全 文 ：书·研究论文·
［基金项目］国家自然科学基金（编号：３０９６０５３１）；贵州省优秀青年科技人才培养计划（黔科合人字［２００９］２８号）；教育部科学技术研究重点项
目（编号：２１１１６６）；贵州省省长资金（中药专项）（黔省专合字（２０１０）１５３号）；贵州省中药现代化项目（黔科中药字［２０１２］５５１号）；贵阳市现代药
业计划项目（筑科合同［２０１１２０４］１７号）　［作者简介］沈祥春，男，博士后，教授，研究方向：心血管系统药物药理及中药民族药活性活，电话：
０８５１－６９０８１０８，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｅｎｘｉａｎｇｃｈｕｎ＠１２６．ｃｏｍ
艳山姜挥发油对氧化低密度脂蛋白诱导人脐静脉血管内皮细胞损伤及
一氧化氮合酶－一氧化氮的影响
沈祥春１，李万奎１，陶玲２　 （贵阳医学院药理研究室，贵州 贵阳５５０００４；２．贵阳医学院药剂学教研室，贵州 贵阳５５０００４）
［摘要］　目的：研究艳山姜挥发油对氧化低密度脂蛋白（ｏｘ－ＬＤＬ）诱导人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用及一氧化氮合酶－一
氧化氮（ＮＯＳ－ＮＯ）的影响。方法：体外传代培养人脐静脉内皮细胞，给予０．１μｇ·ｍＬ
－１和０．０１μｇ·ｍＬ
－１艳山姜挥发油孵育２４
ｈ后，加入１００μｇ·ｍＬ
－１　ｏｘ－ＬＤＬ作用２４ｈ诱导人脐静脉内皮细胞损伤模型，倒置相差显微镜及吉姆萨染色观察细胞形态学
变化，比色法分析细胞培养液ＮＯ的含量与细胞裂解液ＮＯＳ分型活力。结果：Ｏｘ－ＬＤＬ与人脐静脉内皮细胞作用２４ｈ后，细
胞胞膜皱缩，细胞数目减少，ｔＮＯＳ与ｅＮＯＳ活力显著降低，培养液ＮＯ含量降低。艳山姜挥发油显著改善细胞形态学变化，提
高细胞ｔＮＯＳ与ｅＮＯＳ活力及培养液中ＮＯ含量。模型组与艳山姜挥发油组均对ｉＮＯＳ未见显著影响。结论：艳山姜挥发油
对ｏｘ－ＬＤＬ诱导人脐静脉内皮细胞损伤具有保护作用，其保护作用与改善ｅＮＯＳ活力，提高ＮＯ水平相关。
［关键词］　艳山姜挥发油；人脐静脉内皮细胞；氧化低密度脂蛋白；一氧化氮合酶；一氧化氮
［中图分类号］Ｒ９６３　　［文献标识码］Ａ　　［文章编号］１００１－５２１３（２０１２）２４－１９３７－０４
Ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｏｉｌ　ｆｒｏｍ　Ｆｒｕｃｔｕｓ　Ａｐｌｉｎｉａｅ　ｚｅｒｕｍｂｅｔ（ＥＯＦＡＺ）ｏｎ　ＮＯＳ－ＮＯ　ｓｙｓ－
ｔｅｍ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｖｅｉｎ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｓ　ｉｎｊｕｒｙ（ＨＵＶＥＣｓ）ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｏｘｉｄｉｚｅｄ－ｌｏｗ　ｄｅｎｓｉｔｙ
ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ｏｘ－ＬＤＬ）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
ＳＨＥＮ　Ｘｉａｎｇ－ｃｈｕｎ１，ＬＩ　Ｗａｎ－ｋｕｉ　１，ＴＡＯ　Ｌｉｎｇ２（１．Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｚｈｏｕ
Ｇｕｉｙａｎｇ　５５００４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，Ｇｕｉｙａｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ｇｕｉｙａｎｇ　５５０００４，Ｃｈｉｎａ）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｏｉｌ　ｆｒｏｍ　Ｆｒｕｃｔｕｓ　Ａｐｌｉｎｉａｅ　ｚｅｒｕｍｂｅｔ（ＥＯＦＡＺ）ｏｎ
