全 文 ：书第 31 卷 第 8 期
2 0 1 3 年 8 月
中 华 中 医 药 学 刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 31 No． 8
Aug． 2 0 1 3
博
士
导
师
新
论
中
华
中
医
药
1573
学
刊
蕨麻正丁醇部位抑制缺氧损伤心肌细胞凋亡
及 Caspase 3 /9 表达
李灵芝1，2，韦薇1，龚海英1，李建宇1，郭鹏1，张永亮1，2
(1．武警后勤学院，天津 300162;2．天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室，天津 300162)
摘 要:目的: 研究蕨麻正丁醇部位对缺氧损伤心肌细胞凋亡及 Caspase 3、Caspase 9 表达的抑制作用。方
法: 建立大鼠原代培养心肌细胞缺氧模型，HE染色观察细胞组织形态，PI － Hochesst3342 染色观察细胞凋亡，ＲT
－ PCＲ技术及免疫细胞化学染色方法检测细胞 Caspase 3、Caspase 9 mＲNA 及其产物蛋白水平。结果: 与模型组
比较，正丁醇部位各剂量组 Caspase 3、Caspase 9 mＲAN表达水平均显著降低( P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) ; 高剂量组
Caspase 3、Caspase 9 蛋白水平显著降低( P ＜ 0. 01) 。结论: 蕨麻正丁醇部位可能通过减弱缺氧诱导的心肌细胞
Caspase级联反应，抑制心肌细胞凋亡。
关键词:蕨麻;缺氧;细胞凋亡
中图分类号:Ｒ542． 2 文献标志码:A 文章编号:1673 － 7717( 2013) 08 － 1573 － 03
Effect of N － butanol Potentilla Anserine L． Fraction on Expressions of Caspase 3
and Caspase 9 in Cardiomyocyte Injured by Hypoxia
LI Lingzhi1，2，WEI Wei1，GONG Haiying1，LI Jianyu1，GUO Peng1，ZHANG Yongliang1，2
(1． Logistical University of Chinese People＇s Armed Police Forces，Tianjin 300162，China;
2． Tianjin Key Laboratory of Occupational and Environmental Hazards Biomarkers，Tianjin 300162，China)
Abstract:Objective:To study the inhibting effect of the n － butanol Potentilla anserine L． fraction on the apoptosis
and the expressions of Caspase 3 and Caspase 9 of cardiomyocyte injured by hypoxia． Methods:To develop a model of
cardiomycyte injured by hypoxia in rats in vitro． The pathology changes and the apoptosis of cardiomycytes were observed
separately by HE staining and PI － Hoechst3342． The expression levels of Caspase3 and Caspase9 mＲNAs in the cardio-
mycytes were studied by reverse transcription polymerase chain reaction(ＲT － PCＲ)． The localizations and levels of their
product proteins in the cardiomycytes were investigated by immunocytochemistry stain． Ｒersult:Comparing with model
group，the pathology changes were improved by the n － butanol Potentilla anserine L． fraction and the number of apoptotic
