全 文 ：HPLC法测定广东土牛膝中二羟基泽兰素的含量
李瑞明，张俊鹏，任 斌，陈 孝，梁耀荣，罗思婵，喻丽元
(中山大学附属第一医院药学部，广东 广州 510080)
摘要:目的 建立广东土牛膝中二羟基泽兰素含量的高效液相测定方法。方法 采用高效液相色谱法，色谱柱为 Diamonsil C18柱(250
mm ×4． 6 mm，5 μm) ，流动相为乙腈 － 0． 2%(V /V)磷酸水梯度洗脱，流速为 1． 0 ml /min，检测波长 240 nm。结果 二羟基泽兰素在 0．
58 ～ 6． 96 μg /ml浓度范围内有良好的线性关系(r = 0． 999 8) ，平均加样回收率为 99． 65%，RSD为 0． 8%(n = 6)。结论 该方法简便、
灵敏，准确，可用于广东土牛膝的质量控制。
关键词:广东土牛膝;二羟基泽兰素;HPLC
中图分类号:R284 文献标志码:A 文章编号:1673 － 4610(2011)10 － 0617 － 03
基金项目:广东省医院药学研究基金(编号:2010A15)
广东省自然科学基金面上项目(编号:8151008901000167)
作者简介:李瑞明，主管药师，Tel:13527876211，E-mail:liruiming321@ 163． com
通讯作者:任 斌，副主任药师，Tel:13710362040，E-mail:renbinsums@ 163． com
Determination of Dihydroxyeuparin in Radix Eupatorii Chinensis by HPLC
LI Rui-ming，ZHANG Jun-peng，REN Bin，CHEN Xiao，LIANG Yao-rong，LUO Si-chan，YU Li-yuan
(Department of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of SunYat-Sen University，Guangzhou，Guangdong 510080，China)
Abstract:Objective To establish a method for the content determination of dihydroxyeuparin in Radix Eupatorii Chinensis
by HPLC． Methods HPLC was developed to determine dihydroxyeuparin with UV absorptions at 240 nm． The analysis was
performed on a Diamonsil C18 column (250 mm × 4． 6 mm，5 μm)with a gradient solvent system of acetonitrile and
aqueous phosphoric acid (0． 2%，v /v)at a flow rate of 1． 0 ml /min． Results There was a good linear relationship(r = 0．
999 8)in the range of 0． 58 ～ 6． 96 μg /ml． The mean recovery was 99． 65%，RSD was 0． 8%(n = 6)． Conclusion This
method is simple，sensitive and accurate，and can be used for quality control of Radix Eupatorii Chinensis．
Key words:Radix Eupatorii Chinensis;dihydroxyeuparin;HPLC
广东土牛膝(Radix Eupatorii Chinensis)为菊科植
物华泽兰的干燥根及根茎［1］，广东土牛膝资源丰富，分
布较广，民间沿用历史悠久，具有清热解毒、凉血利咽、
抗炎镇痛的功效［2-4］，临床上常用于治疗各种咽喉炎、
扁桃腺炎等［5，7］。广东土牛膝属于广东省地方药材，尚
未建立起完善的质量标准，仅见于广东省中药材标准
对其进行薄层定性鉴别［8］，曾见卢绮雯等对广东土牛
膝中的腺苷进行含量测定［9］，但腺苷并非广东土牛膝
的特征性成分。本文以从广东土牛膝药材分离所得的
特征性成分二羟基泽兰素为指标成分，建立高效液相
色谱法测定广东土牛膝药材中二羟基泽兰素的含量，
该法具有分离效果好、简便、灵敏、准确等优点，可用于
该药材的含量测定及质量控制。
1 仪器与试药
