全 文 ：茶 叶 科 学1 9 9 2 , 1 2 ( 1 ) , 4 5一 4 5
J
。
T e a S e i
。
茶树 新 梢 内源 细胞 分 裂素 的
尾穗览生物鉴定法及应用
董德贤` 王 `镇恒“ 费达云 “ 韦小圈“
( 1 华 中农业大学林学系 , 武汉 )
( 2 安徽农学 院茶业系, 合肥 )
( 3 广西玉林地 区土产公司 , 玉林 )
摘 要 一
改进了测定茶树新梢内源细胞分裂素 ( C y ot ik in s , C T K )的尾穗觅生物鉴定法 ,结果表明 ,采
用甲醇浸提 ,石油醚 、 乙酸乙醋和正丁醇萃取 , 73 2离子交换纯化的方法是可行的 , Z ea it (n 主米素 )
溶液的平均回收率达 82 . 邹% , 条叶中的生物碱 、 茶多酚和氨基酸不影响觅红素的合成反应 。 它与
其他生物鉴定法比较 ,具有简便 、 灵敏 、 专一性强的优点。 应用该法测定了黄叶早春梢芽 、 叶、 茎
中的C T K含量 , 并进行了讨论 。
关俄词 : 细胞分裂素 , ,生物鉴定法 , 尾穗览 , 览红素合成法
茶内源细胞分裂素 ( C y t o k i n i s , C T K )
的测定 , 津志田藤二郎等 [’ , “ 1曾采用黄瓜子
叶的生物鉴定法 , 该方法育苗时间长 (达 1右8
小时 ) , 实验操作繁锁 , 误差较大 , aM p T B。 -“ m BH ” .H .3 s1[ 采 用 览菜色素合成法 ,
但览菜种子种壳难剥离 , 且黄化苗不磨碎红
色素便不能全部浸出而影响测定结果 。 尾穗
览 ( A m a , a n蓄h: 5 c a u d a t o s L . ) 是一种览科观
赏植物 , 幼苗见光后能合成览红素 ( B et a c y -
a n i n )
, 黄化苗在供给 C T K 和 络 氨酸的条
件下 , 子叶也能合成览红素 , 览红素只需反复
冰冻 , 便可全部浸出进行比色测定 , 育苗时间
仅为 76 小时 。 因此 , 览红素合成法较其他生
物鉴定法简便 、 灵敏 , 且不受茶多酚 、 生物
碱、 茶氨酸等干扰 , 比目前的仪器鉴定法成
本低 。 现将结果报告如下 。
文稿收到 日期 : 1 9 91一 0 9一2 3
修改稿收到 日期 : 19 9 1一 1 2一 0 2
方 法
(一 ) C T K 的提取分离纯化 [’1
在规定时间内摘取所需测定芽叶 , 尽快
统计数量 ; 称重 , 封入聚乙烯薄膜袋 , 放入
一 30 ℃冰箱中快速冰冻贮存待用 。 将研钵及
甲醇放入 。 ℃左右冰箱中冷却 , 快速称样 ,
冰浴条件下 , 加甲醇及少量石英砂将样品磨
碎 , 转入三角瓶中 , 甲醇与样品之比为小 1 ,
置 。 ℃冰箱中浸提过夜 , 抽滤 。 ` 残渣连同剪
碎的滤纸 , 加入冷却过的80 %甲醇 (:5 1) 浸
提12 小时 2 次 , 抽滤。 合并滤液 , 在 40 ℃下
减压浓缩至 约 为 原体 积 的一半 , 用 ( 30 一
60 ℃ )石油醚 (1 : 1) 萃取色素 3 次 , 石油醚相
弃去 , 甲醇液于 40 ℃ 减压 浓缩成水液 , 用
I N H C I调 P H 2 . 8 , 用乙酸乙醋 ( 1 , 1 )萃取
46 茶 叶 科 学
3 次 , 乙酸乙醋相弃去 , 将水相中遗留的乙
酸乙醋减压蒸掉 , 调 p H 2 . 8 , 上 73 2阳离子
交换柱 ( 7 3 2 树脂分 别 用 1 N N a 0 H 和 I N
H cl 处理 , 并分别水洗至近中性 , 装入树脂
高 2 0 e m , 柱径 2 . 0 e m , 重 蒸 水平衡 i 小
时 ) 。 先用 1 2 0 m l 重蒸水洗 , 后用3 0 0 m l 3 N
N H
一
O H洗脱 , 流速 o . s m l/ m in , 洗脱液于
7 0℃下减压浓缩至约 1 0 0 m l。 1 N H C I调 P H
8
.