ｈｕｍａｎ　ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｖｅｉｎ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｓ（ＨＵＶＥＣｓ）ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｏｘｉｄｉｚｅｄ　ｌｏｗ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ｏｘ－ＬＤＬ），ａｎｄ　ｅｘｐｌｏｒｅ
ｔｈｅ　ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ＮＯＳ－ＮＯ　ｓｙｓｔｅｍ．ＭＥＴＨＯＤＳ　Ｔｈｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ＨＵＶＥＣｓ　ｗｅｒｅ　ｐｒｅ－ｉｎｃｕｂａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　０．１ａｎｄ
０．０１μｇ·ｍＬ
－１　ＥＯＦＡＺ　２４ｈ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｔｏ　ｏｘ－ＬＤＬ　２４ｈ．Ｔｈｅ　ｃｙｔｏ－ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｂｙ　ｉｎｖｅｒｔｅｄ
ｐｈａｓｅ　ｃｏｎｔｒａｓｔ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ａｎｄ　Ｇｉｅｍｓａ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｓｓａｙ．Ｔｈｅ　ＮＯ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｉｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ａｎｄ　ＮＯＳ　ｓｕｂｔｙｐｅ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ｃｅｌ　ｌｙｓｉｓ　ｗｅｒｅ
ａｓｓａｙｅｄ　ｂｙ　ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ　ｋｉｔｓ．ＲＥＳＵＬＴＳ　Ａｆｔｅｒ　ｅｘｐｏｓｕｒｉｎｇ　ｔｏ　ｏｘ－ＬＤＬ　ｆｏｒ　２４
ｈ，ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ａｎｄ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ＨＵＶＥＣｓ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｃｈａｎｇｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｐｈａｓｅ　ｃｏｎｔｒａｓｔ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ａｎｄ　Ｇｉｅｍｓａ
ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　ＮＯ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｉｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｅｃｒｅａｓｅ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，
ｔｈｅ　ｔＮＯＳ　ａｎｄ　ｅＮＯＳ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｃｅｌｕｌａｒ　ｌｙｓｉｓ　ａｓ　ｗｅｌ．Ｐｒｅ－ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＥＯＦＡＺ　ｗｈｉｃｈ　ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｄ　ｔｈｅ　ｃｙｔｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｉｎ－
