全 文 ：第 3期
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湖 南 农 孚 院 学 报
J o u r n a l o f H u n a n A g r i e u l t u r a l C o l l e g e
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3
了9 8〕
利用同工酶技术对江华苦茶等五个茶树品种亲缘关系的研究初报`
谭淑宜 朱尚同 龚范武
育种工 作中常以性状来鉴定种间和种内的关系 。 按照中心法则 : D N A产 生 m R N A , m R
N A 产生酶蛋 白 , 蛋 白质控制了代谢类型 , 最后表现为性状 及功能的差 异 。 同工酶的差 异 主
耍来源于基因的差异 。 对同工酶的分析 , 可以间接 考察基因的存在和表达方式 , 从 分子水平
上鉴别许多从外 部形态上难以鉴别或判断的遗传变异 , 为研究种 类变异及其地 理分布和起源
中心提供新途径 , 也为鉴定品种的生态型和对品种分类提供可 靠的指标 。
日本农业技术研究所 , 曹从 亚洲各地搜集了大 量水稻地方品种 , 通过对这许多品种醋酶同
工酶的分析 , 研究了栽培稻种的起源和传播途径 。 近年来又用这一技术探讨 了小麦的亲缘关
加 系和进化等问题 。 茶树上亦 已利用醋酶同工酶的分析研究一 些茶树群体品种的亲缘关系 , 以
及由于茶树长期栽培 , 扩大分布地区而引起的遗传变异 。 这一工作将会使茶树分类的方法 ,
得到很大的发展和改进 。
1 9 51 一 19 82 年 , 我们采用聚丙烯酞胺垂直平板电泳法分离我省江华苦茶 、 饶平水 仙 、 云南
大叶 、 储叶齐 、 湘波绿中的醋酶 、 多酚氧化酶和过氧化物酶三种酶的同工酶 。 试图研究苦茶
与其他 四个品种的亲缘关系 。
垂道平板电泳的优点是 , 各试验样品在同一块凝胶板上电泳展 开 , 其条件此圆盘凝胶电
泳更加一致 , 便于比较其酶带迁移率 , 从而在同一 条件下 , 找出各样品之间的差 异 。
材 料 和 方 法
一 、 供试材料
是从湖南省茶叶研究所茶园中选择具有典型性状的江华苦茶 , 饶平水仙 、 云南大叶 、 林
叶 齐、 湘波绿等五个品种的成年植株作为材料 。
二 、 材料处理
分别取春 、 夏 、 秋茶一茅二叶鲜叶 2 . 0克 , 加不溶性聚乙烯毗咯 烷 酮 0 . 5一 1克 , p H 7 . o
的柠檬酸磷酸缓冲液 50 毫升 ,在低温下捣碎成匀浆 , 离心 5 分钟 ( , 。。。转 /分钟 ) , 取 卜清液
作同工酶分析 。
有 -一 -- -一 -一 -一— 一 - -一 - -一 - - 一一铃 本研究系陈兴块教授主持的 <江 华苦茶生理 生化 研完 》 课题的一 部分 。 研 究中有关凝
胶 电泳方法 , 曾得到生化教研室 罗泽 民副教授的指 导 , 特此致谢 。
“ 湖 南 农 学 院 学 报 1” ,年
一—— - - - - -一 - - -一 - - 一一—— 一—— -一一 - - - - - -一— 玲三 、 方 法1 . 灌胶 : 取 2 0 x Z。厘米的玻璃板两块 ( 其中一块的一端呈凹形 ) , 在左 、 右 、 下三方
边沿处 , 用淀粉糊或琼脂糖将它们粘合 。 同时在三方边沿处各用一块 。 . ,厘米厚 , 20 厘米长 ,
0
.