0 , 用水饱和正丁醇 ( 1 : l )萃取 3次 , 正丁醇
相 70 ℃减压浓缩至 约 15 m l , 转移至梨形减
压蒸馏瓶中蒸千 , 加 0 . 40 m l 20 % 甲醇 溶
解 , 贮于 O ℃冰箱 。 此 液为 C T K 粗提液 。
(二 ) C T K 的尾抽览鉴定 [“ 1
选出成熟度较高 (暗红色 , 粒较大 ) 、 大
小相近的尾穗览种子 , 置低温冰箱中进行 3
个月的低温处理 , 以打破休眠 。 取此种子用
饱和漂白粉溶液灭菌 10 分钟 , 冲洗后 , 播于
培养皿中的湿滤纸上 , 在 25 ℃培养箱中发芽
76 小时 (注意避免阳光 ) 。 在直 径为 7 c m 的
培养皿中放一张滤纸 , 用已配制的 1 p p m 或
20 0 p p m标准 Z e a t又n (玉米素 )溶液 , 加 0 . 4%
酪氨酸一 1 / 7 5 摩磷酸缓冲液 , 配 制 成不同
浓度的标准溶液 3 m l于培养皿中 , 用 于 测
定标准曲线 。 取 40 时 C T K 粗1提 液 , 加 缓
冲液 2 . 96 m l 。 设重复 4 次。 选取子 叶大小
均一的尾穗览黄化苗 , 剪取子叶和一部分胚
轴 , 放入 已加 3 m l检测液的培养皿 中 , 每
皿 30 枚 , 操作在微弱绿光的暗室中进行 。 培
养皿在25 ℃黑暗中放置 1 8小时 , 取出幼苗切
段 , 略洗涤后放于滤纸上吸去多余水分 。 移
入盛有 4 m l 重蒸水的有塞试管中 , 放 置 于
一 20 ℃冰箱中冰冻过夜 , 取出后暗中融化 2
小时 。 反复冰冻 2 次 , 倒出红色上清液 , 用
7 2 1分光光度计在 5 4 2 n m 和 6 2 0 n m 波长下
测光密度 (觉红素在 5 42 n m 有最大吸收值 ,
6 2 0 n m 有最小吸收值 , 测 定 6 2 0 n m 下 的
吸收值即为溶液的浊度 , 减去此值后代表览
红素的光密度 ) 。 从标准曲线上得出 C T K 浓
度值 , 折算成单 位 干 重 的 C T K 含量 。 采
用添加法测定提取分离纯化及生物鉴定的回
收率 , 具体方法是 : 取 2 份同样样品 , 一份
中加入一定量的标准 Z ea t i n 溶 液 , 另一份
作对照 , 同时同条件进行纯化鉴定 , 两测定
值之差代表所加标样的实测值 , 此值与所加
标样量之比即为回收率 。
结果与分析
( 一 ) 提取分离及生物鉴定法的可靠性
单一提纯 C T K , 一般选进材 料的黄化
处理 , 样品经醇提取后 , 直接上离子交换柱分
离纯化 , 再用正丁醇萃取并浓缩成粗提液 I毛 ]。
针对茶树叶片醋溶性色素 、 多酚类和生物碱
等物质含量丰富的特点 , 本研究增加了石油
醚 、 乙酸乙醋萃取两个纯化步骤 , 且萃取 3
次 , 以除去大部分这类物质。效果是明显的 ,
经过此处理后再上柱 , 上柱前样液颜色已较
浅 , 过柱后的样液基本为无色透明溶液 。 而
不经过此两步纯化 , 醇提取液为墨绿色 , 过
柱后的样液为浅绿色。 王世平 〔。 1测定了甲醇
浸提 , 石油醚 、 乙酸乙醋正丁醇萃取的 C T K
的回收率 , 结果均在90 %以上 。 较高的回收
率为此法的可行性提供了直接证据 。
l
。
73 2柱的洗脱曲线及回收率的刚定
离子交换柱可 采用 7 32 柱或 D o w e x 50
柱。 本实验采 用 7 3 2 柱 , 用 2 0 0 P P m 标 准
Z e at in 溶液 3 m l , 代替上柱样液 , 在同 样条
件下进行离子交换洗脱 , 收集洗脱液 , 每管
约 4 m l 。 在 7 5 1G分光光度计 2 7 o n m 波 长
下检测吸光度 , 同时量洗脱液体积 , 测定回
收率为 9 3 . 2 8 % 。 从图 1上看出 , 洗脱完全 ,
出峰早且快 , 峰形较窄 , 说 明 7 32 柱 纯 化
C T K 是基本可行的。
2
。 咖啡减 、 多酚类 、 茶氛酸对尾穗觅觅
红素合成法的影响
据报道 〔` ] , 览红素合成法专一性极强 ,
腺普 、 腺嗓吟、 胞普、 胞吻咤、 鸟普、 鸟嘿
1 9 9 2
,
1 2 ( 1 )
3
.
