全 文 ：植 物 学 报 1 9 9一 , 3 3 ( 7 ) : 5 4 7一 5 5 1
滩 c亡。 刀。 t a n 犷。 a 5 1月艺e a
野火球悬浮培养细胞原生
质体再生植株 *
赵桂兰 罗希明 刘颜芝
(吉林省农 科院大豆所 , 公 主岭 13 6 1 0 0 )
摘 要
野火球 ( T犷ij 。 “ 二 。 场户 , 。 , ; 。 , L ) 下胚袖悬浮培养如抱在 S L Z 毯本培养基附户I n A .0 1
。 g厂L 、 毒芳定 ( p ic l o r o l ) 0 . 06 m g / L 中继代 3 、一 4 个月后 , 用继代后 3 天的悬浮细胞分离
原生质体 。 在改良的 抑 培养基上培养 3 天后开始第一次分裂 ; 培养一个月产生小愈伤组织 。
待愈伤组织长至 Zm m 时 ,转至第一分化培养基 A上分化出黄绿色 、 颗粒状的愈伤组织 ,转人液
体悬浮培养继代 。 再转人第二分化培养基 B 上 , 半月后诱导出芽 , 芽的 分 化 率 为 1 3 . 6一
2 1
.
0% o
关键词
苗长至 3 o m 高时 , 转入生根培养基 ,再生小植株 。
野火球 ; 原生质体 ; 植株再生
P L A N T R E G E N E R A T ! O N Q F P R O T O P L A S T S O F T R I F O L I 以M
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A b s t r a e t
T h i s p o p e r d e a ls w it h r e g e n e r a r i o n o f p r o 赴。〕p l a s t 、 i n c e l l s u s p e n s i o n e u l t 、 l r e s o f t l y P o e o t ll l
f r o m 丁r ; j o l ; “ m l o P了二 a 、才e r L . o n t h e s [ : b a o a l n l e d i t ,m w i t h B A 0 . 1 m g / L a n d p io l o r a 、二
。 . 0 6 m g / L f o r 3一斗 m o , l t hs . T h e ! ) r 〔 , t o p l a s t s 二 , e r e i、 o l a t e d f r o m s u s p e n s i o n s e e l l s o u 匕e u l之t ; r e d
l o r 3 d a y s a n d w e r e r e e t ] l t u r c d i n m o d i f i e d ! i g u id m e d i u m s p
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T h e f i r o t d iv i s i o n o f th e r e g e n e
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n a k e d e y e s by o n e m o n t h
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.
K e丁 w o z· d s T r i f o/ 艺, ,。 l、 Pi二 、 、 , : , , P : o t o p l a s r ; p l a n t ,二 g e n e r a r i o n
野火球 (了 ; 讨口 il : 哪 知户an s : 君 : L . ) 是豆科三叶草属 。 据报道已从三叶草属组织培
养凶 、 叶肉细胞 ` , ,sl 的原生质体分别获得愈伤组织 、植株 。 本文初步报道野火球原生质体培
本文于 1 9 8 , 年 10 月收到 , 1 9 9。 年 1 月收到修改稿 。
* 农业部重点研究课题 。
植 物 学 报 3 3 卷
养再生植株 。
材 料 和 方 法
(一 ) 材料
1
. 无菌苗生长 野火球种子具有厚且硬的种皮 。 接种前必须通过发烟硫酸 ( H ZS q +
5 0
,
) 特殊处理 30 分钟 (其作用可以消毒和促使种皮破裂 , 提高种子萌发能力 ) 。 再用无
菌水冲洗 4 次 , 接种到不加任何激素的 S G L 固体培养基上 。 培养基成分为 (m g / )L :
N 玉I、 N O 3 10 0 , K N O 3 2 10 , K H z P O ; 3 2 . 5 , N a H z P q . H : 0 8 . 5 , M g S O 、 . 7 H z O 4 3 . 5 , C o C I: ·
2 H
2 0 4 3
.
8 , E D T A 2
.
8 , v B : 0
.
5 , v B 6 o
.