2厘米宽的有机玻璃片垫平 , 用夹子夹紧。 然后从 两块 粘合着的玻玻板之间注入分离 胶 溶
液 , 立即加入 0 . ,厘米左右高的蒸馏水层 , 使分离胶成水平 。 待分离胶聚合凝固后 , 倒 出 蒸
馏水再注入上层胶 ( 粗孔胶 ) 拜立即插入一 把有机玻璃的梳状物 。 待粗孔胶凝固后 , 取出梳
状物 , 粗孔胶即被梳状物分成若干个凹形间隔 ( 此间隔即是注入样品的地方 ) 。
2
. 电泳 分离: 准备一个 直流稳压 电泳仪 , 一个垂直平板电泳槽 , 取下 已做好的胶板 ,
小心把下端边沿处的有机玻碑垫片取出 , 把靠凹形玻璃的一面与电泳槽板面粘合夹紧 , 在粗
孔胶的凹形间隔处用微量注射器注入各种被测样品液 s0 微升 , 再加入等体积的 40 拓蔗糖溶液
然后加入 。 . 01 拓嗅酚 兰溶液一滴 ( 与园盘电泳点样相同 ) , 在电泳槽的上 、 下槽 注入 p H S . ,
的 T ir s一 甘氨酸缓冲液 , 放入冰箱在 O 一 4 ℃条件上电泳 3 一 4 小时 , 至澳酚兰下移线到
离下端边缘 2 厘米 处时将凝胶 片取出 , 放入瓷盘准备染色 。
3
. 显 色 :
过氧化物酶染色 : 用 0 . 25 拓联苯胺溶液 1 0毫升 + 0 . , 多的过氧化氢溶液 5 毫升 , 混 匀 后
稀释至 50 毫升 , 染色 10 分钟左右 , 出现蓝色的谱带 , 用蒸馏水冲洗后酶带变成 褐色 。
多酚氧化酶染色 : 用 1 , 儿茶酚溶液三份 , o . 05 M磷酸 缓 冲 液 ( p H 6 . 8 ) 一份 , 口. 06 % 神
对苯二胺溶液一 份混匀染色 , 1一 1 . 5小时后 , 再 用乙醇 ,水 ,醋 酸 ( r :0 1 5 : 15 ) 溶液洗涤 出
现红棕色的酶带 , 然后 用蒸馏水冲洗 。
醋酶染色 : 取 50 毫克醋酸 a 一蔡酷 + 50 毫克醋酸 卜蔡醋 + 3 一 5 毫升丙酮 ( 溶后 ) + 坚
牢蓝 R R盐 , o毫克 + 磷酸缓冲液 5 0毫升 , 在 3 7℃条件下染色 20 一 25 分钟 , 出现紫红色的谱带 ,
即用蒸馏水 漂洗 。
试 验 结 果
江华苦茶 、 饶平水 仙 、 云南大叶 、 储叶齐 、 湘波绿五个茶树品种的三种同工酶均有各 l’J
独特的谱带 , 如酶带数 目 , 酶带色泽 , 迁移率 , 酶带类型都不同 。 醋酶同工酶的酶带 数 目 6
一 8 条 ; 多酚氧化酶的酶带数 目 5 一 7 条 , 过氧化物酶的酶带数目 5 一 7 条 ( 见图 1 、 2 、
3 )
。
一 、 不同茶树品种新梢三种醉的同工醉的区别
1
. 红华苦茶及共他四个品种的醋酶同工酶带类型基本相似 , 但也有 区别 。 _丘个品种共
计有八条不 同的同工酶谱带 ( 分别编号为 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6 、 7 、 8 ) , 江华苦茶 、
饶平水仙 、 云南大叶三个品种酷酶同工酶谱带是完全一样的 。 都是六条 ( 1 、 2 、 4 、 5 、
7
、
8 ) ; 柿叶齐除上述六 条外 , 还多一 条 ( 6 ) ; 湘波绿在五个品种中酷酶谱带最多 , 比
储叶齐还多一条 ( 3 ) 共有八条 。 1 、 2 、 4 、 5 、 7 、 8 六条谱带是五个品种共同的 i普带 .
似乎是他们的基本谱带 ( 图 2 ) 。
2
. 江华苦茶及其他四个品种共出现七条多酚氧 化 酶 带 ( 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6 、
第 3 期 谭淑宜等 利用同工酶技术对江华苦茶等五个茶树品种亲缘关系的研究初报 “
7 )
。 其中江华苦茶与饶平水 仙的谱带完全相同 , 均为五条 ( 1 、 2 、 4 、 5 、 6 ) ; 云南
大叶种比江华苦茶和饶平水仙多 了一条 ( 3 ) : 储叶齐和湘波绿多酌氧化酶同工酶带也完全
相同 , 亦为五条 ( 2 、 4 、 5 、 6 、 7 ) 。 储叶齐和湘波绿与其余三个品种相此较 , 它们少
了第 1 条带 , 而多出第 5 条带 。 五个品种的共同谱带有 四条 ( 2 、 4 、 6 、 8 ) ( 图 2 ) 。
3
. 江华苦茶及共他四个品种中共有七条过氧化物酶同工 酶 谱 带 ( 1 、 2 、 3 、 4 、
5
、
6
、
7 )
。 其中江华 苦茶 、 饶平水仙和云南大叶种有完全相 同的过氧化物酶同 工 酶 带
( 1
、
2
、
3
、
4
、
5
、
6
、
7 )
, 储叶齐缺少第 2 条带 , 湘波绿缺少第 1 、 2 两条带 、 五
个品种的共同谱带是五条 ( 3 、 4 、 5 、 6 、 7 ) ( 图 3 ) 。
二 、 茶苗不同铃官 中菌醉同工醉带的差异
分别取储叶齐品种苗期的叶片 、 茎杆 、 根进 行酷酶同工酶分析结果是叶片中有 七 条 酶
