全 文 ：2011 年 21( 1) 生 物 技 术
fluencing reporter gene expression in hepatoma cells following calcium phos-
phate transfection［J］． DNA Cell Biol，1994，13( 12) : 1227 － 1232．
［5］Segura I ，Gonzalez MA． High transfection efficiency of human umbili-
cal vein endothelial cells using an optimized calcium phosphate method［J］．
Anal Biochem，2001，296( 1) : 143 － 147．
［6］颜子颖，等译．精编分子生物学实验指南［M］．北京:科学技术出版
社，1998: 274 － 328．
［7］焦德敏，于慧慧，张铸业，等．磷酸钙法将 MMP － 2，MMP － 3 双基
因干扰载体转入 HEK293T细胞的效率观察［J］． 贵州大学学报: 自然
科学版，2009，26( 6) : 60 － 62．
［8］汪海东，孙皎，夏世金． IL － 17 和 siRNA － IL － 17 基因逆转录病毒
载体的构建及其转染致糖尿病性 T细胞中 IL － 17 的表达［J］． 中国老
年学杂志，2009，29( 26) : 2873 － 2877．
［9］张全爱，齐延红，潘薇薇，等．组织因子人 －鼠嵌合抗体真核表达载
体的构建及鉴定［J］．细胞与分子免疫学杂志，2009，25 ( 12 ) : 1149 －
1151．
新疆块根芍药( Paeonia anomala) 内生细菌
XJU － PA － 1 的鉴定及特性分析
布热比亚·艾山1，阿依努尔·阿不都热合曼2，米克热木·牙生1，吾甫尔·米吉提1*
( 1．新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046; 2．新疆医科大学护理学院，新疆 乌鲁木齐 830000)
摘要:目的:从新疆块根芍药( Paeonia anomala) 内生菌中筛选出 1 株对植物病原菌有抑菌活性的内生菌并对其进行鉴定及
特性分析。方法:采用琼脂扩散法进行抑菌实验，基于形态特征，生理生化特性，16S rDNA序列分析并 G + C mol%含量对 XJU －
PA － 1 进行鉴定。结果: XJU － PA － 1 对玉米小班病菌和苹果半点落叶病菌有抑菌活性，抑菌圈直径都超过 20mm。XJU － PA － 1
与 DQ010109 Bacillus subtilis的 16S rDNA序列的同源性达到 100%，G + Cmol%含量为 54． 5%。结论: XJU － PA － 1 对两种致病菌
有较强的抑菌能力，被鉴定为枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis) ，在 GenBank数据库的注册号为 EU741698。
关键词:块根芍药; 内生菌;拮抗作用; 鉴定
中图分类号: Q939 文献标识码: A doi: 10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2011． 01． 019
Isolation and Identification of Endophytic Bacterium
XJU － PA － 1 from Paeonia anomala
Burabiya·Hasan1，Aynur·Abdurahman2，Mukaram·Yasen1，Ghopur·Mijit1*
( 1． College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumuqi 830046，China;
2． Nursing Institute of Xinjiang Medical University，Urumuqi 830000，China)
Abstract: Objective: An endophytic bacterial strains which has antagonistic activity was isolated and identified from Paeonia anomala，in
Xinjiang． Method: Endophytic bacterial strains was screened by the means of Agar diffusion and dual culture． Identification of XJU － PA
－ 1based on the morphological and biochemical characteristics，the analysis of 16S rRNA sequence，and the G + Cmol% content． Result:
