全 文 ：　第 49卷　第 3期
2010年　5月
中山大学学报 (自然科学版)
ACTA　SCIENTIARUM　NATURALIUM　UNIVERSITATIS　SUNYATSENI
Vol.49　No.3
May　2010 　
高速逆流色谱分离制备苦茶中的苦茶碱＊
程　悦1 , 严志勇 1 , 卢嘉丽 1 , 叶创兴 2 , 王冬梅 1
(1.中山大学药学院 , 广东 广州 510006;
2.中山大学生命科学学院 , 广东 广州 510275)
摘　要:应用高速逆流色谱法分离制备了苦茶中的苦茶碱。以正己烷 -二氯甲烷 -甲醇 -水 (体积比为 1∶5∶4
∶2)为两相溶剂系统 , 在主机转速 800 r/min、 流速 2.0 mL/min、 检测波长 278 nm条件下进行分离制备。 所得
流分经高效液相色谱法检测 , 与对照品进行比较 , 并通过质谱 、 核磁共振氢谱 、 碳谱鉴定化合物的结构。 结果
表明 , 从 2.22g苦茶总生物碱提取物中分离得到了 3个化合物 , 分别为可可碱 5 mg, 苦茶碱 389mg, 咖啡碱 41
mg, 纯度均在 99%以上 , 系首次采用高速逆流色谱法对苦茶中的苦茶碱进行分离。该法具有简便 、 快速的优点。
关键词:高速逆流色谱;苦茶;嘌呤生物碱;苦茶碱
中图分类号:R285.5;R931.71　　文献标志码:A　　文章编号:0529-6579 (2010)03-0065-05
IsolationandPreparationofTheacrinebyHigh-SpeedCounter-Current
ChromatographyfromCameliaassamicavar.kucha
CHENGYue1 , YANZhiyong1 , LUJiali1 , YEChuangxing2 , WANGDongmei1
(1.SchoolofPharmaceuticalSciences, SunYat-senUniversity, Guangzhou510080, China;
2.SchoolofLifeSciences, SunYet-sanUniversity, Guangzhou510275, China)
Abstract:Theacrinewasprepared, isolatedandpurifiedfromCameliaasamicavar.kuchabyhigh-
speedcounter-currentchromatography.Atwo-phasesolventsystemcomposedofhexane-dichloromethane-
methanol-water(1∶5∶4∶2, v/v/v/v)wasselectedwithcomprehensiveanalysisofthesetlingtime, the
ratioofupanddownphasesvolumeandtheKvalue.Fivemgoftheobromine, 389 mgoftheacrineand
41mgofcafeinewiththeirpuritiesover99%wereobtainedfrom2.22gofthecrudeextractofCamelia
asamicavar.kuchaundertheconditionofaflowrateof2.0 mL/min, 800 r/minandthedetection
wavelengthof278 nm.Theobtainedfractionswereanalyzedbyhighperformliquidchromatography,
comparedwithstandardsubstanceandidentifiedbyMS, 1HNMRand13CNMRmethods.Theacrinewas
thefirsttimeisolatedfromCameliaassamicavar.kuchabyHSCCC, whichisasimple, rapidandefec-
tivemethod.
Keywords:HSCCC;Cameliaassamicavar.kucha;purinealkaloid;theacrine
　　苦茶 (Cameliaasamicavar.kuchaChanget
Wang)是山茶属茶亚属茶组茶系普洱茶的变种 ,
为张宏达先生 1984年发表的茶的新变种 , 集中分
布在云南省金平县铜厂乡瑶山村附近的山坡上 , 其
化学成分上不同于其他茶树资源的特殊性表现在嘌
呤生物碱的构成模式上 , 除了茶组植物中常见的咖
啡碱 、 可可碱外 [ 1] , 苦茶中尚富含苦茶碱 (1, 3,
7, 9-四甲基尿酸 , theacrine, 简称 TC)[ 2-3] , 经
最新研究表明其具有镇静 、 催眠的药理活性 [ 4] 。
