全 文 ：不同提取方法对土牛膝总皂苷含量测定的影响
柳立新1，张 毅2
( 1．安徽医学高等专科学校，安徽 合肥 230601; 2．安徽省药物研究所，安徽 合肥 230022)
摘要:目的 建立土牛膝中总皂苷的含量测定方法，并考察不同提取方法对土牛膝中总皂苷含量测定的影响。方法 采用比色
法测定总皂苷的含量，分别考察甲醇回流提取、乙醇回流提取等 5 种提取方法制得的样品溶液所测定的总皂苷的含量。结果
甲醇回流提取、乙醇回流提取、水超声提取、乙醇超声提取及索氏回流提取制备的样品溶液中总皂苷的含量分别为 3． 36%，
4． 75%，2． 63%，4． 97%，2． 14%。结论 比色法可用于土牛膝总皂苷含量测定，样品溶液的制备宜采用乙醇超声提取法。
关键词:土牛膝;牛膝总皂苷;含量测定
Effect of different extraction methods on the determination of total
saponins in local achyranthes aspera
LIU Li-xin1，ZHANG Yi2
(1． Anhui Medical College，Hefei，Anhui 230601;2． Anhui Institute of Materia Medica，Hefei，Anhui 230022，China)
Abstract:Objective To establish the determination method of total saponins in local achyranthes aspera，and to investigate the effect of
different extraction methods on the determination of total saponins in local achyranthes aspera． Methods Colormetric method analysis
was carried out． Five extraction methods was compared． Ｒesults The contents of total saponins were 3． 36%，4． 75%，2． 63%，4． 97%，
2． 14% respectively． Conclusion Colorimetric method analysis can be used to determine the content of total saponins in local achyran-
thes aspera，and ethanol extraction method should be used to prepare the sample solution．
Key words:Local achyranthes aspera;total saponins;content determination
土牛膝来源于苋科植物粗毛牛膝 Achyranthes aspera L、柳
叶牛膝 Achyranthes longifclia Makino及牛膝 Achyranthes bident-
ataBlume野生种的根。性平、微苦、凉，具清热解毒、利咽化
痰、抗菌消炎、镇静止痛之功效，临床常用于白喉、扁桃体炎、
急慢性咽喉炎、感冒发烧、麻疹肺炎、痈疽疖肿、蛇咬伤、类风
湿关节炎等的治疗［1］。土牛膝的主要有效成分是以齐墩果
酸为苷元的三萜皂苷类成分。药理研究表明，牛膝皂苷具有
保肝降酶、降血脂、强心、增加骨密度等作用，能明显降低血清
中甘油三酯、胆固醇和脂蛋白的含量，并对实验性大鼠脑卒
中、骨质疏松等有一定治疗作用［2-5］。关于土牛膝总皂苷的含
量测定尚未见报道，为此我们应用比色法对土牛膝中的总皂
苷的含量进行了测定。由于总皂苷的提取方法及分离方式直
接影响比色测定的结果，因此我们考察了 5 种不同的提取方
法对总皂苷含量测定的影响。
1 仪器和材料
1． 1 仪器 TU-1810 型紫外分光光度计，北京普析通用仪器
有限责任公司;AＲ1140 型电子天平，瑞士梅特勒-托利多公
司;SHZ-D 型循环水式真空泵，河南省巩义市英峪仪器厂;
As3120B超声清洗器，上海新芝生物技术研究所。