Z e at in 回收率测 定结果
方法是否 可行 , 主要表现回收率的高低
和稳定性。 通过览红素合成法测定 , 回收率
的测定结果见表 1 。 从表中可看出 , 除第 3、
6 次外 , 其它数字很接近 , 而且回收率较高 ,
平均为 82 . 26 % 。 因为提取纯化鉴定涉及的操
作步骤较多 , 主要通过溶剂分配 , 虽每步能
有90 % 以上回收率 , 但总的回收率能达 80 %
以上 , 结果比较理想 , 说明该法是可行的 。
裹 1 Z . at in 回收率的洲定
T a b! e 1 R e e o v e r i e , o f z e a t i n
ē明口代)
测定次数
T r e a t n u m b
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测定值 (% )
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e s u l t
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日 1 Z e a t in 的73 2柱洗脱曲线田
F 19
.
I E巨u t i o n P r o f i le o f z e a t i n
5 t a n d a r d o n c o l u m n 7 3 2
吟 、 尿普 、 尿吻吮 、 胸腺嗜吮 、 色氨酸 、 叫
噪乙酸、 赤霉素 、 脱落酸 、 二苯脉 、 C C C 、
A M O
, . , : 、 福斯方一 D 、 B 。 等 都 不能促进览
红素的合成 。 茶树与其它植物相 比 , 其体内
的生物碱 、 多酚类 、茶氨酸较其它植物丰富 ,
为此测定了这些物质对览红素合 成法 的 影
响 。茶叶中生物碱由茶鲜叶经千馏升华制得 。
茶叶中多酚类由茶鲜叶经乙醇一氯仿一乙酸
乙醋一干燥制得。 茶氨酸用 0 . 02 摩 H cl 配
制成 l m摩茶氨酸母液 , 再用前述缓冲液稀
释 。 以上 3 种成分均用览红素合成法鉴定 。
在鉴定中分成两组 , 一组加标 准 Z e at in 溶
液 , 浓度为 。 . 01 p p m , 另一组不加标样 。 鉴
定结果表明 , 咖啡碱 、 茶叶中的生物碱 、 多酚
类和茶氨酸均不影响览红素的合成反应 , 既
无促进作用 , 也无抑制 反 应 。 10 p p m 生物
碱处理的吸收值下降。 . 005 A bs , 此生物碱浓
度为 Z e at i n 浓度的 10 0 0倍 , 故 此下降值可
忽略不计 。
( 二 ) 应用
用尾穗览法分别测定了黄叶早品种春梢
中的 C T K 含量 , 结果表明 , 一芽二叶新梢
的芽 、 一叶 、 二叶 、 茎和整个新梢中的 C T K
含量分别为 1 3 8 . 2 、 4 9 。 8 、 3 5 . 9 、 1 8 0 。 O、 6 8 . 0
(陪k/ g · d w ) , 一芽三叶新梢 的芽 、 一叶 、
二叶 、 三叶、 茎和整个新梢 分 别 为 59 . 5、
1 7
。
3
、
1 3
。
4
、
1 2
。
7
、
3 4
。
7和 1 8 . 6 (协g / k g 一 d w ) ,
表现为随嫩度而下降。 但一芽二叶新梢中的
C T K 茎中含量明显高于嫩叶及芽 , 其原 因
之一是茎本身生长的需要 , 其二是芽所需要
的 C T K 必须通过嫩茎才能从根 部 运 输 到
芽 [` ] , 到了一芽三叶 , 嫩茎及芽叶逐渐木质
化 , 重量增加 , C T K 的含量相对下降。
茶树内源激素由于修剪 、 采摘等人为干
预除去了顶端优势后 , 必然会引起体内的重
新分布 , 在茶树生理代谢上将起着怎样的调
控作用 , 这些都有待进一步研究。
4 8 茶 叶 科 学
参 考 文 献
〔1 〕 津志田藤二郎等: 于卞 仍廿 才 卜力 才 二样物质 O
检出之茶冀刃熟度 , l乙伴了变勤 , 《茶类研究银
告》 , 1马8 1 , 5连 t 59一石5
〔 2 〕 津志田滕二郎等 : 千卞 O 根亿招分为廿 才 卜力 才
二 夕活性O 变勤七壬O 分雕 , 《茶集研究抓告》 ,
1 9 8 2
,
5 5 . 3 7一4 2
〔 3 」M a p r a e刀 a m a 万刀皿 11 . 3 . (王立译 ) : 茶树新梢
中细胞分裂素的动 态 , 《国外农学— 茶叶》 ,
1 9 8 6 ( 4 )
, 1 6一 1 7
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《植物生理学通讯 》 , 1 9 7 9 ( 2 ) : 2 7一 3。
〔 5 〕 N . L . B i d d i n g t o n e t a l* A M o d i f i e d
Am
a r a n t h u s B e t a e y a n i n B io a s s a y f o r t h e