带 , 茎杆中只有六条 , 个别谱带 的迁 移率与叶片中不相同 , 而在 根中没有发现酷酶同工酶带
( 图 4 ) 。
三 、 不同茶季 . , 秋三种醉的同工酶变化
五个品种的三种酶的同工酶 , 都是夏茶比较容易分离 , 得到比较清晰 、 着色深的谱带 。
1
. 酉旨酶的同工酶在春 、 夏 、 秋三季茶中 , 其谱带类型 、 数 目、 迁移率均相当稳定 ( 图
朴 1 、 5 、 r o ) 。
2
. 多酚氧化酶同工酶 , 只要样品新鲜 , 各季茶中都会出现相对稳定的酶谱带数 目 , 但
夏茶谱带稍多 ( 图 2 、 6 、 7 ) 。
3
. 过氧化物酶同工酶 , 在春 、 夏 、 秋茶 中差异稍大 , 酶带数目夏季多于秋季 , 秋季多
由春季 。 夏茶中有些品种有 7一 8条带 , 春茶中只有 4 一 5 条带 ( 图 3 、 8 、 9 ) 。
讨 论
一 、 江华苦茶等五个品种醋酶同工酶八条谱带中 , 有六条是完全一样的 ; 多酚氧化酶同
工酶七 条酶带中有四条是相同的 ; 过氧化物酶同工酶七条谱带中有五条是相同的 。 即 同一酶
的同工酶谱带的重复出现率高 , 似乎可以说明这五个品种有共同的原 产地起源 , `色们拜没有
重大的分化 , 而差 异则仅仅是 由于各地扩种后长期定植 , 因环境条件的影响而 形成 了一定变
异。
二 、 江华苦茶等五个品种中 , 江华苦茶和饶平水 仙两个品种的酷酶 、 多酚氧化酶的同工
酶谱带完全相同 ( 包括酶带数 目 , 酶谱迁移率 , 酶带类型等 ) , 云南大叶种与江华苦茶和饶
平水仙相此 , 仅只 是多酚氧化酶的同工酶上多一条酶带 , 而醋酶和过氧化物酶的同工酶则完
全一样 , 储叶齐 , 湘波绿两品种具有迁移率完全相同的多酚氧化酶同工酶谱带 , 醋酶谱带 也
相近 。 因 此 , 储叶齐 , 湘波绿可看作是亲缘关系更为接近的一组 , 而江华苦茶 、 饶平水仙 、
云南大叶可看成 另一组 , 两组之间的差 异此组内的差异显著 , 从 这种现象似乎可 认为汀华苦
. 茶饶平水仙和云南大叶三品种 同属于一变种 , 或可以将江华 苦茶和饶平水仙作为一变 种 , 而
将云南大叶单独作为一变种。 至于柿叶齐和湘波绿则同属另一变种 , 目前许 多人常 J月的分类
方法 , 和这一实验结果是大体一致的 。
“ 湖 南 农 孚 院 学 报 沙9 8 少年
三 、 茶根中没有检出酷酶的同工酶 , 有可能是茶根中拜不存在酩酶 , 但这一点有待重复
验证 。 过氧化物酶同工酶因季节不同 , 酶带数 目变化很大 , 这和其他作物有共同之处 , 可能
与过氧化物酶是一条肤链组成 , 当等位基因发生变异时 , 即可能产生新的同工酶 。
四 、 实验中 , 无论在春茶 、 夏茶 、 秋茶中 , 同一个品种 , 同一植株部位的酷酶同工酶带
数目、 类型 、 迁移率都一致 。 而同一品种不 同器官 ( 根 、 茎 、 叶 ) 的酪酶同工酶则有明显的
差异 。 说明同工酶与茶树生长和分化的关系十分密切 , 由于特定 的新酶的合成可以视为细胞
分化的特征 ; 而且早已证实同工酶能在细胞的形态分化之前 , 既表现出生化上的细微差 异 。
因此 , 无论是研究品种的亲缘关系还是研究茶树的代谢 、 分化 , 西胃酶同工酶都可作为有效的
生化指标 。
参 考 文 献
( 1 〕李名君 , 19 8口, 茶多酚氧化酶同工酶 , 中国茶叶 ( 2 ) : 朽一 2 0
〔 2 ) 刘维华 , , s9 。 , 用聚丙烯酞胺凝胶盘状电泳分离茶多酚氧化酶 , 中国茶叶 ( 5 )刀一 , 2。
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( 4 〕梅慧生 , 19 51 , 植物同工酶研究的某些进展 , 植物生理学通讯 ( 3 ) : 1一 7。
( 5 〕陆士绵等 , 1 9 8 2 , 利用酷醋同工酶测定杂交水稻杂种纯度的研究 , 中国农业科学
( 5 )
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〔 6 〕 K a o r u N a g a t o a n d K e n I e h i o s o n e , r 9 8 2 , v a r i a t i o n o f E s t e r a s e x s o z y m e i n
T e a P l a n t
, 《 J a p a n e s e J o u r n a l o f B r e e d i n g 》 了2 ( 2 ) : 1 5 6一 16 5 .
第 3期 谭淑宜等 利用同工酶技术对江华苦茶等五个茶树品种亲缘关系的研究初报 ` 7
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