全 文 ：书第 34 卷 第 1 期 深圳大学学报理工版 Vol. 34 No. 1
2017 年 1 月 JOUＲNAL OF SHENZHEN UNIVEＲSITY SCIENCE AND EN
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GINEEＲING Jan. 2017
Ｒeceived:2016-07-07;Accepted:2016-07-12
Foundation:Postdoctoral Science Foundation of China (2015M572370)
 Corresponding author:Chief physician Li Yuzhen． E-mail:695768596@qq.com;
Postdoctoral Ding Liping． E-mail:13552432187@163.com
Citation:Li Li，Li Yuzhen，Ding Liping，et al． Effect of Incarvillea caffeate on mouse ear edema ［J］． Journal of Shenzhen
University Science and Engineering，2017，34(1):46-50．(in Chinese)
【生物工程 / Bioengineering】
角蒿咖啡酸酯对小鼠耳肿胀的抑制作用
黎 丽1，2，李玉珍2，丁利平1，黄 钟1
1)深圳大学医学部，广东深圳 518060;2)中山大学第八附属医院药学部，广东深圳 518033
摘 要:研究了角蒿咖啡酸酯((+)-2-(1-hydroxyl-4-oxocyclohexyl)ethyl caffeate，JH2)对花生四烯酸
(arachidonic acid，AA)致小鼠耳肿胀的抑制作用，探讨其作用机制，采用花生四烯酸诱导的小鼠急性耳肿
胀模型评价 JH2 的体内药效，通过酶联免疫吸附测定实验检测 JH2 对 AA 通路中 5-脂氧合酶 (5-
lipoxygenase，5-LOX)活性的影响． 实验结果显示，在 AA 诱导的小鼠耳肿胀模型中，JH2 能显著抑制 AA
所致的小鼠耳肿胀程度和组织蛋白渗出量，并降低小鼠发炎耳组织中白三烯 B4 (leukotrienes B4，LTB4)的
生成量． 体外活性研究显示，JH2 对 5-LOX有较强的抑制活性，半抑制浓度 IC50值为 12. 16 μmol /L． 说明
JH2 对 AA诱导的小鼠耳肿胀急性炎症具有抑制作用，其作用机制可能与 JH2 抑制 AA 通路中 5-LOX 的活
性从而降低炎症介质 LTB4 的产生有关．
关键词:药理学;耳肿胀;角蒿咖啡酸酯;花生四烯酸;5-脂氧酶;白三烯 B4
中图分类号:Ｒ 392 文献标志码:A doi:10． 3724 /SP． J． 1249． 2017． 01046
Effect of Incarvillea caffeate on mouse ear edema
Li Li1，2，Li Yuzhen2，Ding Liping1，and Huang Zhong1
1)School of Medicine，Shenzhen University，Shenzhen 518060，Guangdong Province，P． Ｒ． China
2)Department of Pharmacy，The Eighth Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Shenzhen 518033，
Guangdong Province，P． Ｒ． China
Abstract:We investigated the effect of Incarvillea caffeate ((+)-2-(1-hydroxyl-4-oxocyclohexyl)ethyl caffeate，
JH2)on arachidonic acid (AA)and its possible mechanism． We used AA-induced mouse acute ear edema model to
determine the effect of JH2 on in vivo． We also studied the effect of JH2 on the enzyme activities of 5-lipoxygenase
(5-LOX)by ELISA． The results showed that topical treatment with JH2 markedly inhibits the extent of oedema and
protein permeability． Importantly，leukotrienes B4(LTB4)production in ear mouse is also drastically suppressed by