The diameter of bacteriostasis cycle of XJU － PA － 1 against to Bipolaris maydis and Alternaria mali was surpassed 20mm ． The homology
of 16S rRNA sequences of XJU － PA － 1 was closely related to DQ010109 Bacillus subtilis with 100% identity，the G + C% mol content
was 54． 5mol% ． Conclusion: XJU － PA － 1 has higher antagonistic activity against two pathogenic bacterium ，it was identified as Bacillus
subtilis，Registration No． of the GeneBank is EU741698．
Key words: Paeonia anomala; endophytic bacterium; antagonistic effects; identification
收稿日期: 2010 － 06 － 29; 修回日期:修回日期: 2010 － 11 － 06
基金项目:国家自然科学基金项目( 30560004) 资助
作者简介:布热比亚·艾山( 1985 － ) ，女，新疆人，硕士生，从事植物内
生菌的特性分析及其应用研究，Email: Bubi920@ sina． cn; * 通讯作者:
吾甫尔·米吉提( 1958 － ) ，男，教授，博士生导师，主持国家自然科学
基金 3 项、省级课题 2 项，发表论文 50 余篇，Email: gmijit2001@ sina．
com，Tel: 0991 － 8583452。
植物内生菌 ( Plant endophyte) 是微生物中的一个重要类
群，能参与宿主植物次级代谢产物的合成与转化或独立合成
次级代谢产物，其物种丰富，已经成为新医( 农) 药活性物质的
潜在资源。研究显示，目前从植物内生菌中分离出的生物活
性物质，大约 51%属于未报道过的新化合物。因此，植物内生
菌相关领域的研究工作，愈来愈受到国内外同行的关注［1］。
近年来，作者实验室先后对焮麻、骆驼刺和刺山苷等 20 多种
有毒和药用植物的内生菌进行了分离、特性分析及其应用方
面的研究［2］。
块根芍药( Paeonia anomala) 属于芍药亚科芍药属，主要
分布在西南、西北地区。多数种类的根、根皮供药用，芍药是
镇痉、镇痛、通经药。2008 年，阿依努尔等［3］从块根芍药里分
离出了 1 株能产灵菌红素的内生菌，该内生菌在寻找新的抗
肿瘤、抗感染活性化合物方面已显示出潜在的应用价值［4］。
作者首次从新疆药用植物块根芍药里筛选出抗玉米小斑病和
苹果半点落叶病的内生菌并对其进行鉴定，为促进新疆特有
药用植物内生菌资源的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 实验材料:供试菌株是由作者实验室于 2006 年分离获
得。
1． 1． 2 试剂
麦芽糖、蛋白胨、琼脂粉、NaCl、KH2PO4、K2HPO4、可溶性
淀粉、无水乙醇、十二烷基苯磺酸钠等常规药品皆为国产分析
纯。UNIQ － 10 柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒，PCR 试剂
盒购自宝生物工程( 大连) 有限公司。
1． 1． 3 仪器
电热恒温鼓风干燥箱( DHG － 9070A) ，低速、高速离心机
( Beckman and Sigma) ，ND －1000 Spectrophotometer; Ultra － Low
Temperature Freezer( MDF － U53V) ，超净工作台、旋转蒸发器
( RE － 52AA) ;恒温震荡摇床( HZQ － 2 ) ; 梯度 PCR 仪( Biorad
Mycycler) ;凝胶成像仪( Alphalnmger 200，USA) ;高效液相色谱
仪( 日本岛津 LC － 6AD) 。
1． 1． 4 培养基
分离培养基: LB培养基、PDA培养基、MEA 培养基，配方
参考［5］。
1． 1． 5 农作物致病菌
黄瓜枯萎病菌( Fusarium oxysporum f． sp． cucumerinum) 、棉
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生 物 技 术 2011 年 21( 1)
花枯萎病菌 ( Fusarium oxysporum f． sp． vasinfectum) 、西瓜枯萎
病菌( Fusarium oxysporumf． sp． niveum) 、苹果斑点落叶病菌( Al-
ternaria mali) 、葡萄白腐病菌( Coniothyrium diplodiella) 、稻瘟病