ｃｒｅａｓｅｄ　ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ＨＵＶＥＣｓ，ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔＮＯＳ　ａｎｄ　ｅＮＯＳ　ｏｆ　ｃｅｌ　ｌｙｓｉｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ＮＯ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｉｎ
ｍｅｄｉｕｍ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｎｏ　ａｎｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｉＮＯＳ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗｈｅｔｈｅｒ　ｉｎ　ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ　ｏｒ　ｐｒｅ－ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＥＯＦＡＺ．
ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ　ＥＯＦＡＺ　ｃａｎ　ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ　ｔｈｅ　ＨＵＶＥＣｓ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｏｘ－ＬＤＬ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｍａｙｂｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｅｎｈａｎｃｅ－
ｍｅｎｔ　ｏｆ　ｅＮＯＳ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｃｅｌｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ＮＯ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．
ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ：ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｏｉｌ　ｆｒｏｍ　Ｆｒｕｃｔｕｓ　Ａｐｌｉｎｉａｅ　ｚｅｒｕｍｂｅｔ（ＥＯＦＡＺ）；ｈｕｍａｎ　ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｖｅｉｎ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｓ（ＨＵＶＥＣｓ）；ｏｘｉ－
ｄｉｚｅｄ　ｌｏｗ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ｏｘ－ＬＤＬ）；ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＮＯＳ）；ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ（ＮＯ）
　　贵州地产特色民族药艳山姜为姜科山姜属植物
干燥成熟果实，具有温中燥湿，行气止痛，截疟的功
效，民间广泛用于治疗心腹冷痛，胸腹胀满，消化不
良，呕吐腹泻等症状，目前已作为贵州地产民族药被
收录于２００３版《贵州省中药、民族药标准》［１］。但艳
山姜的化学成分和作用的现代研究甚少，目前仅见我
们课题组前期对艳山姜挥发油（ＦＯＦＡＺ）组分的分
析，及挥发油抗炎与对离体血管功能的药理作用的研
·７３９１·中国医院药学杂志２０１２年第３２卷第２４期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，２０１２Ｄｅｃ，Ｖｏｌ　３２，Ｎｏ．２４
DOI:10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2012.24.003
究报道［２］。国外对艳山姜叶的研究和报道主要集中
于高血压、动脉粥样硬化、抑制血小板聚集、调血脂、
抗炎、镇痛、抗氧化等等药理作用［３］。但国外对艳山
姜的研究主要以叶作为药用部位，这与民族药艳山姜