Waters高效液相色谱仪(515 泵，996 检测器，Mil-
lennium32 色谱工作站) ，Milli-Q 超纯水装置(Milli-
pore)。
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·2011 年 10 月第 21 卷第 10 期· 今日药学
二羟基泽兰素对照品(自制，纯度 98． 72%) ;乙腈
为色谱纯;广东土牛膝(由广东康美药业股份有限公司
等公司提供) ;其余试剂为国产分析纯。
2 方法与结果
2． 1 样品溶液的制备
2． 1． 1 对照品溶液 精密称取二羟基泽兰素对照品
适量，用 50%(V /V)甲醇配制成浓度为 232． 0 μg /ml
的二羟基泽兰素对照品贮备液，备用。
精密吸取对照品贮备液 0． 5 ml，用 50%(V /V)甲
醇配制成浓度为 1． 16 μg /ml 的对照品溶液。
2． 1． 2 供试品溶液 取广东土牛膝药材粉末(过 120 目
筛)约 0． 5 g，精密称定，放置具塞锥形瓶中，精密加入
50% (V/V)的甲醇 50 ml，称定质量，超声处理 30 min，
放冷，再称定质量，用 50%(V /V)甲醇补足减失质量，
摇匀，滤过，取续滤液，过 0． 45 μm微孔滤膜，即得。
2． 2 色谱条件及系统适用性试验
色谱柱为 Diamonsil C18柱(250 mm × 4． 6 mm，5
μm) ，检测波长为 240 nm，柱温为室温，流动相为乙腈和
0． 2%(V/V)磷酸水梯度洗脱，流速为 1． 0 ml /min，洗脱
方式:0 ～20 min，乙腈 27%;20 ～ 30 min，乙腈 27%递升
至 80%;30 ～ 40 min，乙腈 80%。记录时间:40 min。
分别取对照品溶液(二羟基泽兰素浓度为 1． 16
μg /ml)、供试品溶液各 20 μl 注入色谱仪，按上述色谱
条件，记录色谱图(见图 1、2)。二羟基泽兰素和样品
中相邻色谱峰的分离度 ＞ 1． 5;理论塔板数以二羟基泽
兰素峰计算不低于 3 000;保留时间约为 15． 56 min。
图 1 二羟基泽兰素对照品 HPLC色谱图
图 2 广东土牛膝样品 HPLC色谱图
2． 3 方法学考察
2． 3． 1 线性与范围 分别精密吸取一定量的对照品
贮备液，用 50%的甲醇稀释成浓度为 0． 58、1． 16、2． 32、
4． 64、6． 96 μg /ml 的对照品溶液，分别取 20 μl 进样测
定，以峰面积(Y)对对照品浓度(X)进行回归，得回归
方程 Y = 169 882X + 10 875，r = 0． 999 8，试验表明在
0. 58 ～ 6． 96 μg /ml 之间浓度与峰面积线性关系良好。
2． 3． 2 精密度试验 取浓度为 1． 16 μg /ml 的二羟基
泽兰素对照品溶液 20 μl，连续测定 5 次，结果二羟基泽
兰素峰面积 RSD为 1． 04%，表明精密度良好。
2． 3． 3 稳定性试验 取广东土牛膝供试品溶液(批号
20090806) ，在 0、2、4、8、12 h分别进样 20 μl，记录峰面
积，结果二羟基泽兰素峰面积 RSD 为 0． 90%(n = 5) ，
表明供试品溶液在 12 h内稳定。
2． 3． 4 重复性试验 取同 1 批号(批号 20090806)样
品 5 份，按“2． 1． 2”项下方法制备溶液，分别进样测定，
结果二羟基泽兰素平均含量为 113． 88 μg /g，RSD 为
1. 35% ，表明重复性良好。
2． 3． 5 加样回收试验 精密称取已知含量(批号
20090806)广东土牛膝样品粉末约 0． 25 g，共 6 份;精
密称取二羟基泽兰素对照品适量，加入 50%甲醇配成
浓度为 98． 10 μg /ml的溶液，作为标准加样储备液。分
别加入上述标准加样储备液 0． 20、0． 40、0． 60 ml，每个
平行 2 份，按“2． 1． 2”项下方法制成加样回收样品。取
20 μl 进样，计算加样回收率，结果平均回收率为
99. 65%，RSD为 0． 8%(n = 6) (见表 1) ，结果表明该方
法回收率良好。
表 1 回收率试验结果
样品含量
(μg)
加入量
(μg)
测得值
(μg)
回收率
(%)
平均回
收率(%)
RSD
(%)
28． 85 19． 62 48． 43 99． 80
28． 73 19． 62 48． 18 99． 13
28． 61 39． 24 68． 31 101． 17
99． 65 0． 8
28． 83 39． 24 67． 97 99． 75