菌( Magnaporthe grisea) 、棉花黄萎病菌 ( Verticillium dahliae) 、
玉米小斑病菌 ( Bipolaris maydis) 、玉米大斑病菌 ( Exserohilum
turcicum) 等农作物致病菌均购自中国农业科学院农业资源与
农业区划研究所菌种中心。
1． 2 方法
1． 2． 1 拮抗菌株的筛选
采用琼脂扩散法［6］检测对病原真菌具有拮抗作用的内生菌。
1． 2． 2 菌株 XJU － PA － 1 常见的生物学特性
先把 XJU － PA － 1 接种于 MEA 培养基上，38℃培养 24h
后，观察其形态、表面、边缘、颜色、隆起形状、透明度、菌落及
培养基的颜色等状态。常规的生理生化指标如酪胺水节、V －
P实验、吲哚形成、淀粉水解、硝酸盐试验等参照《常见细菌系
统鉴定手册》［7］方法进行检测。
1． 2． 3 菌株 XJU － PA － 1 的 16S rDNA序列分析
采用 UNIQ － 10 柱式细菌基因组 DNA抽提试剂盒所提取
的菌株基因组 DNA 为模板。PCR 条件: 94℃预变性 5min;
94℃变性 1min，58． 4℃退火 1min ，72℃延伸 2min，循环 30 次，
最后 72℃保温 7min，4℃ 终止反应，序列测定委托大连 TAKA-
RA公司完成，所获得的序列在 GeneBank 数据库用 BLAST 进
行序列对比和分析，并通过软件 MEGA 4． 0 采用 N － J 法构建
系统进化树。
1． 2． 4 XJU － PA － 1 的 G + C mol%的测定
用酚氯仿法提取大量基因组 DNA，用 ND － 1000 spectro-
photometer进行纯度检测。用高效反相液相色谱仪来测定
XJU － PA － 1 菌株基因组的( G + C) mo1%含量。色谱条件:色
谱柱为 Kromasil C18 柱，流动相: 20mmol /L KH2PO4 缓冲液
( pH 5． 6) ，甲醇溶液( 体积比 90∶ 10) ;检测波长: 260nm，柱温:
35℃ ;流速: 1ml /min;进样量: 20μl［8］。
2 结果与分析
2． 1 拮抗实验
拮抗实验结果表明 XJU － PA － 6 菌株对玉米小斑病菌和
苹果斑点落叶病菌有很强的抑制作用( 见表 1 和图 1、2) 。
表 1 XJU － PA － 1 菌株的拮抗试验结果
Table 1 The antagonistic test results of XJU － PA － 1
病原菌
玉米
小斑病菌
西瓜
枯萎病菌
苹果斑点
落叶病菌
棉花
枯萎病菌
稻瘟
病菌
XJU － PA － 1 + + + － + + + － －
“+ + +”:表示对该致病菌有较强的拮抗能力;“－”表示对该
致病菌无拮抗能力。
“+”: positive reaction;“－”: negative reaction．
图 1 XJU － PA － 1 对玉米小斑病菌的拮抗图
Fig． 1 The antagonistic map of XJU － PA － 1 against Bipolaris maydis
图 2 XJU － PA － 1 对苹果斑点落叶病菌的拮抗图
Fig． 2 The antagonistic map of XJU － PA － 1 against Ahernaria mali
2． 2 XJU － PA － 1 菌株的生物学特性
该菌株为短杆状，两端纯圆，革兰氏阳性细菌，有芽孢，
无鞭毛，无运动。菌落呈圆形，光滑，湿润，边缘不整齐，pH
值在 1 ～ 11 时均能生长，但起始 pH值在 1 ～ 5 时，生长明显不
好，最适 pH值为 7; NaCl 浓度在 1% ～ 13%时均可生长，15%
的 NaCl浓度不能生长，1% NaCl 浓度为最适生长浓度。XJU
－ PA － 1 主要生理生化特征见表 2。
图 3 XJU － PA － 1 的革兰氏染色
Fig． 3 Gram staining of XJU － PA － 1
图 4 XJU － PA － 1 的形态观察
Fig． 4 Morphology of XJU － PA － 1
2． 3 16S rRNA 基因序列分析
测得菌株 XJU － PA － 1 的 16S rRNA片段大小为 1 445bp，
将序列提交 GeneBank，获得注册号，注册号为 EU741698，该序
列与 GenBank 中一直序列 BLAST 后，构建系统发育树，结果
见图 7。发现 XJU － PA － 1 与 DQ010109 Bacillus subtilis 构成
一个分支，并相似性达到 100%，因此可判断菌株 XJU － PA － 1
是枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis) 。
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2011 年 21( 1) 生 物 技 术