本文是建立从苦茶中提取制备其特征性成分苦茶碱
的新方法 , 为其进一步的生物活性研究提供必要的
物质基础。
＊ 收稿日期:2009-09-07
基金项目:中山大学张宏达科学研究基金资助项目
作者简介:程悦 (1987年生), 女 , 研究生;通讯作者:王冬梅;E-mail:lsswdm@mail.sysu.edu.cn
中山大学学报 (自然科学版) 第 49卷　
传统的苦茶碱分离方法有柱层析法和溶剂
法[ 5-7] , 耗时较长 、步骤繁多 , 且在多次反复的柱
层析过程中 , 样品有较大的损失 , 得率较低 , 而且
流动相的选择比较局限 。高速逆流色谱 (high-
speedcounter-currentchromatography, 简称 HSCCC)
是一种液 -液分配色谱技术 , 由于其无固态支撑
体 , 消除了由于样品在固相载体上的不可逆吸附和
降解造成的损失 , 与一般的色谱分离方式不同 , 利
用不对称离心力场 , 实现两相溶剂体系的充分保留
和有效混合及分配 , 可以在短时间内实现高效分离
和制备 , 能实现梯度洗脱和反相洗脱 , 亦能进行重
复进样 , 使其特别适用于制备性分离 , 其产品纯度
高 , 制备量大 , 节约溶剂 , 因而近 10年来被广泛
应用于各个领域[ 8-12] 。本文首次采用 HSCCC从苦
茶中分离得到苦茶碱 , 此外还分离到咖啡碱和可可
碱等其它嘌呤类生物碱 。
图 1　苦茶中嘌呤生物碱的化学结构式
Fig.1　ChemicalstructuresofpurinealkaloidsinCamellia
assamicavar.kucha
1　实验部分
1.1　供试材料
野生苦茶叶 (采自云南省金平县铜厂乡瑶山村)。
苦茶鲜叶经隔水蒸青 5min、 摊晾 、 80℃干燥
24h后取出 , 粉碎至 20 ～ 40目 , 置干燥器中备用。
1.2　实验仪器与试剂
QuilPrepTMChassisMKV 500 /SeriesⅡ HPLC
Pump高速逆流色谱仪 (英国 /AECS美国 SSI), 包
括 N2000型色谱工作站 (浙江大学 ), 高压输液
泵 , 紫外检测器 (岛津公司 日本);Waters600高
效液相色谱仪 (Waters公司 美国), 包括 Waters
2487紫外检测器 , Waters717 plus自动进样器 ,
Breeze色谱工作站软件;PhenomenexSecurityGuard
保护柱和 PhenomenexGeminiC18柱 (250 mm×
4.6 mmi.d., 5 μm);GB204电子天平 (MET-
TLERTOLEDO);LabconcocentriVap离心浓缩仪
(美国 Labconco公司);MTN-2800D氮吹蒸缩装
置 (天津奥特赛恩斯仪器有限公司);EYELAN旋
转蒸发装置 (上海爱朗仪器有限公司);DZF-
6051真空干燥箱 (上海一恒科技有限公司);X-
4数字显示显微熔点测定仪 (北京泰克仪器有限公
司);FinniganTraceUltra/DSQ气质联用仪 (Ther-
mo, USA);Mercury-Plus300 核磁共振波谱仪
(VARIAN, USA)。
咖啡碱 、可可碱标准品 (w>98%, 美国 Sig-
ma公司);苦茶碱 (w>99% HPLC法 , 实验室
自制);正己烷 、 二氯甲烷 、 甲醇 、 乙酸乙酯均为
分析纯 (天津市红岩化学试剂厂);乙腈为色谱纯
(美国 Sigma公司);水为超纯水 (Milpore超纯水仪 ,
Milford, MA);氘代氯仿 (ARMAR, Switzerland)。
1.3　苦茶氯仿萃取物的制备
以 m(沸水)∶m(苦茶叶) =12∶1提取 250
g苦茶叶中水溶性成分 , 超声过滤 3次 , 合并滤
液 , 将水提液浓缩至 1 L。浓缩后的水提液用氯仿
萃取浓缩后 , 将氯仿萃取物置于真空干燥箱干燥 3
h, 乙醚脱色 , 得苦茶氯仿萃取物 2.22g。
1.4　溶剂体系的选择
配制各种比例的溶剂体系 , 记录测定两相溶剂
系统的 “平衡时间”, 即:当上相与下相溶剂混合
时 , 两相系统达到完全分层的时间。再称取苦茶氯
仿萃取物约 2 mg置于试管中 , 分别取上相 、下相
溶液各 2 mL溶解样品 , 充分震荡溶解 , 记录分层
时间。待两相平衡后 , 分别精确取上相 、 下相溶液
各 1 mL, 挥干 , 再用 0.6 mL纯水溶解 , 进行
HPLC分析。计算不同溶剂系统中 , 目标化合物的
分配系数 K值 。
K=目标化合物在上相溶液中的峰面积值 A1目标化合物在下相溶液中的峰面积值 A2
1.5　溶剂体系和样品溶液的配制
将溶剂体系在分液漏斗中充分摇匀 , 静置分
层 , 分别将上下两相超声脱气 30min。将苦茶氯仿
萃取物 2.22 g用 10 mL上相和 10 mL下相溶解 ,
