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培养条件对大叶白麻愈伤组织中三萜类化合物积累的影响
邢思雷， 计巧灵* ， 刘小锐
(新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046)
收稿日期:2010-04-15
基金项目:国家自然科学基金项目(亚麻与罗布麻体细胞杂交及其种质的耐盐性遗传研究 30660095);新疆教育厅重点科研项目(亚麻与
罗布麻体细胞杂交育种研究 XJEDU2006I08)
作者简介:邢思雷(1983 －)，男，硕士生，研究方向:植物细胞工程。E-mail:168xsl@ sina. com
* 通讯作者:计巧灵，教授，主要研究方向:植物生物技术。E-mail:wji1118@ yahoo. com. cn
关键词:大叶白麻;愈伤组织;培养条件;三萜类化合物;增长倍数
摘要:目的:研究了培养条件对大叶白麻愈伤组织生长和三萜类化合物积累的影响。方法:以大叶白麻无菌苗下胚轴段
为材，在 MS + 0. 2 mg /L 6-BA + 0. 6 mg /L NAA培养基上诱导愈伤组织并继代，探索愈伤组织继代次数、光周期、培养基
碳源和添加物对大叶白麻愈伤组织生长和三萜类化合物积累的影响。结果:(1)愈伤组织继代 3 次增长倍数最大，三萜
类化合物的产量达最大值，分别为 7. 3 倍和 0. 54 %;(2)4 种光周期处理中，16 h /d 光照下的愈伤组织增长量、三萜类化
合物含量最高，分别达到为 7. 2 倍和 0. 52% ;(3)蔗糖比葡萄糖、果糖更有利于愈伤组织的生物量增长和三萜类化合物
的积累，以附加 5%蔗糖最佳，分别为 8. 3 倍和 0. 72%;(4)在 3 种含添加物的培养基中，以添加 2 mg /L 水杨酸的培养基
上愈伤组织增长量最大，三萜类化合物含量也最高，分别为 7. 2 倍和 0. 68%。结论:通过改变培养条件和培养基成分，可
提高大叶白麻愈伤组织中三萜类化合物的产量。
中图分类号:R284. 1 文献标识码:A 文章编号:1001-1528(2011)01-0103-05
Effect of different culture conditions on triterpenes accumulation in callus of
Poacynum hendersonii［Hook. f.］Woodson
XING Si-lei， JI Qiao-ling* ， LIU Xiao-rui
(College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，China)
KEY WORDS:Poacynum hendersonii［Hook. f. ］Woodson;callus;culture condition;triterpene;proliferation
times
ABSTRACT:AIM:To study the effects of different culture conditions on callus growth and triterpene accumula-
tion in callus of Poacynum hendersonii［Hook. f.］Woodson. METHODS:The hypocotyls of aseptic seedlings
were cultured on MS medium adding 0. 2 mg /L 6-BA and 0. 6 mg /L NAA to induce callus growth and the subcul-
ture，which were used to detect the proliferation times and triterpenes’content under different subculture times，
photoperiod，carbon sources and supplements. RESULTS: (1)The growth rate of callus and triterpenes content
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reached the maximum values on the third subculture，which were 7. 3 times and 0. 54 % respectively. (2)The
callus cultured in 16 h /d photoperiod was optimal for the callus growth and triterpene accumulation，which reached
7. 2 times and 0. 52 %;respectively. (3)Sucrose showed the stronger ability to induce callus growth and triter-
pene accumulation than glucose and fructose，5 % sucrose was optimal for callus growth and triterpene accumula-
tion，which reached 8. 3 times and 0. 72 %;respectively. (4)Callus cultured on MS media adding with 2 mg /L
salicylic acid was the most suitable for the callus growth and triterpene accumulation，which reached 7. 2 times and
0. 68 % respectively. CONCLUSION:The results suggeste that the modulation of culture conditions and medium
composition could improve the triterpene accumulation in callus of Poacynum hendersonii.
大叶白麻(Poacynum hendersonii (Hook. f.)
