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回流提取插田泡叶总黄酮的条件优化



全 文 : [收稿日期] 2013-01-25;2013-04-10修回
 [基金项目] 贵州省教育厅自然科学研究项目“贵州喀斯特地区悬钩子属植物资源筛选与利用现状的研究”(2010065);贵阳市科技局科技
特派员计划“悬钩子属可食资源的利用及配套种植技术研究”(2011207)
 [作者简介] 蒋华梅(1976-),女,副教授,从事天然产物化学教学及相关研究工作。E-mail:857346695@qq.com
 *通讯作者:石登红(1980-),女,副教授,从事生物学教学及相关研究工作。E-mail:shdhieo@163.com
[文章编号]1001-3601(2013)05-0290-0144-03
回流提取插田泡叶总黄酮的条件优化
蒋华梅1,王向前2,石登红3*,苏春梅1,张婧婧1,张军强1,张贵书1,苟小敏1
(1.贵阳学院 化学与材料工程学院,贵州 贵阳550005;2.贵阳学院 图书馆,贵州 贵阳550005;3.贵阳学院
生物与环境工程学院,贵州 贵阳550005)
  [摘 要]为探讨贵州野生插田泡叶总黄酮的提取方法,用正交试验法对插田泡叶中总黄酮的最佳提取
条件进行了筛选,并用分光光度法对总黄酮含量进行测定。结果表明,最佳提取工艺条件为乙醇浓度70%、
料液比1∶10、回流温度80℃、提取时间3h。在此提取条件下,插田泡叶中总黄酮含量可达44.931 3mg/g,
远高于文献报道的202.79mg/100g。经试验验证,该工艺提取的插田泡叶总黄酮稳定性、重现性好,且加
样回收率高,具有一定的可行性。
[关键词]正交试验法;回流;提取;插田泡;总黄酮;分光光度法
[中图分类号]O629.9 [文献标识码]A
Refluxing Extraction Optimization of Total Flavonoids from the
Leaves of Rubus coreanus
JIANG Huamei 1,WANG Xiangqian2,SHI Denghong3*,SU Chunmei 1,
ZHANG Jingjing1,ZHANG Junxiang1,ZHANG Guishu1,GOU Xiaomin1
(1.College of Chemistry and Material Engineering;2.Library of Guiyang University;3.College of Biological and
Environmental Engineering,Guiyang University,Guiyang,Guizhou550005,China)
  Abstract:The optimal conditions for extracting total flavonoids from R.coreanus leaves were
investigated by orthogonal array design,and total flavonoids content in R.coreanusleaves was detected by
spectrophotometry to explore the method of extracting total flavonoids from the leaves of wild R.coreanus
in Guizhou.The results showed that the optimal conditions were as folows:concentration of ethanol
70%,solid-liquid ratio 1∶10,refluxing temperature 80℃,extraction time 3h.Under these conditions,
total flavonoids content in Guizhou R.coreanus leaves reached 44.931 3mg/g,which was much higher
than the date 202.79mg/100g from literatures.The results of verification experiment showed that the
technology of extracting total flavonoids from R.coreanus leaves was of good stability and repeatability,
and the recovery rate was high.Consequently,the technology has certain feasibility.
Key words:orthogonal array design;refluxing;extraction;Rubus coreanus;total flavonoids;spectro-
photometry
  插田泡(Rubus coreanus Maq.Var.corweanus)为
蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus Linn)多年生灌
木,是药食两用植物。插田泡果实味甘、酸、性温,富