1 2 5 , 肌醇 6 2 . 5。 蔗糖 1 09 / L , 琼脂 6 9 / L , p H 6 . o 。
2
. 建立下胚轴悬浮细胞系 待无菌苗长至 4c m 时 , 将下胚轴切段接在 L Z〔6] 附加 2 ,
4一 D 2
.
o m g / L
、
B A O
.
s m g / L 培养基上 。 取下胚轴诱导 出的浅黄色 、 疏松愈伤组织 , 鲜重
4 9 放人 l o o m l 的三角瓶中 , 加人 2 5 , n l 的 S L Z 〔7 , 附加 B A o . l m g / L + 毒萎定 o . 0 6 m g / L
培养基 。 在温度 2 4一 26 ℃ 、 散射光和转速 1” rP m 的条件下进行悬浮培养 。 每 7 天继代
一次 。
(二 ) 原生质体分离
1
. 下胚轴悬浮细胞分离原生质体 悬浮培养 3一 4个月后 , 得到小而椭圆形细胞 ,细
胞质浓密 , 均匀一致 , 乳 白色 , 多数由 3一 6 个细胞组成的细胞团。 取继代 3天的培养物
2 9 移人通过微孔滤器 (孔径 。 . 4 5 户 m ) 过滤灭菌的 10 m l E M 一 7 2[J 酶混合液中分离原生质
体 , 分离条件 : 2 6℃ 、 5 0 r p m 、 暗处 ,酶解 6 小时 。
2
. 子叶分离原生质体 取 6一 9 日龄无菌苗的黄色和绿色子叶 切成薄片 , 置于 C Pw
13 M 8[J 液中质壁分离 1小时 , 放人含有 2 . 0多 纤维素酶 O on z u k a R一 10 ; 0 . 8多 离析酶
M a e o
r o : y m e R
一 1 0 的 C p W g M 〔S J 液或 E M 一 7 酶液中 ,酶解 17一 2 4 小时 。 酶解后经 4 0 0
目尼龙网过滤 , 离心 ( 10 0 0 r p m , 3 分钟 ) 。 然后吸出上清液 , 将下沉的原生质体悬浮在
2 1多 蔗糖溶液 ( p H S . 8一 6 . 0) 中 , 再用同样速度离心 3 分钟 (纯化后的原生质体在离心管
的界而上呈一条带 ,用滴管吸出后 ,再用 C P W g M 洗二次 ,最后用 K s p 〔10J 原生质体培养
基洗一次 。
(三 ) 原生质体培养
用 K s p 原生质体以 2一 5 x l少个原生质体 /m l 密度 , 吸原生质体悬浮液 0 . 2一 0 . 5
m l 为一小滴滴到 60 x 15 m m F al co n 培养皿内 ,每皿 3一 5 滴 。 群体密度不应少于 l x
1少个原生质体 /m l 。 悬浮培养细胞原生质体 (图 l) 在 24 一 26 ℃ 、 黑暗条件下 ; 子叶原生
质体在弱光 ( 5 0 o l x ) 条件下静置培养。 10 天后统计分裂频率 ,添加 C s p 4[] 培养基 。 当再
生细胞发育到小愈伤组织后 , 将小愈伤组织转移到液体 /固体双层 〔1]培养基 (在 60 火 巧
m m 玻璃培养皿中先倒人 C s p 固体培养基 , 待培养基凝固后 , 将小愈伤组织用吸管移人
固体平板上 ,再轻轻置人 1 . s m l 的 C s p 液休培养基中增殖 。
(四 ) 植株再生
当悬浮培养细胞再生的愈伤组织增殖到 Zm m 大小时 , 转至含有不同激素的第一分化
培养基的 l 号培养基 ( m g / L ) ( L , 十 B A I . 0 十 K T I . 0 + N A A O . 2 + 毒荞定 0 . 06 十 生物
素 0 . 5 ) 、 H 号培养基 ( m g / L ) ( L : 十 B A O. 7 十 Z T o . 2 十 N A A O. 2 十 毒秀定 0 . 0 6 十 生物
, 期 赵桂兰等 : 野火球悬浮培养细胞原生质休再生植株
素 0 . 2 ) 、 111号培养基 (m g八 J ) ( L Z + Z T O. 3 + N A A O . 5 + 毒萎定 0 . 0 4 )上 , 置于光照培
养箱 ( 25 土 1℃ , 2 0 0 h , 每天光照 12 小时 )中 。 培养 20 多天后分化出多种类型的愈伤
组织 。 将不同类型的愈伤组织转人改良的 M S ( M S 无机盐 + B S 有机成分+ 谷氨酸胺
4 0 m g / L 十 3 . 0务 蔗糖 , p H .6 0 , K N O , 提高到 3 0 0 0 m g / L ) 不加任何激素的液体培养
基上再次悬浮培养 ( 1知 rP m , 24 一 2 6℃ , 室内散射光照 , 每 日 12 小时 ) ,每 10 天 继代一
次 , 继代 3 次后 , 再将 3 种类型的愈伤组织转移到第二分化培养基 (① M S 无机盐 + B 、 有
机成分 十 K T .O 3 m g / L + Z T O . 3 m g八 十 N A A O . 2 m g / l 萨三 ② M S 十 K T O . 3 m g / L + z T
o
.