JH2 and reaches a maximum inhibition rate of 87. 50% ． Activity assay in vitro showed that JH2 inhibits 5-LOX
activity with half maximal inhibitory concentration (IC50)of 12. 16 μmol /L． JH2 presents anti-inflammatory effect
on AA-induced mouse acute ear edema model through controlling the excessive production of LTB4 by inhibiting the
activity of 5-LOX．
Key words:pharmacology;ear edema;Incarvillea caffeate;arachidonic acid (AA);5-lipoxygenase (5-LOX) ;
leukotrienes B4(LTB4)
http:/ / journal．szu．edu．cn
第 1 期 黎 丽，等:角蒿咖啡酸酯对小鼠耳肿胀的抑制作用 47
紫葳科 (Bignoniaceae)角蒿属 (Incarvillea
Juss) 植 物 大 花 鸡 肉 参 Incarvillea mairei
var. granditlora (Wehrhahn)Grierson 的干燥全草，
在中国华南和西南地区被作为一种传统的民间药材
应用，具有抗炎镇痛、清热解毒和祛风除湿等功
效［1-2］． 目前，有关大花鸡肉参药材或原植物的植
物化学、药理学、化学生物学或生药学方面的详细
报道还很少见． 为研究大花鸡肉参的中医功效和生
物活性的物质基础，本文利用该种植物资源开发高
疗效、低毒副作用的新一类抗炎天然药物，从该植
物中分离得到的化合物(+)-2-(1-羟基-4-环己酮)
乙基咖啡酸酯［3］((+ )-2-(1-Hydroxyl-4-oxocyclo-
hexyl)ethyl caffeate，JH2) ，深入研究 JH2 对花生四
烯酸 (arachidonic acid，AA)诱导的小鼠耳肿胀的
抑制作用，初步探讨其作用机制，以对 JH2 的临床
研究提供科学依据．
1 材料与方法
1. 1 主要试剂与仪器
5-脂氧酶 (5-lipoxygenase，5-LOX)、脂氧化酶
抑制剂筛选试剂盒和白三烯 B4 (leukotrienes B4，
LTB4)酶联免疫吸附测定实验 (enzyme linked im-
munosorbent assay，ELISA)试剂盒均购自美国 Cay-
man 公司;伊文思蓝染料、丙酮、甲酰胺溶液、体
积分数为 10%的福尔马林溶液、苏木精-伊红 (he-
matoxylin-eosin staining，H＆E)染料、0. 22 μm 滤
膜、直径 6 mm打孔器和游标卡尺均购自深圳博兴
生物科技有限公司;Hettich 32Ｒ 离心机 (美国
Thermo Fisher Scientific 公司);ELx800 通用酶标仪
(美国 BioTek公司)．
1. 2 实验动物
雄性 ICＲ小鼠体质量为 18 ～ 20 g，购自南方医
科大学实验动物中心． 动物室温控制在 25 ℃左右，
可任意进食饮水． 遵循国际公认的实验动物使用规
范，科学、合理地进行动物实验．
1. 3 小鼠耳肿胀模型造模
根据文献［4-6］的方法，用磷酸缓冲盐溶液
(phosphate buffer saline，PBS)配制体积分数为
0. 5%的依文斯蓝溶液，用 0. 20 μm滤膜过滤除菌．
雄性 ICＲ小鼠 24 只随机分为 4 组，每组 6 只，分
别为模型组，给药高、中、低剂量组． 造模前，为
了测定蛋白渗出量，先将所有的实验小鼠尾静脉注
射 0. 20 mL依文斯蓝溶液． 依据分组，将所有实验
小鼠右耳耳廓正反两面涂抹 20. 0 μL 质量浓度分别
为 62. 50、125. 00 和 250. 00 mg /mL的 JH2，即实验
小鼠分组Ⅰ为模型组，Ⅱ为 JH2 低剂量组 (1. 25
mg /耳)，Ⅲ为 JH2 中剂量组 (2. 50 mg /耳)，Ⅳ为
JH2 高剂量组 (5. 00 mg /耳)． 30 min 后，将所有
小鼠右耳耳廓正反面涂 20. 00 μL AA(ρ (AA) =
100 mg /mL溶于丙酮)造模，1 h 后，擦除实验小
鼠耳朵残留物，检测小鼠的耳肿胀各项指标．
1. 4 耳肿胀度的测量
AA刺激 1 h 后，小鼠颈椎脱臼处死，剪下双
侧耳朵，用直径 6 mm 打孔器双侧同样位置打孔，
立即用电子天平称量耳片质量，且用游标卡尺测量
耳片厚度． 小鼠耳肿胀程度用每只小鼠同位置同面
积耳片的质量差(mＲ － mL)和厚度差(dＲ － dL)来评
价． 其中，mＲ和 dＲ为发炎右耳片的质量及厚度;mL
和 dL 为未发炎左耳片的质量及厚度．
1. 5 蛋白渗出量的检测
AA刺激 1 h 后，小鼠颈椎脱臼处死，剪下双