cardiomycytes was reduced． After treated with different doses of n － butanol Potentilla anserine L． fraction，the expres-
sion levels of Caspase 3 and Caspase 9 mＲANs in cardiomyocytes significantly decreased(P ＜ 0. 05 or P ＜ 0. 01)． The
contents of their product proteins significantly decresed in the high dose group(P ＜ 0. 01)． Conclusion:The n － butanol
Potentilla anserine L． fraction exerts a remarkably inhibiting effect on cardiomyocyte during hypoxia and this may be relat-
ed with its effect of attenuating Caspase cascade reaction and inhibiting the apoptosis．
Key words:Potentilla anserine L．;hypoxia;apoptosis
收稿日期:2013 － 04 － 02
基金项目:国家自然科学基金资助项目(81073152) ;天津市应用基
础 及 前 沿 技 术 研 究 计 划 重 点 资 助 项 目
(10JCZDJC21100) ;中 国 博 士 后 基 金 资 助 项 目
(20100470106)
作者简介:李灵芝(1963 －) ，女，教授，博士研究生导师，博士，研究
方向:抗缺血缺氧药物研究。
通讯作者:张永亮，男，教授，硕士研究生导师，博士，研究方向:抗
缺血缺氧药物研究。E-mail:zhang78127@ tom． com。
研究表明，蕨麻可显著提高机体对氧的利用率，具有明
显的抗缺氧作用［1 － 2］，我们研究发现蕨麻乙醇提取物能延
长小鼠窒息性缺氧和异丙肾上腺素致特异性心肌缺氧状态
下的存活时间，提高小鼠在减压缺氧状态下的存活率，并能
抑制氧自由基对红细胞的氧化作用［3］，且对慢性缺氧小鼠
心肌也具有保护作用［4］。其正丁醇部位对垂体后叶素所
致小鼠急性心肌缺血损伤及体外培养心肌细胞缺氧损伤具
有显著保护作用［5 － 6］。本文进一步研究了蕨麻正丁醇部位
对缺氧心肌细胞凋亡相关基因 Caspase 3、Caspase 9 mＲNA
第 31 卷 第 8 期
2 0 1 3 年 8 月
中 华 中 医 药 学 刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 31 No． 8
Aug． 2 0 1 3
中
华
中
医
药
1574
学
刊
及蛋白水平的影响，探讨其对心肌缺氧损伤的保护机制。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 实验动物、药品与试剂 选用新生 1 ～ 3 d SD 乳
鼠，雌雄兼用，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物
中心提供。蕨麻购自青海，蕨麻正丁醇部位由本室制备
(每克相当于蕨麻生药 10 g)。阳性对照药取复方丹参滴
丸按照《中华人民共和国药典》(2010 版)方法制备。胰蛋
白酶和噻唑兰(MTT)购自北京鼎国生物技术开发中心;
DMEM/F －12培养基购自 Gibco公司;乳酸脱氢酶(LDH)试
剂盒购自南京建成生物工程公司。浓缩型兔 Caspase 3 和
Caspase 9多克隆抗体购自武汉博士德公司;SP 免疫组化染
色试剂盒及 DAB均购自北京中杉生物工程公司。Trizol 试
剂、Caspase9、Caspase3和 β － actin引物购自 Invitrogen公司;
d NTP Mixture 购自 TaKaＲa 公司，Oligo(dt)15 Primer、M －
MLV Ｒeverse Transcriptase和 Go Tag Flexi DNA Polymeras 购
自 Promega公司，DNA Marker I购自天为时代公司。
1． 1． 2 主要仪器 Forma 3111 型 CO2培养箱(美国) ;Ni-
kon TS100 倒置相差显微镜(日本) ;Galaxy － Ｒ 混合气体培
养箱(英国) ;Bio － Ｒad 680 酶标仪(美国) ;UV － 1601 紫外
可见分光光度计(日本) ;PCＲ 仪(美国) ;核酸定量仪(德
国) ;凝胶成像分析系统(美国)。
1． 2 方法
1． 2． 1 原代培养心肌细胞缺氧模型建立及实验分组 取