Woodson)属夹竹桃科 (Apocynaceae)白麻属
(Poacynum Baill)的一种多年生草本植物，又名大花
罗布麻，主要分布于我国的新疆、青海和甘肃等省
区［1］。大叶白麻中含黄酮类、鞣质、多糖、萜类等化
学成分［2］。其中，三萜类化合物在降血糖、抗炎、保
肝、止痛等方面有重要的作用［3］，近年来还发现其
具有显著的抗肿瘤和促进免疫作用［4］。然而，由于
大叶白麻本身资源匮乏，不宜大规模开发利用，再加
上生境、气候等条件不断恶化，限制了大叶白麻这一
重要资源的开发。因此，利用组织培养技术，研究以
大叶白麻愈伤组织为原料生产三萜类化合物等重要
次生代谢产物具有重要的现实意义。目前，关于运
用大叶白麻组织培养生产药用成分的研究在国内外
尚未见报道。我们曾以大叶白麻愈伤组织为材，探
索了提取熊果酸和齐墩果酸等三萜类化合物的最佳
提取工艺，以 HPLC法进行定量测定，发现其质量分
数较低，仅为 0. 1% ～ 0. 5%。在此基础上，本试验
探讨了培养条件对大叶白麻愈伤组织生长和三萜类
化合物积累的影响，以期为提高大叶白麻愈伤组织
中三萜类化合物的含量提供科学依据。
1 仪器、材料与方法
1. 1 主要试验仪器与试剂
322 型紫外可见分光光度计;旋转蒸发仪(He-
izbad HB digit);恒温箱;实验室常规仪器设备。齐
墩果酸(批号 508-02-1)标准品购于美国 Sigma 公
司;所用试剂均为分析纯。
由无菌种苗诱导出愈伤组织，本实验收集的大
叶白麻愈伤组织，60 ℃干燥至恒重后粉碎过 40 目
筛子得粗粉，备用。
1. 2 试验材料
大叶白麻种子采自新疆巴州地区尉犁县，本试
验的愈伤组织来源于大叶白麻无菌苗的下胚轴。诱
导培养基为 MS + 0. 2 mg /L 6-BA + 0. 6 mg /L NAA
+3. 0 g /L蔗糖 + 6. 2 g /L 琼脂，pH6. 0。培养温度
为(25 ± 2 )℃，光照周期为 16 h /d，光强度为 2
500 lx。得到愈伤组织后，在上述培养基进行继代培
养，每 20 天继代一次，考察继代次数对愈伤组织生
长量和三萜类化合物积累的影响。得到大量愈伤组
织后，进行不同处理(见试验设计)。收集的大叶白
麻愈伤组织在 60 ℃干燥至恒重后，粉碎过 40 目筛，
得粗粉备用。
1. 3 试验设计
(1)分别采用 24、16、8 h /d 的光周期和连续黑
暗 4 种方式，探讨光周期改变对大叶白麻愈伤组织
生长量和三萜类化合物产量的影响。
(2)部分材料选用浓度为 30 g /L 的葡萄糖或
果糖作为碳源进行试验，另一部分材料选取 5 个不
同蔗糖浓度(20、30、40、50 和 60 g /L)作为碳源进行
试验，比较它们对愈伤组织生长量和三萜类化合物
产量的影响。
(3)分别加入 2 mg /L有机物(水杨酸或聚乙二
醇或矮壮素)在培养基中，探讨它们对大叶白麻愈
伤组织生长量和三萜类化合物产量的影响。
1. 4 标准曲线的绘制
准确称取齐墩果酸对照品 1. 0 mg，置 10 mL量
瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度，即得 0. 1 mg /
mL的齐墩果酸对照品溶液。分别准确吸取该溶液
0. 0、0. 20、0. 40、0. 60、0. 80 和 1. 00 mL 置 10 mL 量
瓶中，加热挥发掉全部溶剂后，加入 0. 2 mL 5 %香
草醛-冰醋酸溶液(g /v，新鲜配制)和 0. 8 mL 高氯
酸，摇匀。65 ℃水浴 15 min，然后冰水冷却，加入 5
mL冰醋酸，摇匀后置于室温。15 min 后用紫外可
见分光光度计在 557 nm波长处测定吸光度，以第一
种溶液作空白，以齐墩果酸毫克数为横坐标，吸光值
为纵坐标，绘制标准曲线。标准品质量在 0. 02 ～
0. 10 mg范围内与吸光度呈良好的线性关系，线性回
归方程为 Y = 6. 624X － 0. 047，r = 0. 999 6。
1. 5 愈伤组织增长倍数和三萜类化合物产量的测
定
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愈伤组织生长量的测定:每个处理接种 3 瓶，每
瓶接种愈伤组织 6 块(烘干后约为 0. 08 g)。愈伤
组织生长 20 d后，取出每瓶愈伤组织块在恒温箱 60
℃下烘干后称重。愈伤组织增长倍数 =(收获时的
愈伤组织干重-接种时的愈伤组织干重)/接种量，试
验重复 3 次，取平均值。
三萜类化合物产量的测定:分别准确称取干燥
的愈伤组织粗粉 0. 50 g，精密加入 95 % 乙醇 15
mL，超声提取 1. 5 h，滤纸过滤。滤液置于旋转蒸发
仪中，减压浓缩蒸干，残留物以甲醇溶解并定容至
10 mL，即得供试品溶液。分别吸取 0. 2 mL 的各供
试品溶液，按标准品给出的方法，加热挥发掉全部溶
剂后进行同样操作，测定吸光度，计算样品的含量。
每瓶愈伤组织三萜类化合物产量 =样品中三萜类化
合物的含量 ×愈伤组织生长量(g /瓶)/0. 5 g × 100
%。试验重复 3 次，取平均值。
图 1 继代次数对愈伤组织生长的影响
Fig. 1 Effects of subculture times on callus growth
图 2 继代次数对愈伤组织三萜类化合物产量的影响
Fig. 2 Effects of subculture times on triterpene
content in callus
2 结果与分析
2. 1 继代次数对愈伤组织增长倍数和三萜类化合
物产量的影响
由图 1 和图 2 可见，大叶白麻愈伤组织增长倍
数和三萜类化合物产量都在继代 3 次时达到最大
值，愈伤组织增长倍数和三萜类化合物产量分别为
7. 3 倍和 0. 54 %，之后开始平稳，至第 7 次继代稍
有下降，其中继代 4 至 6 次的愈伤组织增长倍数和
三萜类化合物产量每瓶分别维持在 6 ～ 7 倍和 0.