侧耳朵，用直径 6 mm 打孔器双侧同样位置打孔，
耳片放在对应的 EP 管中，加入 1 mL 酰胺，置于
55 ℃水浴中充分震荡 24 h后，在酶标仪 610 nm波
长处测量光密度值 (optical density，OD)，记作
D(610)． 耳组织染料渗出液的变化为 D(610)Ｒ －
D(610)L ．
1. 6 JH2 对小鼠肿胀耳片中 LTB4 含量测定
将耳片放在 EP 管中，液氮研碎，加入 500 μL
乙醇震荡混匀后 12 000 r /min离心取上清，用 LTB4
ELISA试剂盒检测 LTB4 的含量．
1. 7 组织病理学分析
先将小鼠耳片完整剪下，用体积分数为 10%的
福尔马林溶液固定． 耳片脱水后石蜡包埋，切片机
接近耳根部位切片，进行 H＆E 染色． 50 ×光学显
微镜下拍片，观察小鼠耳肿胀程度和炎症细胞浸润
聚集情况．
1. 8 JH2 对 5-LOX活性的影响
通过 ELISA 方法和脂氧化酶抑制剂筛选试剂
盒，测定 JH2 对 5-LOX 的酶活性的抑制作用强
弱［7］． 在 96 孔板内，空白对照组加入 50. 00 μL 反
应缓冲液，100%纯酶活性组加入 49. 50 μL 5-LOX
纯酶稀释液和 0. 50 μL 二甲基亚砜 (dimethyl
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48 深圳大学学报理工版 第 34 卷
sulfoxide，DMSO)，给药组加入 49. 50 μL 5-LOX 纯
酶稀释液和 0. 50 μL溶于 DMSO的 JH2 的溶液，使
JH2 的 终 浓 度 依 次 为 100. 00、 50. 00、 25. 00、
12. 50、6. 25 和 3. 12 μmol /L;阳性药 5-LOX 齐留
通 JH2 的终浓度为 100. 00、50. 00、25. 00、12. 50、
6. 25 和 3. 12 μmol /L;然后，每孔加入 5 μL底物亚
麻酸，25 ℃震荡孵育 5 min后，加入显色剂色原酮
50. 00 μL /孔，25 ℃震荡孵育 5 min 后终止反应，
在酶标仪上检测 D(490)值，计算抑制率为
抑制率 =
D(490，100% 酶活性)－ D(490，药物)
D(490，100% 酶活性)
× 100%
(1)
1. 9 统计学分析
采用 SPSS19. 0 软件，实验数据用 珋x ± s 表示，
两组比较用 t-检验，多组比较用方差分析． P ＜
0. 05 时表示差异显著． 半抑制浓度 (half maximal
inhibitory concentration，IC50)值由半数效应图计
得［8］．
2 结果及分析
2. 1 JH2 对 AA致小鼠耳肿胀度的影响
以耳朵局部涂抹给药方式评价 JH2 对小鼠耳肿
胀的作用，结果表明，局部涂 AA 能引起耳朵发
红、肿胀． 与模型组相比，JH2 可以明显减少小鼠
耳质量差 (表 1)及厚度差 (表 2)，并呈一定量
效关系，说明 JH2 对耳肿胀程度有明显抑制作用．
表 1 JH2 对 AA致小鼠耳质量差的影响 (珔x ± s，n =6)
Table 1 Effects of JH2 on ear weight difference (珔x ± s，n =6)
组别 mL /mg mＲ /mg (mＲ － mL)/mg 抑制率 /%
Ⅰ 10． 90 ± 0． 50 22． 80 ± 2． 10 11． 80 ± 1． 60 0． 00
Ⅱ 11． 40 ± 1． 00 20． 50 ± 1． 50 9． 00 ± 1． 30 23． 72
Ⅲ 10． 60 ± 0． 60 16． 60 ± 3． 201) 5． 90 ± 0． 801) 49． 58
Ⅳ 11． 10 ± 0． 90 14． 70 ± 2． 402) 3． 60 ± 0． 802) 69． 49
1)表示与模型组比较 P ＜ 0． 05;2)表示与模型组比较 P ＜ 0． 01
表 2 JH2 对 AA致小鼠耳厚度差的影响 (珔x ± s，n =6)
Table 2 Effects of JH2 on ear thickness difference (珔x ± s，n =6)
组别 dL /mm dＲ /mm (dＲ － dL)/mm 抑制率 /%
Ⅰ 0． 14 ± 0． 01 0． 65 ± 0． 03 0． 51 ± 0． 04
Ⅱ 0． 16 ± 0． 01 0． 56 ± 0． 03 0． 40 ± 0． 02 19． 22
Ⅲ 0． 14 ± 0． 01 0． 43 ± 0． 021) 0． 29 ± 0． 041) 43． 14
Ⅳ 0． 15 ± 0． 01 0． 28 ± 0． 032) 0． 14 ± 0． 022) 72． 55
1)表示与模型组比较 P ＜ 0. 05;2)表示与模型组比较 P ＜ 0. 01
2. 2 JH2 对 AA致小鼠蛋白渗出量的影响