3 m g / L + N A A o
.
Zm g / I
沙
; ③ 改良 L Z ( K N O 3 3 0 0 o m g / L + N H ; N O 3 8 0 0 m g / L + C a C I: ·
2 H 2 0 4 0 m g / L 十 M g S O 。 · 7 H : O 4 0 m g / L 十 谷氨酞胺 4 0 m g / L 十 L Z 微量元素 + B 。 有
机成分 十 2 . 5多 蔗糖 ) + B A O . 7 m g / L 十 N A A O . 2 m g / ;L ④ L Z + B A O . 7 m g / L 十 N A A
.0 2 m创 L ) 上分化成植株 。
结 果 和 讨 论
(一 ) 绿色子叶适合原生质体培养
将暗处培养的黄色子叶和光下培养的绿色子叶原生质体进行对比 , 结果表明 : 绿色
子叶的原生质体再生细胞能连续分裂形成细胞团 ; 而黄色子叶原生质体在同样培养条件
下未见分裂 , 最后解体 、死亡 。 多次试验结果一致 , 这可能是本试验未找到适合黄色子叶
原生质体培养条件 。
(二 ) 取材 日龄对原生质体产盘的影响
原生质体的产量与取材 日龄有直接关系 。 6一 9 日龄绿色子叶 19 鲜重和继代后第 3
天悬浮培养细胞 10 0 m g 鲜重分别放人 10 m l 酶液 , 约获得 6 . 0 x 10 5个原生质体 。 而 10
日龄以上子叶和 4 日龄 以上的悬浮培养细胞原生质体产量急剧下降 。
(三 ) 原生质体的分裂及培养
上述两种外植体的原生质体培养 3 天后开始第一次分裂 (图 2 ) , 多数原生质体的再
生细胞进人第一次分裂的时间是在培养的第 5 天到第 6 天 ; 7一 10 天后有 1 , 务再生细胞
进行第二次分裂 (图 3 ) 。 培养 15 天后再生细胞进行多次分裂 (图 4 )。 来源于悬浮培养
细胞的原生质体再生细胞的分裂频率为 30 一 40 界 ; 子叶为 10 一 20 沁。 在附加 。 l m斟 L
2 , -4 D
、
0
.
2 m g / L z T
、
1
.
0 m g / L N A A 的 C s p 液体培养基中作微滴培养 ,分裂能持续进行 。
添加液体培养基 , 每次加 。 . 5一 I Om l ,每隔 7一 8 天加液一次 , 共加液 3 次 。 培养 3 周后形
成十几个细胞组成的细胞 团 , 一个月左右再生细胞发育到肉眼可见的小愈伤组织 (图 苏) 。
如用浅层培养 , 原生质体再生细胞发育到 肉眼可见小愈伤组织阶段可不加液 , 再生细饱也
能持续分裂。 这时将小愈伤组织适时地转移到含 一有 3 . 0多 蔗糖 、 0 . 2 多 g e ilr et 的 c s p 双
层培养基上 ,很快地发育到 Zm m 大小愈伤组织 。
( 四 ) 愈伤组织及苗的分化
将增殖至 Zm m 大小的愈伤组织分别转移到第一分化培养基的 I , 1 , 川 培养基上 , 25
天后诱导出 3 种不同类型的愈伤组织 : I 号培养基愈伤组织呈深绿 、致密 、小圆球状 ; H 号
培养基愈伤组织呈黄绿 、 较致密 、 颗粒状 ;l 1 号培养基愈伤组织呈黄色 、疏松 、 大块松散
状 。 1 培养基上形成的愈伤组织能够诱导分化出芽 (图 6 ) , 但未能发育成苗 ,长成植株 。
5 5 0 植 物 学 报 3 3 卷
而 1、 川 培养基上诱导的愈伤组织未能分化出芽 。 将上述三种类型的愈伤组织转移到改
良的 M S 液体培养基上再次悬浮培养 , 继代 3 次后再将 3 种类型的愈伤组织转移到第二
分化培养基上 , 15 夭后从 1 号类型的愈伤组织上分化出芽 (图 7 ) 。 芽的诱导率为 13 卜 l一
21
. 。多。 经过调整的 M S 、 L: 两个改良培养基附加不 同组合激素 , 对芽的分化有一定的作
用 。
图 1 野火球悬浮细胞分离的原生质体 。 又 4 0 图 2 原生质体再生细抱第一次分裂 。 火 6 0
图 3 、 4 原生质体再生细胞第二 、三次分裂 。 丫 6 0 图 , 再生细胞团 。 只 ` 0 图 6 、 7 再生
的不定芽 。 图 S 、 , 再生植株
F 19
.