图 5 不同 pH对 XJU － PA － 1 生长的影响
Fig． 5 Different pH on XJU － PA － 1 growth
图 6 不同 NaCl浓度对 XJU － PA － 1 生长的影响
Fig． 6 Different NaCl concentration on XJU － PA － 1 growth
表 2 XJU － PA － 1 的生理生化特征
Table 2 Physiological and biochemical characteristics of XJU － PA － 1
测定项目 XJU － PA －1
枯草
芽孢杆菌
测定项目 XJU － PA －1
枯草
芽孢杆菌
革兰氏染色 + + 硝酸盐还原 + +
芽孢染色 + + 亚硝酸盐还原 － －
酪朊水解 + + 生长 NaCl 2% + +
V － P试验 + + 5% + +
吲哚形成 － + 7% + +
淀粉水解 － + 10% + +
甲基红 + +
注:“ +”阳性;“ －”阴性。“ +”positive;“ －”negative;“ND”not do．
图 7 基于 16S rDNA基因序列建立的系统发育树
Fig． 7 Streptococcus phylogenetic tree according to 16S rDNA genes
2． 4 XJU － PA － 1 的 G + C mol%的测定
提取 DNA吸光度比为 A260 ∶ A280 = 1． 8。通过高效反相液
相色谱图( 图 8) 及碱基的毫摩尔数可以测得 XJU － PA － 1 的
( G + C) mo1%含量为 54． 5%，完全在芽孢杆菌属 DNA G +
Cmo1% ( 32% ～69% ) 之内。
3 讨论
玉米小斑病又名称玉米斑点病［9］，由玉米小班病菌所引
起的我国玉米生产中主要病害之一，各玉米产区均有发生。
近年来发病率愈加严重，已成为玉米生产中的主要病害。因
此对该病进行有效防治是目前该领域中的研究热点之一。枯
草芽孢杆菌是常用的益生菌之一，可以抑制多种细菌及真菌
的生长［10］。
图 8 标准碱基溶液分离图谱
Fig． 8 Separate map of standard bases
图 9 XJU － PA － 1 碱基分离图
Fig． 9 Separate map of bases from XJU － PA － 1
目前，有关枯草芽孢杆菌抑菌活性的研究主要集中在真
菌和细菌方面，应用于植物病原菌的生物防治。众多研究表
明，其在一定程度上抑制芒果软腐病、辣椒炭疽病、苹果轮纹
病、水稻纹枯病、水稻白叶枯病及苹果梨和柑橘上的青霉
病［11 － 15］、食源性病原菌［16］。但目前分离获得并且应用的大多
数枯草芽孢杆菌都来源于土壤，然而，从植物中分离的内生枯
草芽孢杆菌对玉米小班病菌、苹果斑点病菌的抑菌活性方面
有很少报道。
本实验所筛选到的块根芍药内生细菌 XJU － PA － 1 通过
16S rDNA序列分析表明，其与 DQ010109 Bacillus subtilis 的同
源性达到 100%，形态学及生理生化特征与枯草芽孢杆菌特征
的相符，G + C mol%含量为 54． 5%，因此，将该内生菌株 XJU
－ PA － 1 最终鉴定为枯草芽孢杆菌。XJU － PA － 1 对玉米小
斑病菌和苹果斑点落叶病菌有较强的抑菌效果。因此 XJU －
PA － 1 的获得为寻找新的高抗玉米小斑病及苹果斑点落叶病
的菌种奠定了一定的基础，其拮抗活性成分有待进一步研究。
参考文献:
［1］赫荣乔．一株新的药用植物内生菌 Burkholderia sp． H － 6［J］．微生
物学通报，2008，35( 4) : 511．
［2］阿力木江，李秀苹，吾甫尔·米吉提，等．新疆部分药用植物内生菌
的分离、鉴定及其应用基础研究进展［C］． 昆明: “植物内生菌开发与
应用”全国学术研讨会议论文集，中国农业科技服务协会，2009，10:
139．
［3］阿依努尔·阿不都热合曼，于频频，布热比亚·艾山，等．块根芍药
产红色素的内生菌 XJU － PA － 6 的分离鉴定［J］． 生物技术，2008，18
( 5) : 33 － 36．
［4］何劲，刘蕴哲，康冀川． 植物内生菌及其在农业和医学上的用途
［J］．贵州农业科学，2006，34( 3) : 113 － 115．
［5］钱存柔，黄仪秀．微生物学实验教程［M］．北京大学出版社，2003 －
35
生 物 技 术 2011 年 21( 1)
03: 215．
［6］张洪涛，徐田枚，艾山江，等．新疆有毒煅麻内生菌的分离及 AP—
PCR与 ERIC—PCR分析［J］． 中国微生态学杂志，2007，19 ( 3 ) : 25 －
27．
［7］东秀珠，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册［M］．北京: 科学出版社，
2001: 94 － 387．
［8］邓爱华，王宁，易霞，等． 反相高效液相色谱法测定 Bacillus claussi