含多种营养成分,具有较高的营养价值[1]。插田泡
果实、根、叶均可入药,具有补肾固精、平肝明目、活
血止血、祛风除湿、明目、除湿解毒等功效,主治阳
痿、不孕、目生翳障、风湿痹痛、跌打损伤、骨折、月经
不调等疾病。插田泡中含有插田泡甙[2]、覆盆子
甙[3]、黄酮[4]等多种生物活性物质。黄酮类化合物
具有清除血栓、降血压、降血脂、促进脑部、心脏的血
液循环等功效[5],可用于治疗冠状动脉硬化、预防血
液疾病等,可抑制肿瘤、消除体内自由基延缓衰老,
可作为天然色素、甜味剂等食品添加剂[6]。黄酮类
化合物的提取方法主要有:有机溶剂提取法、微波提
取法、超声波提取法、碱性稀醇或碱性水提取法和酶
法等[7-11]。微波提取法设备较贵,超声波提取法提
取率相对较低,碱性稀醇或碱性水提取法影响因素
较多,酶法试剂相对较贵。与其他方法相比,有机溶
剂回流提取法,提取率高,设备简单,影响回流提取
的因素少,试剂较便宜,可操控性强,更容易实现从
试验室到工厂化生产。悬钩子属植物中黄酮类化合
物的提取研究已有少量报道[12-13],但有关插田泡中
黄酮类化合物的研究尚未见报道。贵州位于中国悬
钩子属植物的西南分布中心,具有丰富的野生悬钩
子属植物资源[14]。因此,试验以贵州野生插田泡叶
为试验材料,采用正交试验法,利用有机溶剂回流提
取法对插田泡叶中的总黄酮进行提取,并用分光光
度法对总黄酮含量进行测定,旨在为贵州野生插田
泡资源的开发与利用提供科学依据。
 贵州农业科学 2013,41(5):144~146
 Guizhou Agricultural Sciences
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
野生插田泡叶,采自贵州贵阳学院,采摘时间为
12月,于100℃恒温干燥后研碎备用;所用试剂硝酸
铝 Al(NO3)3、亚 硝 酸 钠 (NaNO2)、氢 氧 化 钠
(NaOH)、无水乙醇(CH3CH2OH)均为分析纯,芦
丁为标准品≥97%(120℃干燥至恒重)。电子天平
(美国奥豪斯)、UV-2550型紫外可见分光光度计
(日本岛津)。
1.2 方法
1.2.1 芦丁标准溶液的配备 准确称取已干燥芦
丁标准品2.5mg于10mL容量瓶中,用蒸馏水稀
释至刻度,浓度为0.25mg/mL。
1.2.2 测定波长的选择 采用Al(NO3)3法,准确
移取芦丁标准品溶液1mL于10mL比色管中,用
蒸馏水稀释至2.40mL,加5%亚硝酸钠0.40mL,
混匀,放置6min,加10%硝酸铝0.40mL,混匀,放
置6min,加4%氢氧化钠4.00mL,用蒸馏水稀释
至刻度,混匀,放置15min。以不加NaNO2的溶液
为空白,采用紫外—可见分光光度法,在400~
800nm波长范围扫描[12-13],测得芦丁溶液在506nm
处吸光度值最大,因此确定506nm为试验的测定
波长。
1.2.3 芦丁标准曲线的绘制 准确移取芦丁标准
品溶液0.00mL、0.40mL、0.80mL、1.20mL、
1.60mL、2.00mL、2.40mL分别置于10mL的比
色管中,用蒸馏水稀释至2.40mL,加5%亚硝酸钠
0.40 mL,混 匀,放 置 6 min,加 10% 硝 酸 铝
0.40mL,混 匀,放 置 6 min,加 4% 氢 氧 化 钠
4.00mL,用 蒸 馏 水 稀 释 至 刻 度,混 匀,放 置
15min[13]。用紫外-可见分光光度计在506nm 波
长下测定上述溶液的吸光度,以吸光度 A为纵坐
标,稀释后的芦丁标准溶液浓度C为横坐标,绘制
标准曲线,求算出芦丁标准溶液的回归曲线方程及
相关系数。
1.2.4 插田泡叶中总黄酮的提取、测定及计算方
法 准确称取约2g插田泡叶粉末置于500mL三
角烧瓶中,按一定的乙醇浓度、料液比、回流温度和
提取时间进行回流提取,收集滤液,将滤渣按上述提
取条件再回流提取1次,过滤,合并滤液并用相应浓
度的乙醇溶液定容至100mL。准确移取上述提取
液各0.5mL,按1.2.3的方法显色,并测定吸光度,
将吸光度值代入芦丁标准曲线方程求出待测样品的
浓度,根据公式:样品总黄酮质量(mg)=待测样品
浓度×10×100/0.5,总黄酮含量(mg/g)=样品总
黄酮质量/样品质量,计算各样品总黄酮质量和含
量。
1.2.5 插田泡叶总黄酮的回流提取工艺试验 试
验选择极性较大、提取率较高的乙醇溶液作为提取
剂,考察有机溶剂浓度、料液比、回流温度、回流时间
对黄酮提取率的影响[7-13]。各因素水平条件的选择
参照同属植物山莓[12]和单因素试验结果进行选择,
然后采用正交试验法优化回流提取的最佳条件。用
分光光度计测定506nm波长处吸光度并计算样品
总黄酮含量,作为插田泡叶总黄酮提取指标。
1)单因素试验。A,乙醇浓度的选择。准确称
取4份插田泡叶粉末各2.000 0g置于500mL三
角烧瓶中,分别加入20mL 60%、70%、80%、90%
的乙醇溶液,控制回流温度80℃、提取时间2h,按
1.2.4的步骤进行总黄酮的提取、测定及含量计算。
B,料液比的选择。准确称取4份插田泡叶粉末各
2.000 0g置于500mL三角烧瓶中,分别按1∶5,
1∶10,1∶20,1∶40的比例加入80%乙醇溶液,控
制回流温度80℃、提取时间2h,按1.2.4的步骤进
行总黄酮的提取、测定及含量计算。C,回流温度的
选择。准确称取4份插田泡叶粉末各2.000 0g置
于500mL三角烧瓶中,加入20mL 80%乙醇溶液,