新生 1 ～ 3 d的 SD 乳鼠心室肌剪成约 1 mm3组织块，按文
献［7］方法分离纯化心肌细胞培养 4 d后，换无血清 DMEM/
F － 12 培养基于 37 ℃、5% CO2连续培养 24 h，用预先以
95% N2 ～ 5% CO2混合气饱和的 D － Hank’s液替代正常培
养基，移入混合气体培养箱(95% N2、5% CO2、O2浓度 ＜
1%) ，于 37 ℃缺氧培养 6 h［7］。
实验设空白对照组、缺氧损伤模型组、3 mg·mL －1复
方丹参阳性对照组及蕨麻正丁醇部位 3 mg· mL －1、
1． 5 mg·mL －1、0． 75 mg·mL －1浓度组。缺氧损伤模型组
只加等体积溶媒，与各药物干预组一同缺氧培养;空白对照
组用等体积 D － Hank’s 液替代正常培养基，同时培养于
5% CO2培养箱中。
1． 2． 2 心肌细胞 HE 染色 取细胞爬片的盖玻片，常规
HE染色。
1． 2． 3 心肌细胞 PI － Hoechst 染色 细胞常规消化，
1500 rpm、10 min 离心去上清，加 0. 01M PBS 悬浮细胞，相
同条件下离心去上清，加 1 mL 0. 01M PBS 悬浮细胞，移入
EP管中，相同条件下离心去上清，200 μL 0. 01M PBS 悬浮
细胞，加 PI /H33342 染色剂 40 μL，混匀，37 ℃温箱孵育8 ～
10 min，离心去上清，加 0. 01M PBS制成细胞悬液，涂片、盖
片，荧光显微镜下观察。
1． 2． 4 ＲT － PCＲ 技术检测心肌细胞 Caspase 3、Caspase 9
mＲNA水平 逆转录反应条件:42 ℃60 min;98 ℃5 min。
PCＲ反应:以 β － actin 为内参基因，分别加入 Caspase 9
mＲNA和 Caspase 3 mＲNA引物。扩增产物长度为 461 bp。
Caspase 3 反应条件:94 ℃5 min，1 个循环。94 ℃30
s;55 ℃20 s;72℃1 min，30 个循环。72 ℃5 min，1 个循环。
Caspase 9 反应条件:94 ℃5 min，1 个循环。94 ℃30 s;
53 ℃45 s;72 ℃45 s，35 个循环。72 ℃5 min，1 个循环。
以 β － actin 的 mＲNA 表达水平为 100%，计算各组基因
mＲNA表达水平。所测基因引物序列见表 1。
表 1 β － actin，Caspase 3、Caspase 9 mＲNA引物序列
基因 Forword Ｒeverse
β － actin
5 ＇ － TGATGACAT-
CAAGAAGGTGGTGAA G
－3＇
5 ＇ － TCCTTGGAGGC-
CATGTAGGCCAT － 3＇
Caspase 3
5＇ － GCA CTG GAA TGT
CAG CTC GCA A －3＇
5＇－ GCC ACC TTC CGG
TTA ACA CGA C －3＇
Caspase 9
5＇ － CCC GTG AAG CAA
GGA TTT － 3＇
5＇－ TCT GTG GGT CTG
GGA AGC －3＇
1． 2． 5 免疫细胞化学技术检测心肌细胞 Caspase 3、
Caspase 9 蛋白 取各组心肌细胞，常规胰酶消化离心，调
整好细胞浓度后，制成细胞涂片，4%多聚甲醛 4 ℃固定过
夜，0. 01 M PBS充分冲洗、晾干，3% H2O2室温孵育 20 min，
0. 01 M PBS洗，羊血清室温封闭 30 min。加一抗(1 ∶ 150) ，
4 ℃过夜。0. 01 M PBS 洗，滴加生物素化二抗(1 ∶ 200) ，
37℃湿盒内温育 30 min，0. 01M PBS洗，加辣根过氧化物酶
标记的链霉卵白素，37 ℃孵育 30 min，0. 01M PBS 洗，DAB
显色，常规脱水、透明、中性树胶封片。阴性对照心肌细胞
染色时以磷酸缓冲液代替一抗，其余步骤相同。以胞核或
胞浆染成棕黄色为阳性。
1． 2． 6 统计学处理 采用 SPSS 11． 5 软件进行方差分析
和 t检验，结果以 珋x ± s表示，P ＜ 0. 05 为有统计学差异。
2 结 果
2． 1 倒置显微镜下细胞形态
倒置显微镜下，正常对照组心肌细胞从第三天起成簇
生长，搏动明显，细胞簇数量增多，细胞形状多样化，呈圆
形、梭形及锥形，并突起呈枝芽状，向细胞簇周围放射状生
长，折光性强。缺氧模型组胞体折光性下降，突起缩短或消
失，搏动减弱或消失。复方丹参及蕨麻正丁醇部位组心肌
细胞形态明显改善。
2． 2 心肌细胞 HE染色
正常对照组细胞成簇生长，伸出伪足，细胞核大而饱
满，胞浆丰富，细胞间联系密切;缺氧损伤模型组细胞伪足
缩短或消失，细胞皱缩，核固缩、深染，细胞间隙增大，细胞