的 DNA G + Cmol%［J］．生物技术，2006，16( 4) : 42 － 45．
［9］钟承茂． 玉米小斑病发生规律与综合防治技术［J］． 农技服务，
2008，25( 2) : 83 － 84．
［10］陈雪，侯红漫，陈 莉，等．产细菌素芽孢杆菌的筛选及发酵条件的
研究［ J］．中国酿造，2008，( 9) : 26 － 30．
［11］AMPAROCM． Histopathological effects and growth reduction in asus-
cep tible and a resistance of heliothis virescens caused by sublethal doses of
pure Cry1A crystal proteins from Bacillus thuringiesis［J］． Biocontrol Sci
Technol，1999，9( 2) : 239 － 246．
［12］齐东梅，惠明，梁启美，等． 枯草芽孢杆菌 H110 对苹果梨采后青
霉病和黑斑病的抑制效果［J］． 应用与环境生物学报，2005，11 ( 2 ) :
171 － 174．
［13］Leelasuphakul W． Hemmanee P． Chuenchitt S． Growth inhibitory
properties of Bacillus subtilis strains and their metabolites against the green
mold pathogen ( Penicillium digitatum Sacc． ) of citrus fruit［J］． Posthar-
vest Biology and Technology，2008，48( 1) : 113 － 121．
［14］史凤玉，朱英波，吉志新，等． 枯草芽孢杆菌 QDH2121 对采后苹果
青霉病的抑制效果［J］． 中国食品学报，2007，7 ( 4) : 80 － 84．
［15］范青，田世平，李永兴，等． 枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis) B2912
对采后柑桔果实青、绿霉病的抑制效果［J］． 植物病理学报，2000，30
( 4) : 343 － 3481．
［16］孙卉，师俊玲．枯草芽孢杆菌 CCTCCM207209 对食源性病原菌的
抑制作用［J］．中国酿造，2009，( 6) : 35 － 37．
裂褶菌培养、鉴定及氨基酸组成分析
潘欣1，2，邹立扣3* ，岳爱玲3，张悦3，姚琼3，罗燕3，李蓓3
( 1．成都理工大学旅游与城乡规划学院，四川 成都 610059; 2．四川农业大学林学院，四川 雅安 625014;
3． 四川农业大学都江堰校区微生物学实验室，四川 都江堰 611830)
摘要:目的:获得裂褶菌的纯培养物，鉴定培养菌丝，并分析子实体及菌丝氨基酸含量。方法:利用孢子分离法、组织分离法
培养菌丝，扫描电镜观测其菌丝特征，结合 ITS区序列分析，并利用出菇试验分析其菌丝体，全自动氨基酸分析仪分别测定裂褶
菌子实体、菌丝体氨基酸组成。结果: 菌丝体 ITS区序列与子实体完全一致，出菇试验亦表明裂褶菌菌丝体培养成功，子实体及
菌丝体均含有丰富的氨基酸成分，两者氨基酸种类及含量相当，菌丝体总氨基酸含量 14． 01%，子实体总氨基酸含量 15． 59%，其
中菌丝体必需氨基酸的含量( 38． 60% ) 比子实体稍高( 37． 95% ) 。结论:裂褶菌菌丝亦具有丰富的营养价值，可作为重要的氨基
酸来源及功能性食品。
关键词:裂褶菌;培养; 鉴定;氨基酸
中图分类号: Q93 － 331; Q939． 5 文献标识码: A doi: 10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2011． 01． 020
Cultivation，Identification of Schizophyllum commune and Analysis
of Its Amino Acid Compositon
PAN Xin1，2，ZOU Li － kou3* ，YUE Ai － ling3，ZHANG Yue3，YAO Qiong3，LUO Yan3，LI Bei3
( 1． College of Tourism and Urban and Rural Planning，Chengdu University of Technology，Chengdu 610059，China;
2． College of Forestry，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China;
3． Lab of Microbiology，Dujiangyan Campus of Sichuan Agricultural University，Dujiangyan 611830，China)