分别控制回流温度60℃、70℃、80℃、90℃,回流提
取2h,按1.2.4的步骤进行总黄酮的提取、测定及
含量计算。D,提取时间的选择。准确称取4份插
田泡叶粉末各2.000 0g置于500mL三角烧瓶中,
加入20mL 80%乙醇溶液,回流温度80℃,分别控
制提取时间为2h、3h、4h、5h,按1.2.4的步骤进
行总黄酮的提取、测定及含量计算。
2)正交试验。在单因素试验的基础上,以乙醇
浓度、料液比、回流温度和提取时间作为4个考察因
素,选取3个水平,采用L9(34)正交表进行正交试
验设计(表1)。并按1.2.4的步骤进行插田泡叶总
黄酮的提取、测定及含量计算,以确定总黄酮的最佳
提取条件。
 表1 回流提取插田泡叶总黄酮L9(34)正交试验设计
Table 1 L9(34)orthogonal array design of refluxing
extraction of total flavonoids from the leaves
of R.coreanus
水平
Level
因素 Factor
A乙醇
浓度/%
Ethanol
concentration
B料液比/
(g/mL)
Solid-
liquid ratio
C回流
温度/℃
Refluxing
temperature
D提取
时间/h
Extraction
time
1  70  1∶5  70  2
2  80  1∶10  80  3
3  90  1∶20  90  4
1.2.6 试验方法考察
1)精密度试验。准确吸取芦丁标准溶液1mL
5份,按1.2.3标准曲线绘制的方法操作,测定吸光
度值,计算相对标准偏差。
2)显色稳定性试验。准确吸取插田泡叶2号
样品溶液0.5mL至10mL比色管中,加蒸馏水至
2.4mL,按1.2.3的方法显色,用不加NaNO2的溶
液做空白,每10min测定1次吸光度,共测5次,计
算总黄酮含量,求相对标准偏差。
3)方法重现性试验。精确称取2.00g插田泡
叶粉末5份,按正交试验筛选出的最佳提取条件进
行总黄酮提取。精密吸取上述插田泡叶提取液
0.5mL,置 于 10 mL 比 色 管 中,加 蒸 馏 水 至
2.4mL,按1.2.3的方法显色,测定吸光度,计算总
·541·
 蒋华梅 等 回流提取插田泡叶总黄酮的条件优化
 JIANG Huamei et al Refluxing Extraction Optimization of Total Flavonoids from the Leaves of Rubus coreanus
黄酮含量,求相对标准偏差。
4)回收率试验。精确称取2.00g插田泡叶粉
末5份,按正交试验筛选出的最佳提取条件进行总
黄酮提取。准确吸取上述插田泡叶提取液0.5mL,
置于10mL比色管中,各加芦丁标准品溶液1mL,
按1.2.3的方法显色,测定吸光度,计算总黄酮含
量,求相对标准偏差。
5)验证试验。精确称取2.00g插田泡叶粉末
3份,按正交试验筛选出的最佳提取条件进行总黄
酮提取。准确吸取上述插田泡叶提取液0.5mL,置
于10mL比色管中,加蒸馏水至2.4mL,按1.2.3
的方法显色,测定吸光度,计算总黄酮含量。
2 结果与分析
2.1 不同因素对插田泡叶总黄酮提取的影响
2.1.1 乙醇浓度 由表2可知,当乙醇浓度为
60%~80%时,随乙醇浓度升高总黄酮提取率升高,
但当乙醇浓度超过80%后提取率稍有下降。由此
可知,乙醇浓度不宜过高,浓度过高会造成提取率降
低,且会增加提取成本。
2.1.2 料液比 由表2可知,料液比与总黄酮提
取率成正比,当料液比在1∶5~1∶10时,插田泡叶
总黄酮的提取率增加十分显著,超过1∶10后提取
率增加缓慢。由此可知,随着提取溶剂用量的增加,
粗提物中总黄酮有效成分的浓度随之增大,但达到
一定比例后,浓度增大趋势不明显。
2.1.3 回流温度 回流温度60~80℃,总黄酮提
取率随温度的升高而显著增大(表2),但温度为
90℃时提取率降低。由此可知,回流温度过高,粗提
物中总黄酮有效成分的浓度随之降低。
2.1.4 提取时间 由表2可知,总黄酮提取率随
提取时间的增加而增大,可见提取时间越长总黄酮
提取越充分,但当时间超过4h时,提取率增长较
小,趋于稳定。由此可知,提取率与提取时间成正
比,但当达到一定提取时间后,提取率变化不大。
表2 不同因素下插田泡叶总黄酮的提取率
Table 2 Effect of different factors on the extraction efficiency of total flavonoids
A乙醇浓度/%
Ethanol concentration
浓度/%
Concent
ration
总黄酮含量mg/g
Total flavonoids
content
B料液比/(g/mL)
Solid-liquid ratio
比例/
(g/mL)
Ratio
总黄酮含量mg/g
Total flavonoids
content
C回流温度/℃
Refluxing temperature
温度/℃
Temperature
总黄酮含量mg/g
Total flavonoids
content
D提取时间/h
Extraction time
时间/h
Time
总黄酮含量mg/g
Total flavonoids
content
60  22.464 2  1∶5  8.985 7  60  20.217 7  2  25.696 2