以果实入药完全不同。本研究基于以上研究背景，建
立ｏｘ－ＬＤＬ损伤脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）的体外模
型，探讨艳山姜挥发油的保护作用及可能机制。
１　材料
１．１　艳山姜制备及鉴定　药材艳山姜采自贵州省
贞丰县，经贵阳医学院生药学与药用植物学教研室
陈祖云教授鉴定为姜科山姜属植物艳山姜Ａｌｐｉｎｉａ
ｚｅｒｕｍｂｅｔ（Ｐｅｒｓ．）Ｂｕｒｔｔ　ｅｔ　Ｓｍｉｔｈ的干燥成熟果实，
其挥发油由本室制备，得率为１．３％。以气相色谱－
质谱联用（ＧＣ－ＭＳ）技术对挥发油的化学成分进行
分离分析。通过Ｎｉｓｔ９８和ｗｉｌｅｙ２７５．Ｌ谱库检索分
别鉴定各化学成分；经面积归一化法测定样品中的
各化学成分的相对百分含量。从艳山姜挥发油中分
离出了６２个化合物，鉴定了其中的５８个化合物，所
鉴定化合物的相对含量占挥发油总量的９９．０％。其
中β－水芹烯（１６．３９％）、α－蒎烯（１５．０６％）、１，８－桉叶
油素（１０．９６％）、莰烯（１０．１２％）、α－蒎烯（９．２８％）、
Ｌ－芳樟 醇 （４．０３％）、樟 脑 （３．６６％）、Ｏ－伞 花 烃
（３．３８％）、β－月桂烯（３．１９％）、Ｌ－龙脑（２．４５％）、石
竹素（１．７８％）、４－萜烯醇（１．７６％），以上１２个化合
物占鉴定总量的８２．０３％［４］。
１．２　试剂　氧化低密度脂蛋白（ｏｘ－ＬＤＬ，广州奕源
生物科技公司）；Ｍ１９９培养基、胰酶、特级胎牛血清
（ＧＩＢＣＯ公司）；一氧化氮合酶（ＮＯＳ）与一氧化氮
（ＮＯ）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Ｉ型胶原
酶、内皮细胞生长因子（ｓｉｇｍａ公司）。
２　方法
２．１　ＨＵＶＥＣ分离培养及传代［５－６］　将提前预热
３７℃、０．２５％的胰蛋白酶和０．１％的胶原酶混合消
化液（１∶１）注入健康足月产妇的脐静脉内，置于
３７℃水浴锅中孵育１０ｍｉｎ，收集脐静脉内的消化
液，重复３次，将消化液一并收集于离心管中，用预
冷的含２０％胎牛血清的 Ｍ１９９培养液终止酶活性，
１　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，弃上清，收集底层沉淀
物，加入含２０％胎牛血清的 Ｍ１９９培养基，用吸管
轻轻吹打均匀，接种于１００ｍＬ培养瓶，置于５％
ＣＯ２、３７℃培养箱中培养，２４ｈ后更换培养液去除
未贴壁的细胞，然后每隔２～３ｄ半量换液一次至细
胞生长融合。待细胞生长融合成单层细胞后，弃去
培养液，用无菌ＰＢＳ冲洗２次，加入０．２５％胰蛋白
酶适量，倒置显微镜下观察，当细胞回缩变圆后弃去
消化液，加入适量含２０％胎血清的 Ｍ１９９培养基终
止消化，用吸管吹打制成细胞悬液，按１∶２比例将细
胞悬液接种于培养瓶中，置于培养箱中培养。
２．２　检测前处理　实验采用生长良好的３～４代
ＨＵＶＥＣ，制成细胞悬液后，调整细胞浓度为２×１０４／
ｍＬ加入２４孔板。培养至细胞基本融合，换成无血清
的 Ｍ１９９培养液继续培养２４ｈ，使细胞同步化。实验
分为对照组、模型组、艳山姜挥发油０．１μｇ·ｍＬ
－１组、
艳山姜挥发油０．０１μｇ·ｍＬ
－１组。艳山姜挥发油采用
ＤＭＳＯ溶剂，ＤＭＳＯ终浓度为０．１％，对照组与模型组
给予终浓度为０．１％ＤＭＳＯ。各组给予相应溶剂或者
药物预先作用２４ｈ后，除对照组外，其余各组给予终
浓度为１００μｇ·ｍＬ
－１的ｏｘ－ＬＤＬ复制ＨＵＶＥＣ损伤模
型，２４ｈ后分析各指标。
２．３　细胞的形态学　细胞经相应因素处理后，相差
倒置显微镜下观察形态学变化。其后，细胞经ＰＢＳ
液漂洗２次，４％多聚甲醛固定３０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗３
次，吉姆萨染液中染色１０～１５ｍｉｎ，流水冲洗，自然
风干后观察［７］。
２．４　ＮＯ分析　细胞经过检测前预处理后，吸取培
养液，－２０℃冰箱保存，以备检测。ＮＯ检测利用
硝酸还原酶特异性将ＮＯ－３ 还原成ＮＯ－２ ，通过显色
深浅测定ＮＯ－２ 浓度的高低，具体操作根据试剂盒
说明书完成。
２．５　ＮＯＳ分析　各组细胞经检测前预处理后，预
冷ＰＢＳ洗涤３次，加入适量冰冷ＲＩＰＡ裂解液（使
用前每１００μＬ　ＲＩＰＡ裂解液加入１μＬ蛋白酶抑制
剂ＰＭＳＦ），吹打均匀，置冰上裂解３０ｍｉｎ，将各组细