间联系减少，大片细胞脱落;丹参、蕨麻正丁醇部位干预后，
心肌细胞的形态、结构均明显改善，细胞脱落减少。
2． 3 PI － Hoechst染色
正常对照组细胞呈淡蓝色荧光，核结构正常;缺氧模型
组镜下可见部分细胞细胞核凝集呈分叶、碎片状，呈亮蓝色
荧光;部分细胞染成红色，可见明显的染色质凝集;部分细
胞红染但染色质不凝集。丹参、蕨麻正丁醇部位(0． 003 g /
mL)干预后，红染的细胞数量明显减少，部分细胞核有轻度
浓集，呈亮蓝色，见插页Ⅰ图 1。
2． 4 心肌细胞 Caspase 3、Caspase 9 mＲAN的表达
缺氧损伤后模型组较正常组心肌细胞内 Caspase 3、
第 31 卷 第 8 期
2 0 1 3 年 8 月
中 华 中 医 药 学 刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 31 No． 8
Aug． 2 0 1 3
中
华
中
医
药
1575
学
刊
Caspase 9 mＲAN水平显著升高(P ＜ 0. 01)。给予高、中剂
量蕨麻正丁醇部位可显著降低心肌细胞缺氧时 Caspase 3、
Caspase 9 mＲAN水平(P ＜ 0. 01)。见插页Ⅰ图 2。
2． 5 心肌细胞 Caspase 3、Caspase 9 蛋白检测
Caspase 3 蛋白主要在胞浆表达，Caspase 9 蛋白则主要
在胞核表达，阳性反应产物均为淡棕到深棕色，呈颗粒状、
团块状、弥漫状分布。
正常对照组细胞免疫组化染色切片中，Caspase 3、
Caspase 9 蛋白表达较弱，免疫反应阳性物质呈淡棕色，模
型组细胞 Caspase 3、Caspase 9 蛋白免疫反应阳性物质呈深
棕色，与模型组比较，复方丹参组和 0． 003 g /mL 蕨麻正丁
醇部位组缺氧损伤细胞 Caspase3、Caspase9 蛋白免疫反应
阳性物质染色变为淡棕色。见插页Ⅱ图 3 ～ 4。
3 讨 论
我们的前期研究已经证实，蕨麻正丁醇部位可通过增
强心肌细胞清除自由基的能力，对抗缺氧导致的细胞膜氧
化损伤，从而对心肌细胞起到保护作用［6］。本次实验结果
也表明蕨麻正丁醇部位可改善心肌细胞缺氧所致病理改
变，维持心肌细胞形态结构，抑制心肌细胞缺氧损伤。
细胞凋亡是一个渐进的过程，凋亡早期的细胞结构变
化轻微，胞膜尚未破坏，此时通过治疗干预手段仍能逆转这
部分细胞的功能。而到了凋亡的晚期，细胞结构已经出现
明显的破坏，胞膜破碎，细胞逐渐走向不可逆的死亡。因此
抑制凋亡过程的发展对于保护细胞具有重要意义。
凋亡是以细胞核浓缩，染色质凝集，胞浆皱缩，最终形
成凋亡小体等形态变化为特征的一种能动的受基因调控的
生理性细胞死亡过程。Hoechst33342 能透过胞膜完整的细
胞，嵌入细胞核 DNA，使之发出明亮的蓝色荧光。PI 仅能
透过胞膜受损的细胞，嵌入核 DNA，发橘红色荧光［8］。本
实验结果显示:心肌细胞缺氧 6 hr，有的细胞呈亮蓝色荧
光，发生了核浓集，此为早期凋亡;有的细胞染成红色，可见
明显的染色质凝集，此为晚期凋亡;有的细胞染成红色，但
未见染色质凝集，细胞结构不典型或不完整，此为非凋亡的
死亡细胞;此外还有染成红色的细胞碎片。给予复方丹参、
蕨麻正丁醇部位(0． 003 g /mL)干预后，红染的细胞数量显
著减少，仅部分细胞核有轻度浓集，呈亮蓝色。提示两者均
可以抑制缺氧所致的心肌细胞凋亡进程，减少晚期凋亡和细
胞死亡的发生。文献报道丹参可抑制乳鼠心肌细胞缺氧及
缺氧 －复氧所致凋亡［9 －10］，本研究结果与文献报道相符。
Caspases家族成员在正常细胞中以无活性的前体形式
合成与储存，根据其在级联反应中的位置及 N 端序列上的
特点不同，可将其分为两类:上游 Caspases(起始 Caspases，
包括 Caspase 1，2，4，5，8，9，10，11，12，13)和下游 Caspases
(效应 Caspases，包括 Caspase 3，6，7)。细胞色素 C 进入胞
质后先水解激活上游 Caspase 8、Caspase 9、Caspase 10 酶原
成 Caspase 8、Caspase 9、Caspase 10，后者又进一步水解激活
下游 Caspase 3、Caspase 6、Caspase 7 酶原。其中 Caspase 3
被认为是 caspsaes家族中的关键蛋白酶，其活化是细胞凋
亡酶级联反应的必经之路。Caspase 3 蛋白酶经过活化降解
成两个分别长达 29K(P20)和 17KD(P11)的活性片段才能
发挥作用［11］。研究表明，缺氧能诱导体外培养心肌细胞线
粒体释放细胞色素 C，并上调在激活 Caspases家族中起关键
作用的上游 Caspase 9及其下游效应分子 Caspase 3 的表达，