蛋白渗出量以伊文思蓝染料渗出量表示． 实验
结果表明，JH2 能显著抑制小鼠肿胀耳朵的染料渗
出，处理时 1. 25、2. 50 和 5. 00 mg /耳的抑制率分
别为 22. 13%、41. 50%和 60. 66%，见图 1．
2. 3 JH2 对耳肿胀小鼠耳中 LTB4 生成量影响
实验结果表明，局部涂 AA 能引起 LTB4 生成
量显著升高． JH2 能显著抑制 LTB4 生成量，1. 25、
2. 50 和 5. 00 mg /耳 处 理 后 的 抑 制 率 分 别 为
65. 63%、81. 25%和 87. 50%，见图 2．
2. 4 组织病理学检查结果
在 50 ×光学显微镜下观察，耳组织病理切片结
果如图 3． 由图 3 可见，模型组 AA 刺激的耳朵出
现水肿现象，胶原纤维间隙增大，但炎性细胞浸润
现象不明显． JH2 处理组耳朵厚度较对照组明显有
所减小，水肿程度降低．
http:/ / journal．szu．edu．cn
第 1 期 黎 丽，等:角蒿咖啡酸酯对小鼠耳肿胀的抑制作用 49
＊＊表示与模型组比较 P ＜ 0． 01;
＊＊＊表示与模型组比较 P ＜ 0． 001
图 1 JH2 对 AA致小鼠蛋白渗出量的影响
Fig. 1 Effects of JH2 on exudation of proteins
＊＊＊表示与模型组比较 P ＜ 0． 001
图 2 JH2 对 LTB4 生成量的影响
Fig. 2 Effects of JH2 on LTB4 generation
图 3 组织病理学检查结果 (H＆E染色)
Fig. 3 (Color online)Ｒepresentative H＆E-stained sections of ear biopsies
2. 5 JH2 对花生 AA 代谢通路关键酶 5-LOX 的
影响
为研究 JH2 对 5-LOX 的作用机制，本实验就
JH2 对 AA通路中关键酶 5-LOX以及 COX-2 的活性
影响进行了检测． 结果显示，JH2 对 5-LOX 的酶活
性有明显的抑制作用，且呈现剂量依赖性，其半数
抑制浓度 IC50值为 12. 16 μmol /L，与阳性药 Zuleu-
tion活性接近 (IC50 = 10. 51 μmol /L)，见图 4． JH2
对 COX-2 无明显抑制作用．
3 讨 论
炎症是机体对外界刺激作出反应、对局部组织
或器官的损伤进行修复的生理过程，是多种疾病中
最常见而又最复杂的病理过程［9］． 很多炎症介质在
图 4 JH2 及 Zileution对 5-LOX酶活性的影响
Fig. 4 Effect of JH2 and Zileution
on 5-LOX activity
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50 深圳大学学报理工版 第 34 卷
机体内主要由 AA 代谢产生，其中，5-LOX 是 AA
代谢通路中强效致炎因子 LTB4 合成途径的关键限
速酶． AA 在 PLA2 和 5-LOX 等酶的催化作用下转
化为 LTA4，LTA4 后者被 LTA4H 水解为 LTB4 ．
LTB4 是目前发现的最强效的炎症趋化介质之一，
也是一种炎症性疼痛的介质． 所以 LTA4H 可以作
为很重要的抗炎靶点． 化合物对 LTA4H 的影响可
以通过对产物 LTB4的测定来判断药物对纯化酶的
抑制作用强弱［10-12］． 因此研究开发 5-LOX及其代谢
产物 LTB4 的小分子抑制剂，对多种急慢性炎症的
治疗具有重要意义．
本研究首先采用 AA 诱导的小鼠耳肿胀模型，
对 JH2 的整体抗炎药效进行评价，发现 JH2 能够通
过显著抑制 AA所致的小鼠耳肿胀厚度、蛋白渗出
量，并降低小鼠发炎耳组织中 LTB4 的产生量，从
而改善 AA诱导的耳肿胀炎症． 研究初步探讨了其
作用机制，进一步证明了 JH2 能够抑制 AA 代谢通
路中的关键酶 5-LOX 的活性． 因而说明 JH2 对 AA
诱导的小鼠耳肿胀急性炎症具有抑制作用，其机制
可能是通过抑制 AA代谢通路中的关键酶 5-LOX 的
活性，从而减少炎症介质 LTB4 的生成而发挥抗炎
作用． 本研究证明了 JH2 是一种具有良好抗炎药效
的天然小分子化合物，可作为开发 5-LOX抑制剂抗
炎药物的先导化合物，具有深入研究开发的价值．
基金项目:中国博士后科学基金资助项目 (2015M572370)
作者简介:黎 丽 (1986—)，女，深圳大学博士后研究人员． 研究
方向:天然产物机制研究． E-mail:wlili19860318123@
163.com
引 文:黎 丽，李玉珍，丁利平，等． 角蒿咖啡酸酯对小鼠耳
肿胀的抑制作用［J］． 深圳大学学报理工版，2017，34
(1):46-50．
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【中文责编:晨 兮;英文责编:艾 琳】
http:/ / journal．szu．edu．cn