胞裂解液分装于ＥＰ管中，４℃１２　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心
１０ｍｉｎ，吸取上清液转移至新的 ＥＰ 管中，置于
－２０℃备测。蛋白浓度采用ＢＣＡ法定量，ＮＯＳ分
型活性分析采用试剂盒法。
２．６　统计学处理　各组数据以均数±标准差（珚ｘ±
ｓ）表示，所有统计在ＳＰＳＳ　１１．５统计软件上完成，方
差齐性分析采用 Ｏｎｅ－Ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ法，两组间比
较采用ｔ检验，Ｐ＜０．０５为差异有显著性，Ｐ＜０．０１
为差异有极显著性。
３　结果
３．１　形态学观察　相差显微镜下，可见对照组细胞
为单层，呈铺石状镶嵌排列，细胞之间排列紧密，呈
多角形，边界清楚。经与ｏｘ－ＬＤＬ共同孵育后，细胞
间隙增宽，细胞收缩，胞膜皱缩，细胞边界不清，部分
细胞脱落。与ｏｘ－ＬＤＬ组比较，ＥＯＦＡＺ两剂量组细
胞间隙变小，结果见图１。ＨＵＶＥＣ经过吉姆萨染
色后，细胞核染成蓝紫色，胞浆染成浅红色，图２结
·８３９１· 中国医院药学杂志２０１２年第３２卷第２４期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，２０１２Ｄｅｃ，Ｖｏｌ　３２，Ｎｏ．２４
果提示：对照组细胞较为均匀，为典型的铺石状，细
胞之间排列紧密，胞质边界清楚，呈多角形，胞核居
中，呈卵圆形；与ｏｘ－ＬＤＬ共同孵育后，细胞间隙增
宽，细胞收缩，胞膜皱缩，形态不规则，部分细胞脱
落；与ｏｘ－ＬＤＬ组比较，艳姜山挥发油组经预处理，
细胞间隙变小，细胞形态趋近正常。提示１００μｇ·
ｍＬ－１　ｏｘ－ＬＤＬ作用于 ＨＵＶＥＣ　２４ｈ，导致内皮细胞
损伤，ＥＯＦＡＺ具有一定的保护作用。
图１　ＥＯＦＡＺ对ｏｘ－ＬＤＬ诱导 ＨＵＶＥＣｓ损伤的保护作用———倒置
相差显微镜观察（４０×）
Ａ．对照组；Ｂ．模型组（１００μｇ·ｍＬ－１ｏｘ－ＬＤＬ）；Ｃ．ＥＯＦＡＺ（０．１μｇ·
ｍＬ－１）＋ｏｘ－ＬＤＬ（１００μｇ·ｍＬ－１）；Ｄ．ＥＯＦＡＺ（０．０１μｇ·ｍＬ－１）＋
ｏｘ－ＬＤＬ（１００μｇ·ｍＬ－１）
Ｆｉｇ　１　Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＥＯＦＡＺ　ｏｎ　ＨＵＶＥＣｓ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ
ｂｙ　ｏｘ－ＬＤＬ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｐｈａｓｅ　ｃｏｎｔｒａｓｔ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（４０×）
Ａ．ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；Ｂ．ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ（１００μｇ·ｍＬ－１ｏｘ－ＬＤＬ）；Ｃ．ＥＯ－
ＦＡＺ（０．１μｇ·ｍＬ－１）＋ｏｘ－ＬＤＬ（１００μｇ·ｍＬ－１）；Ｄ．ＥＯＦＡＺ（０．０１μｇ
·ｍＬ－１）＋ｏｘ－ＬＤＬ（１００μｇ·ｍＬ－１）
图２　ＥＯＦＡＺ对ｏｘ－ＬＤＬ诱导 ＨＵＶＥＣｓ损伤的保护作用———吉姆
萨染色（１００×）
Ａ．对照组；Ｂ．模型组（１００μｇ·ｍＬ－１ｏｘ－ＬＤＬ）；Ｃ．ＥＯＦＡＺ（０．１μｇ·
ｍＬ－１）＋ｏｘ－ＬＤＬ（１００μｇ·ｍＬ－１）；Ｄ．ＥＯＦＡＺ（０．０１μｇ·ｍＬ－１）＋
ｏｘ－ＬＤＬ（１００μｇ·ｍＬ－１）
Ｆｉｇ　２　Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＥＯＦＡＺ　ｏｎ　ＨＵＶＥＣｓ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ
ｂｙ　ｏｘ－ＬＤＬ（Ｇｉｅｍｓａ　ｓｔａｉｎｉｎｇ）（１００×）
Ａ．ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；Ｂ．ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ（１００μｇ·ｍＬ－１ｏｘ－ＬＤＬ）；Ｃ．ＥＯ－