引起心肌细胞凋亡，表明线粒体依赖的 Caspase 3 激活信号
传导途径在缺氧诱导心肌细胞凋亡过程中起重要作用［12］。
本实验结果证实，心肌细胞缺氧 6hr，位于上游的
Caspase 9 mＲAN和位于下游的 Caspase 3 mＲAN 表达水平
均明显上升。心肌细胞 Caspase 3、Caspase 9 蛋白免疫反
应阳性物质染色增强，表明缺氧可致心肌细胞中两种蛋白
含量升高。给予复方丹参后 Caspase 3、Caspase 9mＲNA及
蛋白表达均下调，结果与文献［9］报道一致。我们在垂体后
叶素致小鼠急性心肌缺血损伤模型中也证实蕨麻正丁醇部
位可以通过下调 Caspase 3，Caspase 9 表达水平［13］，本次实
验同样证实蕨麻正丁醇部位各剂量也能够下调 Caspase 9
mＲAN、Caspase 3 mＲAN 及蛋白表达水平。提示蕨麻正丁
醇部位可通过降低 Caspase 3，Caspase 9 基因表达及产物蛋
白的水平，减弱 Caspases级联反应，从而抑制缺氧诱导的心
肌细胞凋亡的发生及发展。
参考文献
［1］ 贾守宁，杨卉．蕨麻抗缺氧作用的实验研究［J］． 中国民族医
药杂志，1999，5(1) :37．
［2］ 回晶，尚德静，李庆伟．西藏人参果对小鼠抗疲劳及抗缺氧能
力的影响［J］．营养学报，2003，25(2) :218 － 219．
［3］ 李灵芝，张丽，龚海英，等．蕨麻醇提取物的抗缺氧与抗氧化
研究［J］．中国食品卫生杂志，2005，17(4) :306 － 308．
［4］ 李建宇，李灵芝，张新宁，等． 蕨麻醇提物对小鼠慢性缺氧心
肌损伤的保护作用［J］．卫生研究，2007，36(6) :740 － 742．
［5］ 李建宇，李怡，龚海英，等．蕨麻正丁醇提取部位对小鼠急性
心肌缺血损伤的保护作用［J］．中西医结合学报，2009，7(1) :
48 － 52．
［6］ 王舒，韦薇，李灵芝，等．蕨麻正丁醇部位对缺氧损伤心肌细
胞的保护作用［J］．天津中医药，2009，26(3) :250 － 252．
［7］ Ｒegula K M．，Ens K，Kirshenbaum L A． Inducible expression of
BNIP3 provokes mitochondrial defects and hypoxia － mediated
cell death of ventricular myocytes［J］． Circ Ｒes，2002，91(3) :
226 － 231．
［8］ 汤亲青，于燕妮． Hoechst33342 /PI双荧光活染法检测氟对体
外培养大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响［J］． 中国地方病学
杂志，2007，26(5) :508 － 511．
［9］ 张卓然，王鲁川，李鸿珠，等． 丹参对 ox － LDL 孵育的乳鼠心
肌细胞缺氧 －复氧所致细胞凋亡的保护作用［J］． 中医药学
报，2009，37(5) :19 － 22．
［10］ 柯于鹤，曲松柏．丹参对乳鼠心肌细胞凋亡的影响［J］． 北
京中医药大学学报:中医临床版，2001，8(1) :17 － 20．
［11］ 杨新宇，杨树源，张建宇，等．急性脑创伤后神经元 Caspase 3
表达、激活及作用的实验研究［J］． 中华神经外科杂志，
2002，18(6) :375 － 378．
［12］ 周舟，王小华，朱光旭，等． Caspase － 3、－ 9 表达上调参与缺
氧诱导心肌细胞凋亡［J］．第三军医大学学报，2005，27(3) :
185 － 188．
［13］ 李建宇，李怡，龚海英，等． 蕨麻正丁醇提取部位对小鼠急
性缺血心肌 Caspase － 9 /3 mＲNA表达的影响［J］．中国中西
医结合急救杂志，2009，16(1) :18 － 21．
书第 31 卷 第 期
2 0 1 3 年 8 月
中 华 中 医 药 学 刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 31 No． 8
Aug． 2 0 1 3
中
华
中
医
药
Ⅰ
学
刊
蕨麻正丁醇部位抑制缺氧损伤心肌细胞凋亡及 Caspase 3 /9 表达
(正文见 1573 － 1575 页)
第 31 卷 第 期
2 0 1 3 年 8 月
中 华 中 医 药 学 刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 31 No． 8
Aug． 2 0 1 3
中
华
中
医
药
Ⅱ
学
刊
榄香烯乳注射液对血管内皮细胞株 HECV功能影响的体外研究
(正文见 1581 － 1584 页)
图 5 不同浓度榄香烯乳注射液对 HECV细胞新生血管形成的影响