用 0.45μm微孔滤膜过滤。
1.6　高速逆流色谱法的分离制备过程
先将固定相泵入 HSCCC, 流速可达 8mL/min,
待聚四氟乙烯线圈内充满固定相后 , 开动旋转 , 调
66
　第 3期 程　悦等:高速逆流色谱分离制备苦茶中的苦茶碱
转速至 800 r/min;再将流动相泵入 HSCCC, 流速
为 4 mL/min, 至流出流动相 , 上下相达到平衡后 ,
将 20mL样品溶液注入 HSCCC。流速调整为 2mL/
min, 转速为 800 r/min。紫外检测器的检测波长为
278 nm, 在此波长下检测并记录色谱图。流分由自
动接收器收集 , 每 2 min15 s收集一管。
1.7　HPLC检测分析
所得各流分经 HPLC检测后 , 减压回收溶剂
后 , 真空干燥得到粉末 。取各粉末及可可碱 、苦茶
碱和咖啡碱的标准品少量 , 加纯水溶解后进行
HPLC分析 , 采用峰面积归一化法计算其纯度 。
色谱柱:PhenomenexGeminiC18柱 (250 mm
×4.6 mmi.d., 5 μm, Waters公司), 保护柱:
PhenomenexSecurityGuard(Waters公司), 柱温为
28 ℃, 流动相为 v(乙腈)∶v(水) =20∶80,
等度洗脱 , 检测波长为 278 nm, 流速为 1.0 mL/
min, 进样量为 10μL。
2　结果与讨论
2.1　HSCCC溶剂体系的选择
因目标化合物为生物碱类化合物 , 根据文献
[ 13] 报道 , 分离生物碱成分常用的溶剂体系是正
己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 (或者乙醇 、 正丁醇) -
水体系及三氯甲烷 -甲醇 -水体系 。所以本实验分
别对溶剂系统:正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -蒸馏
水 、 正己烷 -二氯甲烷 -甲醇 -蒸馏水 、乙酸乙酯
-正己烷 -蒸馏水 、 乙酸乙酯 -二氯甲烷 -蒸馏
水 、二氯甲烷 -正己烷 -蒸馏水进行了筛选。
HSCCC两相溶剂系统选择应符合以下原则:
①溶剂不造成样品的分解和变性;②为保证固定
相保留值合适 , 溶剂体系的分层时间小于 30 s;
③目标样品在上下两相溶剂中分配均匀 , 分配系
数 K接近于 1;④上下两相体积大致相等 , 以免浪
费溶剂;⑤尽量采用挥发性溶剂 , 以方便后续处
理 , 易于物质纯化。
在不同组成比例的各个溶剂系统中 , 两相溶液
的平衡时间以及目标化合物在上相 、 下相中的分配
系数情况见表 1所示。正己烷 -二氯甲烷 -甲醇 -
水体系的 K2和 K3值十分接近而导致其不易分离 ,
其中只有体积比为 v(正己烷)∶v(二氯甲烷)
∶v(甲醇)∶v(水) =1∶5∶4∶2的 K2和 K3值较为
合适。正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水和乙酸乙酯 -
正己烷 -水体系的 K值较小将会导致出峰时间提
前 , 分离效果差 。而二氯甲烷 -正己烷 -水体系的
K1和 K2值均较小 。
除了 v(正己烷)∶v(二氯甲烷)∶v(甲醇)
∶v(水) =1∶5∶4∶2和乙酸乙酯 -正己烷 -水体系
的分层时间合适外 , 正己烷 -二氯甲烷 -甲醇 -
水 , 乙酸乙酯 -二氯甲烷 -水 , 二氯甲烷 -正己烷
-水和正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水体系的分层时
间过久或上下相体积比不理想 。
综合各种因素 , 溶剂系统 v(正己烷)∶v(二
氯甲烷)∶v(甲醇)∶v(水) =1∶5∶4∶2是最为理
想的 , 选定为 HSCCC的溶剂系统 。
表 1　溶剂系统的平衡时间及目标化合物在溶剂中的 K值
Table1　SetlingtimeofsolventsystemsandtheKvalues
溶剂系统 组成比例(体积比)
平衡时间 /s
ST1)0 ST1
上下相溶
剂体积比
目标化合物的 K值
1 2 3
正己烷 -二氯甲烷
-甲醇 -水
1∶5∶4∶2 16 20 1 4.81 1.01 0.77
1∶2∶2∶1 22 27 1.23 4.18 0.41 0.34
1∶4∶3∶2 18 27 1 2.97 0.62 0.54
1∶4∶4∶2 21 36 1.26 1.72 0.69 0.56
正己烷 -乙酸乙酯
-甲醇 -水
1∶4∶4∶2 35 36 0.13 0.077 0.10 0.15
1∶2∶2∶1 15 23 0.26 0.041 0.057 0.065
1∶1∶2∶1 14 55 0.29 0.026 0.021 0.027
1∶4∶2∶4 33 28 1.2 0.070 0.14 0.16