ＦＡＺ（０．１μｇ·ｍＬ－１）＋ｏｘ－ＬＤＬ（１００μｇ·ｍＬ－１）；Ｄ．ＥＯＦＡＺ（０．０１μｇ
·ｍＬ－１）＋ｏｘ－ＬＤＬ（１００μｇ·ｍＬ－１）
３．２　ＥＯＦＡＺ对ｏｘ－ＬＤＬ诱导 ＨＵＶＥＣ损伤ＮＯＳ－
ＮＯ的影响　ＨＵＶＥＣ与１００μｇ·ｍＬ
－１　ｏｘ－ＬＤＬ共
同孵育２４ｈ，细胞ｔ－ＮＯＳ与ｅＮＯＳ活力显著降低，
与空白对照组比较，差异显著。ＥＯＦＡＺ显著改善
ｏｘ－ＬＤＬ所致ｔ－ＮＯＳ与ｅＮＯＳ活力的降低。ｏｘ－ＬＤＬ
作用于 ＨＵＶＥＣ　２４ｈ，细胞培养液中ＮＯ含量显著
降低，ＥＯＦＡＺ预处理后，显著提高细胞培养液中
ＮＯ的含量。ｉＮＯＳ活力各组未见显著性差异，提示
ｏｘ－ＬＤＬ作用于 ＨＵＶＥＣｓ　２４ｈ，主要影响ｅＮＯＳ，而
ｉＮＯＳ未见显著性影响。结果见表１和表２。
表１　ＥＯＦＡＺ对ｏｘ－ＬＤＬ诱导 ＨＵＶＥＣｓ损伤细胞裂解液
ＮＯＳ活性的影响（珚ｘ±ｓ，ｎ＝５）
Ｔａｂ　１　Ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｄ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＥＯＦＡＺ　ｏｎ　ＮＯＳ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ
ＨＵＶＥＣｓ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｏｘ－ＬＤＬ（珚ｘ±ｓ，ｎ＝５）
组别
剂量
／μｇ·ｍＬ－１
ｔＮＯＳ　 ｉＮＯＳ　 ｅＮＯＳ
（Ｕ·ｍｇ－１·ｐｒｏｔ）
对照组 － ６．３５±０．４２　 ０．８３±０．１０　 ５．５５±０．４２
模型组 １００　 ４．１３±０．５０ａ ０．７４±０．６２　 ３．３９±０．４６ａ
ＥＯＦＡＺ　 ０．１　 ６．１３±０．４９ｃ　 ０．７９±０．１１　 ５．３４±０．４２ｃ
０．０１　 ５．０７±０．３８　 ０．７２±０．０９　 ４．３５±０．３６ｂ
注：与对照组比较，ａＰ＜０．０１；与模型组比较，ｂ　Ｐ＜０．０５，ｃ　Ｐ＜０．０１
表２　ＥＯＦＡＺ对ｏｘ－ＬＤＬ诱导 ＨＵＶＥＣｓ损伤细胞培养液
ＮＯ水平的影响（珚ｘ±ｓ，ｎ＝５）
Ｔａｂ　２　Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ＮＯ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｉｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｆ　ＥＯＦＡＺ　ｏｎ
ＨＵＶＥＣｓ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＯＸ－ＬＤＬ（珚ｘ±ｓ，ｎ＝５）
组别 剂量／μｇ·ｍＬ－１　 ＮＯ／μｍｏｌ·Ｌ－１
对照组 － １２４．２４±１２．１２
模型组 １００　 ９１．２３±２．８１ａ
ＥＯＦＡＺ　 ０．１　 １１４．９９±１６．７２ｂ
０．０１　 １０１．１６±９．６０ｂ
注：与对照组比较，ａＰ＜０．０１；与模型组比较，ｂ　Ｐ＜０．０５
４　讨论
内皮细胞损伤被认为是促使动脉粥样硬化的早
期关键环节，也是多种血管疾病发病和治疗的靶细
胞［８］。
ＮＯ是体内强大的血管舒张因子，对 ＡＳ病理
形成和发展具有阻抑作用［９］。但是，ＮＯ对人体具
有“双刃剑”的作用，合成过多或过少对机体都有损
伤作用：ＮＯ合成过多对细胞、组织有毒性作用；ＮＯ
水平下降不仅使血管舒张异常，而且其抗平滑肌增
殖、抑制血小板凝集作用也减弱，促进血管内血栓的
形成，加速ＡＳ的发展［１０］。
ＥＣ通常存在两种 ＮＯＳ，即ｅＮＯＳ和ｉＮＯＳ，
ｅＮＯＳ产生基础状态的ＮＯ，抑制平滑肌细胞增殖及
向血管内膜下迁移；抑制血小板黏附及聚集功能，阻
止血栓形成；抑制脂质过氧化及氧自由基的产生，使
细胞免受超氧阴离子损伤［１１］。而ｉＮＯＳ在正常情
况下表达很少甚或不表达，但在炎症刺激时可高表
达而产生大量 ＮＯ，ＮＯ与超氧阴离子结合可形成
·９３９１·中国医院药学杂志２０１２年第３２卷第２４期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，２０１２Ｄｅｃ，Ｖｏｌ　３２，Ｎｏ．２４
氧化度更高的亚硝基负离子，对ＥＣ有更强的损伤
作用。
Ｏｘ－ＬＤＬ很大程度上影响了 ＮＯ的合成，低剂