R a p id D
e t e r m i n a t i o n o f C y t o k i n i n s i n
P l a n t E x t r a e t s
.
P l a n t a (B e r l ) 1 9 7 3
,
1 1 1
:
1 8 3一 1 8 6
〔 6 〕 王世平等 : 四种植物激素的分离和纯化 , 《植 物
生理学通讯》 , 1 98 7 ( 5 ) : 4 8一 5 1
Am a r a n th u S B i o a s s a y o f E n d o g e n o u s C y t o k i n in S
i n T e a Sh o o t s
`
D o n g D e x i a n
“
W
a n g Z h e n h e n g
Z
F e i D a y u n
“
W e i X i a o q u a n
( I D e p a r t n l e n t o f F o r e s t r y
,
C e n t r a l C h i n a A g r i e u l t u移 1 U n i vc r s i t y , W u h a n )
( : D叩 a r t m e n t 。 f T e 。 s e s e n e e , A n h u i 八 g r i e u 一t u儿一 e 。 l ze g e , : ae f e i ,
( 3 G 一, a n g x i Y u li n N a t i v e P r o d u e t s l
·
t d
.
,
Y u li n )
Su m m a r y
,
W i t h q
u a n t i f i e a t i o n o f e n do g e n o u s e y t o k i n i n s ( C T K ) i n b u d
, t e n d e r
s t e m a n d t e n d e r l e a f
, t h e m e t h o d s o n e x t r a e t i o n
,
P u r i f i e a t i o n a n d b i o a s s a y
w e r e f o e u s s e d
。
R e s u l t s s h o w e d t h a t t h e m e t ho d o f e x t r a e t i n g w i t h m e t h a n o l
,
P a r t i t i o n i n g w i t h P e t or l e u m e t h e r
, e t h y l a e e t a t e a n d -n bu t a n o l r e s P e e t i v e ly
,
s e P a r a t i n g w i t h 7 3 2 e a t i o n e x e h a n g e r e s i n w a s r e l i a b l e
.
C o m p a r e d w i t h
hC l
o r o P h y l l F o r m a t io n i n e t i o l a t e d e u e u m b e r e o t y l ed o n o r B e t a e y a n i n
B i o a s s a y o f o t h e r A m a r a n t h u 3 p l a n t s
,
B e t a e y a n i n B i o a s s a y o f A m a r a n t h u s
C a u d a t e s
。
L
.
w a s s im P l e r
,
r 。。 r e s e n 3 i t i v e a n d mo
r e s P e e i a l i
z e d
。
A t
“ o n e
b ud a n d two l
e a v e s s P r o u t i n g s t a g e i n s P r i n g
,
h ig h C T K l e v e l i n t e n d e r
s t e m s w a s o b s e r v e d
。
A s t h e s ho o t s m a t u r de
,
t h e C T K l e v e l i n t h e s t e m s
d r o P P e d m o r e r a P id ly t h a n i n t h e bdu s a n d i n t h e l e a v e s
.
K e y w o r d , : C y t o k i n i n 3
,
B i o a s s a y m e t h o d
,
A m a r a n t h u s
,
A m a r a n t h u s
b io a s s a y