70  27.203 4  1∶10  15.724 9  70  26.710 6  3  31.942 6
80  31.449 8  1∶20  15.933 1  80  32.957 0  4  38.189 1
90  30.452 1  1∶40  16.222 8  90  29.696 2  5  38.212 0
2.2 最佳工艺条件
由表3可知,各因素的极差大小顺序为RD>
RB>RC>RA,4个因素对插田泡叶中总黄酮提取率
的影响大小依次为提取时间(D)>料液比(B)>回
流温度(C)>乙醇浓度(A)。极差分析表明,4个因
素中,提取时间的影响作用最显著,其次是料液比和
回流温度,影响最小的是乙醇浓度。根据4个因素
的K1、K2和K3值的大小可知,A因素A1>A2>
表3 回流提取插田泡叶总黄酮L9(34)正交试验结果
Table 3 L9(34)orthogonal array results of refluxing
extraction of total flavonoids from the leaves
of R.coreanus
试验号
No.
A  B  C  D 总黄酮含量mg/g
Total flavonoids
content
1  1  1  1  1  23.196 8
2  1  2  2  2  44.928 3
3  1  3  3  3  32.287 1
4  2  1  2  3  32.325 7
5  2  2  3  1  26.951 5
6  2  3  1  2  38.642 0
7  3  1  3  2  26.604 2
8  3  2  1  3  36.879 7
9  3  3  2  1  29.965 2
K1 33.471 27.376 32.906 26.705
K2 32.640 36.253 35.740 36.725
K3 31.150 33.631 28.614 33.831
R  2.321  8.877  7.126 10.020
A3,B因素B2>B3>B1,C因素C2>C1>C3,D因素
D2>D3>D1。因此,乙醇回流提取插田泡叶总黄酮
的最佳工艺条件为A1B2C2D2,即乙醇浓度70%、料
液比1∶10、回流温度80℃、提取时间3h,在此试验
条件下,总黄酮提取率为44.928 3mg/g。
2.3 试验方法验证
根据1.2.3芦丁标准曲线的绘制方法,求算出
芦丁标准溶液的回归曲线方程为A=10.911 4×
C+0.029 3(A 为吸光度、C 为浓度 mg/mL),
r=0.997,说明芦丁标准品在0.01~0.06mg/mL,
芦丁质量浓度与吸光度线性关系良好;平均加样回
收率为100.12%,RSD=0.70%(n=5);精密度、重
现性和稳定性试验测定的RSD分别为0.66%(n=
5)、1.78%(n=5)和1.15%(n=5),说明该方法测
定插田泡叶中总黄酮含量的速度快,结果准确,精密
度高,重复性和稳定性好;按正交试验筛选出的最佳
提取条件进行3次验证试验,插田泡叶中总黄酮含
量平均值为44.931 3mg/g,略高于表2中试验结
果,故确定A1B2C2D2为最佳提取工艺条件,按该试
验方法提取插田泡叶中总黄酮的含量稳定,工艺条
件合理且稳定可行,可应用于工业生产中。
3 结论
正交试验结果表明,乙醇回流提取插田泡叶总
(下转第150页)
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                                        贵 州 农 业 科 学
                                   Guizhou Agricultural Sciences
分含量、含盐量等)进行检测,是今后需进一步开展
的研究工作。
[参 考 文 献]
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(责任编辑:孙小岚
櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁

(上接第146页)
黄酮最佳提取工艺条件为乙醇浓度70%、料液比
1∶10、回流温度80℃、提取时间3h。在此提取条
件下,贵州野生插田泡叶中总黄酮的含量可达
44.931 3mg/g。经试验验证,乙醇回流提取插田泡
叶总黄酮的工艺条件稳定性、重现性好,加样回收率
高,具有一定的可行性。
贵州冬季野生插田泡叶中总黄酮的含量高达
44.9313 mg/g, 远 高 于 文 献 报 道 的
202.79mg/100g[12],说明黔产野生插田泡叶蕴含丰
富的总黄酮资源。此研究结论可为贵州野生插田泡
资源的开发与利用提供科学依据,对促进贵州野生
插田泡资源的综合利用具有现实意义。
[参 考 文 献]
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(责任编辑:孙小岚)
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                                        贵 州 农 业 科 学
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