1∶2∶1∶2 30 32 1 0.051 0.69 2.56
1∶4∶2∶3 39 33 1.22 0.12 0.21 0.20
1∶5∶2∶4 43 37 1.18 0.11 0.21 0.24
乙酸乙酯 -正己烷 -水 1∶1∶2 8 8 1 0.013 0.035 0.161
乙酸乙酯 -二氯甲烷 -水 1∶1∶2 26 30 1 7.83 1.36 0.69
二氯甲烷 -正己烷 -水 1∶1∶2 31 40 1 0.007 0.35 1.02
　　1)ST0为加入样品前溶剂系统分层时间;ST1为加入样品后溶剂系统分层时间;1为可可碱;2为苦茶碱;3为咖啡碱
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中山大学学报 (自然科学版) 第 49卷　
2.2　HSCCC分离制备的结果
按 “ 1.6” 节操作 , 在 120　min内经 HSCCC
分离制备得到 3个流分 , 即图 2中的Ⅰ 、 Ⅱ 、 II。
图 2　苦茶氯仿萃取物的 HSCCC分离色谱图
Fig.2　HSCCCchromatogramofKuchaChloroformextract
2.3　HPLC检测分析
对高速逆流色谱所得到的流分 Ⅰ 、 Ⅱ、 II
(FractionⅠ 、 Ⅱ 、 II)进行检测分析 , 与可可碱 、
苦茶碱和咖啡碱的标准品对照所得 HPLC色谱图见
图 3。
图 3　HSCCC分离得到的 3个流分的 HPLC色谱图
Fig.3　HPLCchromatogramsofthreefractions
obtainedbyHSCCC
Fr.Ⅰ为可可碱 (5 mg, 收率 0.23%), HPLC
峰面积归一化法计算其纯度为 99.94%;Fr.Ⅱ为
苦茶碱 (389 mg, 收率 17.52%), HPLC峰面积归
一化法计算其纯度为 99.11%;Fr.Ⅲ为咖啡碱
(41 mg, 收率 1.85%), HPLC峰面积归一化法计
算其纯度为 99.58%。
2.4　苦茶碱的结构鉴定
2.4.1　熔点测定 　取 Fr.Ⅱ的结晶粉末在显微熔
点测定仪上测定熔点 3次 , 求平均值熔点测定结果
显示熔点为 226 ～ 229 ℃, 与文献 [ 3] 报道的苦
茶碱的熔点 (228 ℃)一致 。
2.4.2　核磁共振氢谱和碳谱分析 　取 Fr.Ⅱ的
CDCl3溶液进行 1HNMR和 13CNMR分析 , 信号归
属如表 2所示 , 1HNMR中 4个甲基峰信号符合苦
茶碱的结构 , 且化学位移值与文献报道的基本一
致 [ 3] 。13CNMR4个甲基碳 , 2个氮杂环烯碳 , 以及
3个羰基碳信号 , 均符合苦茶碱的结构 。
表 2　Fr.I的核磁共振氢谱 、
碳谱数据及归属 (CDCl3 , TMS)
Table2　 1HNMRand13CNMRdataofFr.Ⅱ
No.
1HNMRChemical
shift, δ
13CNMRChemical
shift, δ
1 153.4 (C6 =O, s)
2 151.7 (C2 =O, s)
3 150.5 (C8 =O, s)
4 99.3 (C5 =C, s)
5 96.1 (C4 =C, s)
6 3.72 (3H, N1 -CH3 , s) 31.7 (N1 -CH3 , s)
7 3.62 (3H, N7 -CH3 , s) 30.6 (N7 -CH3 , s)
8 3.57 (3H, N3 -CH3 , s) 29.4 (N3 -CH3 , s)
9 3.36 (3H, N9 -CH3 , s) 28.3 (N9 -CH3 , s)
2.4.3　质谱分析　对 Fr.Ⅱ进行质谱 (EI-MS)分
析 , 分子离子峰 M为 224, 其与 NIST质谱库中 1,
3, 7, 9-苦茶碱的标准质谱图基本一致。
通过熔点测定和1HNMR、13CNMR、 EI-MS分
析 , 证明从 HSCCC中分离制备得到的 Fr.Ⅱ为苦
茶碱。
3　结　论
应用高速逆流色谱法从苦茶中分离制备了 3个
嘌呤生物碱类化合物 , 分别为可可碱 , 苦茶碱和咖
啡碱 , 纯度均在 99%以上 , 其中 , 苦茶碱系首次
采用 HSCCC从苦茶中分离得到。与常规的柱层析
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　第 3期 程　悦等:高速逆流色谱分离制备苦茶中的苦茶碱
方法相比 , HSCCC简便 、 快速 、 节省溶剂和时间 ,
基本上实现了短时间内高纯度 、 高得率产品的制
备 , 具有较好的实际应用价值。此外 , 本方法所得
苦茶碱纯度高 , 可为其进一步的生物活性研究提供
必要的物质基础。
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