Abstract: Objective: The aim of the study is to obtain and identify the mycelium of Schizophyllum commune，and analyze the amino acids
composition of mycelium and fruiting body． Method: The mycelium was cultivated and purified on the PDA plates at 25℃ for three to five
days． Both morphological and molecular methods were used to identify the fungi． Apart from this，mushroom was also obtained． The inter-
nal transcribed spacer ( ITS) region in rRNA gene was cloned and sequenced，and the sequence was compared with others species in the
Genbank． Besides，the component of amino acid was analyzed using amino acid auto analyzer． Result: The results showed that the ITS
sequence was same between mycelium and fruiting body． The molecular marker of ITS sequence was necessary and useful． The total amino
acids account for 14． 01% and 15． 59% in the mycelium and the fruiting body． The composition of mycelium essential amino acids was
higher ( 38． 60% ) than that of fruiting body ( 37． 95% ) ． Conclusion: Therefore，S． commune especially the mycelium is nutritious and
can be developed to be a functional product．
Key words: Schizophyllum commune; cultivation; identification; amino acids
收稿日期: 2010 － 10 － 03; 修回日期: 2010 － 12 － 11
作者简介:潘欣( 1979 － ) ，女，博士，讲师，从事森林生态及大型真菌研
究。* 联系作者:邹立扣( 1979 － ) ，男，博士，副教授，硕导，从事微生
物及分子生物学研究，Email: zoulk124@ 163． com。
裂褶菌 ( Schizophyllum commune) 又名白参、灰树花，有特
殊的浓郁香味，性平，昧甘，能滋补强壮、扶正固本、镇静作用，
治疗神经衰弱、精神不振、头昏耳鸣、虚汗，是一种高档食、药
用菌，其代谢产物具有较好的药用价值［1］。裂褶菌在真菌分
类上隶属于菌物界 ( Fungi) 真菌门 ( Eumycota) 、担子菌亚门
( Basidiomycotina) 、层菌纲 ( Hymenomycetes ) 、伞菌目 ( Agari-
cales) 、裂褶菌科 ( Schizophyllaceae ) 、裂褶菌属 ( Schizophyl-
lum) ［2］。裂褶菌子实体 或菌丝体 含有丰富的免疫性多糖、蛋
白质 、生物活性 L型氨基酸 、多种必需氨基酸和微量元素等，
这些物质分别对心血管和肝、肾等多种器官疾病具有防治作
用，并具有抗癌、抗衰老、抗炎症等功效［3，4］。近年来，日本及
欧美等国在分子生物学、抗癌活性物质和优良菌株的选育等
方面进行了广泛的研究，国内的研究重点集中于发酵条件、人
工驯化栽培和药用价值［5，6］。裂褶菌中含有多种活性成分，尤
其对裂褶菌多糖( Schizophyllan，SPG) 研究报道较多［3，7］，但对
裂褶菌的分子鉴定、氨基酸组成分析等报道较少。鉴于此，本
文对裂褶菌的培养特性、菌丝特征进行了描述，结合分子生物
学方法对菌丝体进行鉴定，并利用全自动氨基酸分析仪分析
裂褶菌子实体及菌丝体氨基酸组成。
1 材料与方法
1． 1 材料
裂褶菌子实体样品采集自四川西昌，大肠杆菌 JM109 由
四川农业大都江堰校区学微生物学实验室保存。分子量标准
DL2000、pMD19 － T载体、TaqDNA 聚合酶及连接试剂盒购自
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