28． 82 58． 86 87． 22 99． 22
28． 87 58． 86 87． 04 98． 83
2． 4 样品测定
取广东土牛膝样品 5 批，按“2． 1． 2”项下方法制备
供试品溶液，分别取供试品溶液 20 μl，注入液相色谱
仪，测定，计算二羟基泽兰素的含量，结果见表 2。
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Pharmacy Today ·2011 10 Vol． 21 No． 10·
表 2 样品测定结果(n =5)
编号 批号 产地 供货商 二羟基泽兰素含量(μg /g) 含量(%)
1 20090806 广东怀集 广东康美药业服份有限公司 113． 88 0． 011
2 20100416 广东肇庆 广州市药材公司中药饮片厂 147． 88 0． 015
3 20100417 广东郁南 郁南县药材公司药材批发部 117． 75 0． 012
4 20090904 广西柳州 广东省药材公司 126． 06 0． 013
5 20100402 广西梧州 广东省药材公司 125． 37 0． 013
3 讨论
3． 1 提取溶剂的选择
分别用不同体积分数(30%、50%、70%、90%)甲
醇进行试验，结果二羟基泽兰素的含量分别为 111． 86、
113． 88、110． 52、96． 88 μg /g，表明用 50%的甲醇溶剂
提取比较完全。
3． 2 提取方法选择
主要用超声处理和加热回流方法，本文考察了以
50%(V /V)的甲醇为提取溶剂，样品分别超声和回流
处理，结果二羟基泽兰素的含量分别为 113． 88 μg /g、
109． 46 μg /g，因此选择超声提取。超声提取时间分别考
察了 20、30、40 min。结果超声 20 min 二羟基泽兰素的
含量为 106． 76 μg /g，超声 30 min 含量为 113． 88 μg /g。
超声处理 30 min与 40 min的结果相近，因此选择 30 min
作为提取时间。
3． 3 检测波长的选择
根据二极管阵列紫外检测器 200 ～ 400 nm 的扫描
结果，发现二羟基泽兰素对照品溶液在 240 nm 处有最
大吸收且干扰少，故选择 240 nm作为检测波长。
3． 4 流动相的选择
曾尝试用乙腈 － 0． 2%磷酸水、乙腈 － 0． 3%磷酸
水、乙腈 － 0． 4%磷酸水作为流动相。结果表明用乙腈
－0． 2%磷酸水为流动相，广东土牛膝中二羟基泽兰素
和其他组分分离度较好，并且峰形良好，基线稳定。
3． 5 含量测定结果显示
不同批次、不同产地广东土牛膝的二羟基泽兰素
含量存在较大的差异，即使是广东省内不同地区所产
的广东土牛膝药材之间仍然存在较大的差异，可能和
生长年限、采收期、土壤等有关，需作进一步研究。
3． 6 在本研究选定色谱条件下，广东土牛膝中二羟基
泽兰素的色谱峰分离良好，精密度、重复性及线性关系
良好，加样回收率令人满意。通过以上实验表明可用
HPLC法测定广东土牛膝中二羟基泽兰素的含量，该测
定方法简便、灵敏，准确，可用于广东土牛膝药材的质
量控制。
参考文献
［1］梅全喜，吴惠妃． 广东土牛膝的药用历史及现代研究
概况［J］．中医药学刊，2005，11(23) :1995 － 1997．
［2］黎创幸．广东土牛膝药理作用探讨［J］．中国临床医药
研究杂志，2008，(201) :46 － 47．
［3］刘晓燕，曾晓春，江剑东．广东土牛膝抗炎镇痛的研究
［J］．中医药学刊，2005，22(8) :1566 － 1568．
［4］梅全喜． 广东土牛膝化学成分与药理作用研究进展
［J］．中国中医药报，2007，8:1 － 2．
［5］孙一帆，徐庆文，梅全喜，等． 复方土牛膝糖浆治疗急
慢性咽炎扁桃体炎的临床观察［J］． 中华中医药学
刊，2007，3(25) :503 － 504．
［6］卢进，李瑞明，任斌，陈孝．咽炎方含片的醇沉工艺优
化［J］．今日药学，2010，20(11) :19 － 22．
［7］卢绮雯，李 坚，萧 鹏，等． HPLC法测定广东土牛膝中
腺苷的含量［J］．广东药学院学报，2007，23(2) ;130 －
131．［8］广东省中药材标准［M］． 广东科技出版社，
2004:11．
［9］卢绮雯，李坚，萧鹏，等． HPLC 法测定广东土牛膝中
腺苷的含量［J］．广东药学院学报，2007，23(2) :131 －
133．
(收稿日期:2011 － 09 － 23)
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