48% ～0. 52%。
2. 2 光周期条件对愈伤组织增长倍数和三萜类化
合物产量的影响
由图 3 和图 4 可见，4 种处理中，16 h /d 光周期
下培养的愈伤组织呈黄绿色颗粒状，色泽鲜艳，愈伤
组织增长倍数、三萜类化合物产量最高，分别为 7. 2
倍和 0. 52%;8 h /d 光周期下培养的愈伤组织呈黄
白色团状，增长倍数为 7. 0，而三萜类化合物产量仅
为 0. 45 %;在连续光照条件下，愈伤组织质地疏松，
逐渐失去光泽，愈伤组织增长倍数为 5. 8，三萜类化
合物产量仅为 0. 32 %;在全黑暗中培养的愈伤组织
呈浅黄色，质地较软，呈水渍状，增长倍数为 6. 5，三
萜类化合物产量为 0. 46%。
图 3 光周期条件对愈伤组织生长的影响
Fig. 3 Effects of photoperiod on callus growth
图 4 光周期条件对愈伤组织三萜类化合物产量的影响
Fig. 4 Effects of photoperiod on triterpene content
in callus
2. 3 碳源种类及蔗糖浓度对愈伤组织增长倍数和
三萜类化合物产量的影响
从图 5 和图 6 看出，在培养基的碳源浓度均为
30 g /L时，愈伤组织增长倍数由高到低分别为蔗糖
(7. 6 倍)>葡萄糖(3. 8 倍)>果糖(2. 8 倍);三萜
类化合物产量由高到低分别为蔗糖(0. 52%)>葡
萄糖(0. 28%)>果糖(0. 11%)。从试验结果可知，
碳源不仅影响愈伤组织增长倍数，也明显地影响三
萜类化合物的含量。
从图 7 和图 8 可知，在不同蔗糖浓度作为碳源
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图 5 不同碳源对愈伤组织生长的影响
Fig. 5 Effects of different carbon sources on callus growth
图 6 不同碳源对愈伤组织三萜类化合物产量的影响
Fig. 6 Effects of different carbon sources on triterpene
content in callus
图 7 蔗糖浓度对愈伤组织生长的影响
Fig. 7 Effects of sucrose concentration on callus growth
图 8 蔗糖浓度对愈伤组织三萜类化合物产量的影响
Fig. 8 Effects of sucrose concentration on triterpene
content in callus
的培养基上，愈伤组织的增长量和三萜类化合物的
积累随蔗糖浓度(20 ～ 50 g /L)的升高而增加，在 50
g /L 时，愈伤组织增长倍数和三萜类化合物产量达
到最大值，分别为 8. 3 倍和 0. 72%。蔗糖浓度在 60
g /L时，愈伤组织增长量和三萜类化合物的积累均
有所降低。试验观察中发现，蔗糖浓度为 50 g /L
时，愈伤组织生长较好，呈黄绿色颗粒状;蔗糖浓度
60 g /L 时，愈伤组织的生长受到抑制，老化较快。
因此，为得到最大的三萜类化合物产量，以蔗糖为碳
源，且其浓度为 50 g /L为宜。
2. 4 不同添加物对愈伤组织增长倍数和三萜类化
合物产量的影响
由图 9 和图 10 可知，在添加水杨酸的培养基
上，愈伤组织增长倍数为 7. 2 倍，愈伤组织中三萜类
化合物产量有明显提高，达到 0. 68 %;在添加聚乙
二醇的培养基上，愈伤组织增长倍数和三萜类化合
物产量均较低，分别为 6. 6 倍和 0. 46 %;在添加矮
壮素的培养基上，愈伤组织增长倍数和三萜类化合
物产量居中，分别为 7. 0 倍和 0. 58%。
图 9 不同添加物对愈伤组织生长的影响
Fig. 9 Effects of different accretions on callus growth
图 10 不同添加物对愈伤组织三萜类化合物产量的影响
Fig. 10 Effects of different accretions on triterpene
content in callus
3 讨论