1． 2 药材 土牛膝药材，泰安市永春堂中药饮片有限公司，
批号:09022410。
1． 3 试剂 齐墩果酸对照品，中国药品生物制品检定所，批
号:09031012;甲醇，色谱纯，天津四友生物医学技术有限公
司;香草醛、高氯酸、冰醋酸、乙醚、乙酸乙酯等试剂均为市售
分析纯。
2 方法和结果
2． 1 对照品溶液的制备 本实验采用比色法测定土牛膝中
总皂苷的含量，而国内目前还没有牛膝皂苷类成分的法定对
照品，参考文献，我们选用齐墩果酸作为对照品［6-7］。精密称
取齐墩果酸对照品适量，配制成浓度为 0． 48 g·L －1的对照品
溶液。
2． 2 供试品溶液的制备 精密称取干燥的土牛膝粗粉 2 g，
加 70%乙醇超声 3 次，每次 30 min，加醇量分别为 25，20 和
20 mL。合并提取液，过滤，滤液浓缩至 10 mL。上预先处理
好的 D101树脂柱，依次用水 50 mL、70%的乙醇 100 mL 洗脱，
弃去水洗液，收集乙醇洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解，定容至
100 mL，摇匀，即得。
2． 3 测定波长的选择 精密吸取供试品溶液和对照品溶液
各 0． 1 mL，分别加入具塞试管中，水浴挥干溶剂，各加入新鲜
配制的 5%香草醛冰醋酸溶液 0． 2 mL，高氯酸 0． 8 mL，于
60℃水浴加热 20 min，冰水浴冷却后，精密加入乙酸乙酯 5
mL，摇匀。于 400 ～ 760 nm波长处进行扫描。结果供试品溶
液与对照品溶液均在波长 547 nm处有最大吸收，故确定测定
波长为 547 nm。
2． 4 线性关系考察 精密吸取齐墩果酸对照品溶液(0． 48 g
·L －1)0． 05、0． 10、0． 15、0． 20、0． 25 mL 分别置具塞试管中，
水浴挥干溶剂，加入新制的 5%香草醛冰醋酸溶液 0． 2 mL、高
氯酸 0． 8 mL，于 60℃水浴加热 20 min，冰水浴冷却，精密加入
乙酸乙酯 5 mL，摇匀。平行试剂作空白对照，547 nm 波长处
测定吸收度值。以齐墩果酸的含量对吸收度进行线性回归，
得回归方程为:Y = 4． 354 2X + 0． 000 1，相关系数 r = 0． 999 6
(n = 5)。表明齐墩果酸在 0． 024 ～ 0． 12 mg 范围内线性关系
良好。
2． 5 精密度试验 精密吸取供试品溶液 0． 1 mL于具塞试管
中，水浴挥干溶剂，依法显色，重复 5 次测定吸光度 A。相对
标准偏差(ＲSD)为 0． 43%，表明方法精密度良好。
2． 6 稳定性实验 精密吸取供试品溶液 0． 5 mL，加入具塞
试管中，水浴挥干溶剂，精密加入新配制的 5%香草醛冰醋酸
·6921· 安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2013 Aug; 17( 8)
溶液 1 mL，高氯酸 4 mL，混匀，于 60℃水浴中加热 20 min，冰
水浴冷却后，精密加入乙酸乙酯 25 mL，摇匀。终止反应 10
min后，每隔 10 min 测定吸收度 A，分别在 10、20、30、40、50
min时测定。以未加齐墩果酸对照品溶液的相同试剂作空
白，分别测定吸光度为 0． 450，0． 459，0． 451，0． 441，0． 418。从
上述数据可以看出冰水浴终止反应后第 40 分钟后吸光度发
生较大的变化，因此含量测定应在冰水浴终止反应后 40 min
内测定为宜。
2． 7 重复性试验 分别精密吸取 6 份供试品溶液各 0． 1 mL
置于已编号具塞试管中，水浴挥干溶剂，依法显色，分别测定
吸光度 A。计算得平均含量为 4． 97%，ＲSD = 0． 48%。
2． 8 加样回收率实验 精密称取已知含量的土牛膝粉末0． 1
g共 6 份，精密加入齐墩果酸对照品 5． 00 mg，照供试品溶液
制备方法制成 10 mL样品液。各精密量取样品液 0． 1 mL 于
具塞试管中，挥干溶剂，依法显色，测定吸光度 A，计算回收
率，结果见表 1。由表 1 结果得本方法的平均加样回收率为
96． 94%，ＲSD为 1． 67%。表明本方法回收率良好。
表 1 加样回收率实验测定结果(n = 6)