1 F r o s h ly i s o l a t e d p r o t o P l a 、 t s f r o m s u , P e n ` i o n e e l l s o f T r i f o l犷“ 拼 l o P i , a s r e r .
火 4 0 0 F i g . 2 F i r s t d i v i s i o n o f r e g e n e r a t i o n e e l l s f r o m p r o t o p l a s t s x 6 0 0 F i g s . 3 ,峪
T h e s e e o n d
王t ll t l t h i r d d i v i s i o n o f r e g e n e r a t i o n e e l l s f r o m P r o t o P l a s t s
. 只 6 0 0 F i g . 5
R e g e n e r a r i o n c a l l u s c o lo n y
. 火 6 00 F i g s . 6 . 7 D i f f e r e n r i a t e d s h o o t . F i g s . 8 , , R e·
g e n e r a t e d s e e d l i n g a n d P l a o t l e t s
待分化出不定芽后 , 将其转移到壮苗培养基 ( M S 十
芽打}
组织
3 )
0
茎 氏叶 , 发育成苗 。 苗分化率为 6 . 0 外。
补 ( BI A O . Zm g / L 十 BA O . l m g / L )使
当小苗长至 3。 m 高时 , 切去周围相连的愈伤
, 将小苗插人生根培养基 ( 1 / ZM S 十 BI A O. Zm g / L ) 。 半月后 即长出粗壮的根系 (图
生根率达 70 % 以上 。 有的再生植株已移入土中 , 生长良好 (图 9 ) ,并开花结实 。
, 期 赵桂兰等 : 野火球悬浮培养细胞原生质体再生植株
王光远 、夏镇澳 , 19 8:0 从黄花烟草叶肉细胞原生质体再生植株 。 植物生理学报 , :6 1 27 一 13 1。
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7 7 2
0
Ah u ja
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B
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C
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C o o c k i n g a n d M
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D a v e y , 19 8 3 : A n a s s e s s m e n r
o f r h e e u l t u r
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l e a p a b il i t i e ,
o f T r犷j o l i u形 r e P e o s L . ( w h i r e c l o v e r ) a n d o , o r 犷人, , c i i扩d i a S c o p . ( s a i n f o i n ) m e s o p hv l l p r o t o p l a s t s . P l a , r
C e l l R沙P
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2 : 2 6 9一 2 7 2 .
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B
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, 19 8 4
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P l a n t r
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P l a 刀 t S c i
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L e z , 3 7 : 16 5一 17 0 .
M a五e s w a r a n , G . a n d E . G , W i l l i a m a , 19 8 6 : C l o n a l p r o P a g a t i o n o f 丁 , i fo zi “ 解 P r 。 , e n ` e , T . r e s 。 夕i 称 a z “ 形 a n d
了. 了“ b t日 r r a n 心匆 m b y d i r e e t s o xn a t i c e m b r y o g e n e s i s o n e u l t u r e d i mm a t u r e e m b r y o s . P l a n 名 C e l l R e P , 3 : 16 ,一
16 8
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P hi l l i P
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B
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C o l l i n s
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19 7 9
: I刃 别 i ; r o t i s s u e e u l t u r e o f s e l e c t e d l e g u m e s a n d Pl a n t r e g e n e r a t i o n
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C r o P 占c i . , 1 9 : 5 9一6 4 .
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e l l s u s p e n s i
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, 2 0 : 32 3一 3 2 6 .
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