继代次数对愈伤组织的增长倍数和三萜类化合
物的产量都有影响，继代 3 次的愈伤组织增长倍数
和三萜类化合物的产量均达到最大值，说明愈伤组
织已经适应了各培养条件，组织生长和次级代谢水
平达到了平衡。随继代次数的增加，愈伤组织中三
萜类化合物的产量开始慢慢降低，这可能是在继代
过程中，随着愈伤组织细胞对生长环境的适应，初级
代谢水平提高，增长倍数平稳，次生代谢水平缓慢降
低。
光周期对大叶白麻愈伤组织生长和三萜类化合
物产量有较大的影响。据 Butcher［5］报道，光影响
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着植物体内酶的活性和次生代谢产物的积累，光照
处理得当，可收到显著的效果。本实验中无论是连
续光照还是连续黑暗，对大叶白麻愈伤组织的生长
都有一定的抑制作用，连续光照对愈伤组织三萜类
化合物产量的抑制作用也较明显。16 h /d 的光周
期较有利于愈伤组织生长和三萜类产物的积累，这
可能是大叶白麻在系统发育过程中适应自然界这种
光周期的变化的结果。
糖是培养基中不可缺少的碳源，也是能量物质，
对维持渗透压起一定的作用。本试验比较了同浓度
的蔗糖、葡萄糖、果糖对愈伤组织的生长和三萜类化
合物含量的影响，发现蔗糖效果较好。以不同浓度
蔗糖为碳源，发现浓度为 50 g /L 时最有利于愈伤组
织的生长和三萜类化合物的积累。当蔗糖浓度达到
60 g /L时，则愈伤组织生长和三萜类化合物积累受
到抑制，可能是过高的蔗糖导致培养基渗透压的提
高，从而不利于细胞被动吸收营养，影响了愈伤组织
的生长和三萜类化合物积累。
在组织培养过程中，常常使用化学成分复杂的
营养混合物，希望能提高某种成分的含量。培养基
中不同的附加物对于不同植物细胞的生长和次生代
谢物的积累的影响存在着差异［6］。据报道［7］，三萜
类皂苷化合物作为植物次生代谢物中的一类重要组
分，其合成和积累随水杨酸的加入而发生显著变
化。向培养细胞中加入一定浓度的聚乙二醇可促进
细胞间的相互作用，从而有利于细胞生长，同时改
变细胞膜的微结构使三萜类化合物更好地释放［8］。
角鲨烯是甾体类化合物和三萜类化合物的共同前
体，矮壮素可以抑制甾体类化合物的合成，从而促使
角鲨烯更好地转向三萜类化合物的合成。在本实验
中，培养基中分别添加水杨酸、聚乙二醇和矮壮素，
对大叶白麻愈伤组织生长和三萜类化合物含量的影
响明显不同，相比之下，水杨酸对愈伤组织增殖和三
萜类化合物积累的效果最好，矮壮素次之，聚乙二醇
的效果不理想，可能是聚乙二醇的浓度过高，导致培
养体系渗透压的提高，阻碍了愈伤组织生长，从而抑
制了三萜类化合物的积累。
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黄心卫矛化学成分的分离与鉴定
朱小迪1， 李永慈1* ， 王建忠2， 赵秀海1， 周海成3
(1.北京林业大学森林培育与保护教育部重点实验室，北京 100083;2. 四川大学华西药学院，四川 成都
610065;3.长白山保护管理中心保护处，吉林 延边 133613)
收稿日期:2010-04-08
基金项目:财政部林业公益性行业科研专项(200904022);“十一五”国家科技支撑项目(2006BAD03A0804;2008BADB0B05)。
作者简介:朱小迪 (1983 －)，男，硕士，研究方向:长白山地区药用植物化学成分研究以及与环境因子的关系。Tel:13438906158 Email:
jimmyyrain@ 163. com
* 通讯作者:李永慈(1965 －)，女，博士，副教授。Email:lyczs@ 21cn. com
关键词:黄心卫矛;化学成分;胡萝卜苷亚油酸酯;10-eicosanol
摘要:目的:研究黄心卫矛(Euonymus macropterus Rupr.)的化学成分。方法:采用色谱技术分离纯化，并通过波谱技术及
理化性质鉴定化合物结构。结果:从黄心卫矛根部的乙醇提取物中分离得到 6 个化合物，分别鉴定为胡萝卜苷亚油酸酯
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