量的ｏｘ－ＬＤＬ可显著抑制ｅＮＯＳ继而抑制ＮＯ的合
成，但随着时间及浓度升高，ｏｘ－ＬＤＬ对ＥＣ的损伤
作用加重，从而激活ｉＮＯＳ，使ＮＯ的生成增加，并与
更多的超氧阴离子结合，加剧对ＥＣ损害。因此在
本实验中，ｏｘ－ＬＤＬ作用于 ＥＣ后，ＮＯ生成减少、
ｔＮＯＳ及ｅＮＯＳ活性降低，而对ｉＮＯＳ活性影响不
大，可能是由于ｏｘ－ＬＤＬ对ＥＣ的损害尚未诱导ｉＮ－
ＯＳ激活，而仅仅抑制ｅＮＯＳ活性的抑制的程度
上［１２］。而ＥＯＦＡＺ作用后，可增加 ＮＯ生成、提高
ｔＮＯＳ及ｅＮＯＳ活性，提示 ＥＯＦＡＺ对通过改善
ｅＮＯＳ－ＮＯ系统而对ｏｘ－ＬＤＬ诱导 ＨＵＶＥＣｓ产生
保护作用。
参考文献：
［１］　贵州省药品食品监督管理局．贵州省中药材、民族药材质量标
准［Ｍ］．贵州科技出版社，２００３：２９２．
［２］　陶玲，肖婷婷，胡涵帅，等．艳山姜果实挥发油对离体家兔胸主
动脉条收缩性能的影响［Ｊ］．中国医院药学杂志，２０１０，３０
（２３）：１９６６－１９６９．
［３］　陶玲，沈祥春，彭佼，等．艳山姜挥发油抗炎镇痛作用的实验研
究［Ｊ］．中国医院药学杂志，２０１０，３０（９）：７２２－７２４．
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［收稿日期］２０１２－０５－２１
［基金项目］广西科学基金项目（编号：桂科青０５４２０４２）　［作者简介］兰顺，男，学士，副主任药师，研究方向：临床药学及药动学，电话：０７７１－
２１８６３５０，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌａｎｓｈｕｎ８８９＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ　［通讯作者］孙可，男，副主任医师，研究方向：骨关节手术，电话：０７７１－２１８６５６４，Ｅ－ｍａｉｌ：ｋｅｎｎｙ３３６６＠
ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
止血带对克林霉素在兔骨组织中分布的影响
兰顺，孙可，叶冬梅　 （广西壮族自治区人民医院，广西 南宁５３００２１）
［摘要］　目的：建立高效液相色谱法测定兔骨组织中的克林霉素，并对其在使用止血带后，在骨组织的分布特征进行研究。
方法：以乙腈－四氢呋喃－磷酸盐缓冲溶液（３０∶１∶７０，ｐＨ　５）为流动相，柱温４０℃；流速０．８ｍＬ·ｍｉｎ－１；以替硝唑为内标，以Ｌｕｎａ
Ｃ１８柱 （２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ）进行分离，检测波长为２０５ｎｍ。测定静脉注射克林霉素（２０ｍｇ·ｋｇ
－１）后３０，６０，９０，１２０ｍｉｎ
（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）上止血带分别阻断血液循环３０，６０，９０ｍｉｎ实验组与未止血对照组的骨组织中药物含量。结果：克林霉素在１０．５８
～２６４．５μｇ·ｍＬ
－１范围内线性关系良好，日内ＲＳＤ≤２．１７％，日间ＲＳＤ≤２．９９％。实验组克林霉素含量与对照组比较，差异有
极显著性（Ｐ＜０．０１）；相同止血时机，不同止血时间３０，６０，９０ｍｉｎ组之间比较，无显著性差异（Ｐ＞０．０５）；不同止血时机组，Ａ
组与Ｂ、Ｃ、Ｄ组比较差异有极显著性（Ｐ＜０．０１），Ｂ、Ｃ、Ｄ组骨组织的克林霉素含量较高，３组之间差异无显著性（Ｐ＞０．０５）。
结论：方法准确可靠、简便、重现性好，上止血带组骨组织中克林霉素含量明显低于无止血带组，止血时机是影响克林霉素骨
组织分布的主要因素。
［关键词］　克林霉素；止血带；高效液相色谱法；骨组织
［中图分类号］Ｒ９４　　［文献标识码］Ａ　　［文章编号］１００１－５２１３（２０１２）２４－１９４０－０４
Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｏｕｒｎｉｑｕｅｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ　ｉｎ　ｂｏｎｅ　ｔｉｓｓｕｅ
·０４９１· 中国医院药学杂志２０１２年第３２卷第２４期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，２０１２Ｄｅｃ，Ｖｏｌ　３２，Ｎｏ．２４