取样量 / g 样品含量 /mg 加入量 /mg 测得量 /mg 回收率 /%
0． 0989 4． 92 5． 00 9． 51 95． 87
0． 1060 5． 27 5． 00 10． 1 98． 34
0． 1010 5． 02 5． 00 9． 64 96． 21
0． 0994 4． 94 5． 00 9． 42 94． 77
0． 0993 4． 94 5． 00 9． 68 97． 38
0． 0946 4． 70 5． 00 9． 61 99． 07
2． 9 样品含量测定
2． 9． 1 样品溶液制备 按照下述 5 种提取方法所得的提取
液，分别上已处理好的 D101大孔吸附树脂柱，先以水 50 mL洗
脱，弃去水洗液，再用 70%的乙醇 100 mL洗脱，收集洗脱液，
蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至 100 mL 量瓶，甲醇定容至刻
度，摇匀，即得。
(1)乙醇回流提取法:精密称取干燥的土牛膝粗粉 2 g，
用 70%乙醇回流提取 3 次，每次 1． 5 h，加醇量分别为 25、20
和 20 mL。过滤，滤液浓缩至 10 mL。
(2)甲醇回流提取法:精密称取干燥的土牛膝粗粉 2 g，
用甲醇回流提取 3 次，每次 1． 5 h，加醇量分别为 25，20 和 20
mL。过滤，合并滤液，挥干溶剂，残渣加水溶解，定容至 10
mL。
(3)索氏提取法:精密称取干燥的土牛膝粗粉 2 g，滤纸
包裹置索氏提取器中，加乙醚 80 mL，加热回流 2 h，弃去乙醚
液，药渣挥去乙醚，连同滤纸移置于索氏提取器中，加入甲醇
80 mL，加热回流提取 3 h，取甲醇提取液，挥干溶剂，残渣加水
使溶解并定容至 10 mL。
(4)水超声提取法:精密称取干燥的土牛膝粗粉 2 g，加
水超声 3 次，每次 30 min，加水量分别为 25，20 和 20 mL。合
并提取液，过滤，浓缩，定容至 10 mL。
(5)乙醇超声提取法:精密称取干燥的土牛膝粗粉 2 g，
加 70%乙醇超声 3 次，每次 30 min，加醇量分别为 25，20 和
20 mL。合并提取液，过滤，浓缩并定容至 10 mL。
2． 9． 2 样品含量测定 精密吸取上述不同提取方法制得的
土牛膝供试品溶液 0． 1 mL 于具塞试管中，水浴挥干溶剂，依
法显色，分别测定吸光度 A，然后根据回归方程计算其中总皂
苷含量。由甲醇提取法，乙醇提取法，水超声提取法，乙醇超
声提取法及索氏提取法得总皂苷的含量分别为 3． 36%，
4． 75%，2． 63%，4． 97%，2． 14%。由此组数据可知乙醇超声
提取法测得土牛膝总皂苷的含量最高。结果见表 2。
表 2 不同方法提取的土牛膝总皂苷含量测定结果
提取方法 甲醇提取 乙醇提取 水超声 醇超声 索氏提取
A1 0． 305 0． 433 0． 231 0． 441 0． 184
A2 0． 313 0． 426 0． 225 0． 453 0． 189
平均值 0． 309 0． 4295 0． 228 0． 447 0． 1865
取样量 / g 2． 1123 2． 0754 1． 9896 2． 0662 1． 9974
含量 /% 3． 36 4． 75 2． 63 4． 97 2． 14
3 讨论
牛膝中总皂苷的含量测定方法目前多采用比色法。以
5%香草醛—冰醋酸溶液和高氯酸为显色剂，在 547 nm 处测
定土牛膝皂苷的含量。由于香草醛—冰醋酸试剂与土牛膝总
皂苷的显色反应极为灵敏，温度、时间对实验结果影响较大，
实验中应严格控制显色时间和温度，另外加热显色前一定要
充分振摇，否则实验误差较大，因此须严格控制实验条件，尽
量减少误差［7］。总皂苷的含量测定常用比色法，显色后多用
冰醋酸作为溶剂［8-10］，但冰醋酸的腐蚀性和刺激性较强，因此
在实验中我们选用乙酸乙酯为溶剂，结果表明效果良好。
由于比色法中样品的提取方法直接影响比色测定的结
果，因此我们考察了 5 种不同的提取方法对总皂苷含量测定
的影响。结果表明 70%乙醇超声提取和回流提取总皂苷的
含量较高，可见药材的前期处理直接影响着总皂苷含量的测
定结果。
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