0 ++++ 褐色 + 坚硬
1.0 　0.1 0 +++ 灰褐色 ++ 较致密
2.0 　0.1 0 +++ 灰褐色 ++ 较致密
1.0 　0.2 0 +++ 灰褐色 ++ 较致密
2.0 　0.2 0 +++ 灰褐色 ++ 较致密
3.0 　0.5 0 +++ 灰褐色 ++ 较致密
1.0 0 　0.1 ++ 黄褐色 +++ 疏松颗粒状
2.0 0 　0.1 ++ 黄褐色 ++++ 疏松颗粒状
1.0 0 　0.2 ++ 黄褐色 +++ 疏松颗粒状
2.0 0 　0.2 + 黄褐色 ++++ 疏松颗粒状
注:培养 40d进行数据统计;(1)愈伤组织的生长量分 4级:+生长量小;++生长量中等;+++生长
量较大;++++生长量大.(2)愈伤组织的褐化程度分为 4级:+褐化程度小;++褐化程度中
等;+++褐化程度较重;++++褐化程度严重.
　　由表 7可知:6-BA与 2 , 4-D组合可以减轻褐化且愈伤组织生长较快;单独使用细胞分裂素 6-BA会
使褐化加重 ,愈伤组织生长缓慢且坚硬而致密;这是因为在细胞分裂素类中 ,一般认为 6-BA有刺激多酚氧
化酶活性提高 、加重褐变的作用 ,这在甘蔗组培 [ 14]中表现最为明显.6-BA与 NAA组合也可以减缓褐化并
且长势良好但形成的愈伤组织质地比较致密不利于增殖.当 6-BA2.0mg/L、2, 4 -D0.2mg/L时褐化最轻 ,
愈伤组织长势最好.在本处理过程当中皆有不定根出现 ,颜色透明或呈绿色 ,这可能是由于白簕本身内源生
长素比较高所致(见图 1　E, H).
2.2.3　活性炭和 PVP对愈伤组织褐化的影响
见表 8.
　第 29卷第 3期　　　　　　　　　王　箫 ,等:白簕愈伤组织的诱导及褐化的防治 267　
表 8　活性炭和 PVP对白簕愈伤组织褐化的影响
Tab.8　EfectofactivecarbonandPVPoncalusbrowningofA.trifoliate
处理 接种愈伤组织数 褐化愈伤组织数 褐化率
CK 30 11 36.7
AC 30 5 16.7
PVP 30 7 23.3
　　　　　　　　　　注:MS+6-BA1.0+2, 4-D1.0;培养 40d进行数据统计.
　　在培养基中分别添加 lg/L的活性炭和 lg/LPVP,可以使愈伤组织的褐化率由 36.7%分别降低到
16.7%和 23.3%;并且观测到 ,加入活性炭和 PVP后 ,培养基变色部分的范围变小 ,褐化物出现的时间也较
迟(见图 1:F, G).
3　结果与讨论
3.1　愈伤组织的诱导
在旺盛生长期获取的幼嫩叶片可以在附加植物激素 6-BA1.0 mg/L+2, 4-D1.0mg/L的 MS培养基
上以较高频率诱导出愈伤组织 ,诱导率可达 92.7%.由不同激素组合对愈伤组织的诱导结果可以看出 ,
2, 4-D对白簕伤组织诱导的效果显著 ,低浓度的 NAA却抑制愈伤组织的诱导.由不同培养条件对愈伤组织
的诱导结果可以看出 ,光暗交替培养最佳;糖含量以 30g/L为宜 、过高会对愈伤组织的形成产生抑制作用;盐
浓度以 1 /2MS或 MS为好 , 2MS会显著抑制愈伤组织的形成;pH值在以上因素均已确定的前提下 ,以 6.0
为宜.在白簕愈伤组织诱导过程中不同激素浓度和培养条件的筛选为白簕大规模的细胞培养和次生代谢物
的提取打下了较好的基础.
3.2　愈伤组织的褐化
白簕愈伤组织的诱导与增殖过程中 ,如果培养方法不恰当 ,会出现严重的褐化现象 ,从而影响愈伤组织
268　 西华师范大学学报(自然科学版) 2008年
的生长 ,甚至使愈伤组织受毒害而死亡 ,但作为药用植物 , 应尽可能避免使用过多的化学药剂 , 以免影响其
药效.由于植物生长物质是组培中不可缺少的因素 , 因此在白簕组培中 , 探索合理的植物生长物质种类及
配比 , 以期在调控生长的同时 , 也能对褐化起到较好的抑制作用.梅兴国等认为的液体悬浮培养有助于减
轻褐化 [ 13] ,而本试验表明 ,采用固体培养和调节不同激素浓度及配比对防止愈伤组织的褐化效果明显;在增
殖培养过程中 ,在培养基中添加活性炭或 PVP,对防止白簕愈伤组织的褐化也有较好的效果.
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WANGXiao, LIYun-xiang, ZHOULi-juan, YUA-mei
(ColegeofLifeSciences, ChinaWestNormalUniversity, Nanchonghasbeen637002, China)
Abstract:AstudyoncalusinducementfromAcanthopanaxtrifoliate(L).Merexplantshasbeenconductedwith
diferentmediumsandhormones.TheoptimalexplantsforA.trifoliatetisueculturearetheleafandthecultureme-
diumsareMS+2 , 4-D1.0mg/L+6-BA1.0mg/Lwhichinducementrateis92.7%.Duringsubculture, the
solidmediumhasbeenprovedtobethebestmediumsforanti-browningofcalus.Addinglg/Lactivatedcarbon
and1g/LPVP, thatefecthasalsobeenfound.
Keywords:Acanthopanaxtrifoliate(L).Mer;calus;explants;browning