全 文 ：第21卷第6期
2012年6月
武警后勤学院学报（医学版）
Journal of Logistics University of CAPF（Medical Sciences）
vol.21 No.6
Jun. 2012
doi:10.3969/j.issn.2095-3720.2012.06.002
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论 著
[基金项目]国家自然科学基金项目(81073152)，天津市重点基金项
目 (10JCZDJC21100)，中国博士后基金项目(20100470106)
[收稿日期]2012-02-26; [修回日期]2012-04-13
[作者简介]龚海英（1972-），女，籍贯安徽合肥，实验师，硕士，主要
从事抗缺氧药物研究。
[通讯作者]李灵芝，教授，E-mail：llzhx@yahoo.cn。
蕨麻正丁醇部位对EAHY926内皮细胞缺氧损伤的保护作用
龚海英1，张 岭1，李灵芝1,2，李广策1，吕 琪3，李建宇1 ，陈 莉4
（1.武警医学院药物化学教研室，天津 300162；2.天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室，天津 300162；3.武警医学院
中心实验室，天津 300162；4.天津武警8630部队师机关门诊，天津 300161）
摘 要：【目的】探讨蕨麻正丁醇部位对内皮细胞缺氧损伤的保护作用。【方法】采用人脐静脉内皮细胞株（EAHY926）建立缺氧
损伤实验模型，通过MTT法测定各实验组细胞代谢率；比色法测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH )、细胞内超氧化物歧
化酶(superoxide dismutase，SOD )活性和NO浓度；放射免疫法测定内皮素-1（endothelin-1，ET-1）的活性。【结果】3.00 mg/ml、
1.50 mg/ml和0.75 mg/ml蕨麻正丁醇部位均能显著减少缺氧损伤内皮细胞LDH的外漏量，并可显著提高细胞内SOD活性，增加
NO分泌、减少ET-1的生成。【结论】蕨麻正丁醇部位对内皮细胞缺氧损伤具有显著的保护作用，其机制之一可能是清除缺氧
导致的内皮细胞自由基堆积，减少ET-1的释放，增加NO分泌，从而减轻内皮细胞损伤。
关键词：蕨麻；内皮细胞；缺氧；一氧化氮；内皮素-1
【文章编号】2095-3720(2012)06-0401-04 【中图分类号】R961.1 【文献标识码】A
Protective effect of n-butanol extract of Potentilla anserina L. on hypoxia injury in EA.
hy926 endothelial cells
GONG Hai-ying，ZHANG Ling，LI Ling-zhi, LI Guang-ce, LV Qi, LI Jian-yu, XHEN Lin (Medical Collage of Chinese
People’s Armed Police Forces, Tianjin 300162, China)
Abstract:【Objective】To study on the protective effect of n-butanol extract of Potentilla anserine L. on EAHY926 endothelial cell
injured by hypoxia.【Methods】A model of hypoxia injury was established by using human umbilical vein endothelial cell line
(EAHY926). The metabolic ability of the cells was detected by MTT assay, the activities of lactate dehydrogenase (LDH), nitrogen
monoxidum (NO) and endothelin (ET-1) out of cells and superoxide dismutase (SOD) in cells were measured by biochemistry
approaches.【Results】3.00 mg/ml, 1.50 mg/ml and 0.75 mg/ml of n-butanol extract of Potentilla anserine L. could significantly reduce
the release of LDH and ET-1, increase the release of NO and increase activity of SOD in cells during hypoxia injury.【Conclusion】
Potentilla anserina L. showed a remarkably protective effect on hypoxia injury in endothelial cells.
Key words: Potentilla anserina L.; Endothelial cells; Hypoxia; Nitrogen oxide; Endothelin-1
血管内皮细胞不仅是覆盖血管腔内表面的屏
障，而且是重要的内分泌器官和效应器官，干预多
种与血管有关的生理和病理生理过程。在正常和
应激状态下，它感受刺激，同时作出调节性反应，以
维持机体内环境的平衡。多种危险因素均可引起
血管内皮细胞损伤，导致内皮细胞功能障碍，而内
皮细胞功能障碍是发生多种心血管疾病的共同病
理生理基础。因此，如何保护内皮细胞功能就显得
尤为十分重要。
蕨麻为蔷薇科委陵菜属鹅绒委陵菜( Potentilla
anserine L. )的地下块根，研究表明其具有显著的抗
缺氧[1-4]、抗氧化[1,4,5]，清除自由基及抗疲劳作用[6]。课
题组前期研究证实蕨麻正丁醇部位（n-butanol
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extract of Potentilla anserina L.）对缺氧导致的损伤具
有保护作用[7-9]，是其抗缺氧主要活性部位。但蕨麻
对血管内皮细胞是否具有保护作用尚未见报道。
本实验采用人脐静脉内皮细胞株（EAHY926）建立
内皮细胞缺氧模型，通过检测乳酸脱氢酶（lactate
dehydrogenase，LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide
dismutase，SOD）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、内皮
素（endothelin，ET-1）的变化，研究蕨麻正丁醇部位
对内皮细胞缺氧损伤的保护作用。
1 材料和方法
1.1 一般材料
蕨麻购自青海，其乙醇总提物经正丁醇萃取、
减压浓缩、冷冻干燥后得其正丁醇部位浸膏（每克
相当于蕨麻生药59 g）。取复方丹参滴丸按照中国
药典（2005版）方法制备阳性对照药。胰蛋白酶
(Difco )、噻唑兰购自北京鼎国生物技术开发中心；高
糖DMEM培养基为Gibco公司产品；胎牛血清购自
中国医学科学院血液病研究所；青霉素、链霉素为
美国 Amresco 公司产品。无糖 DMEM 培养基、
EDTA、二甲基亚砜(DMSO)为美国Sigma公司产品；
ET-1试剂盒购自北京普尔伟业生物科技有限公
司。LDH试剂盒、SOD试剂盒、NO试剂盒购自南京
建成生物工程研究所。医用型超净工作台
（SW-CJ-1F 苏州）；CO2培养箱（Forma3111 美国）；
倒置相差显微镜（OlympusCK-40 日本）；电热恒温
培养箱（HG303-3A 南京）；普通离心机（LD5-2A 北
京）；酶标仪（680 BIORAD 美国）；紫外可见分光光
度计（UV-1601 SHIMADZU 日本），加热磁力搅拌器
（SH-5 北京金北德工贸有限公司）、电子天平
（FA2004上海精科天平）、显微镜(Olympus CH-2)、
图像分析系统 (Mias2000四川大学) 、数字式测氧仪
（CYS-1型，北京）。
1.2 方 法
1.2.1 细胞培养：人脐静脉血管内皮细胞株 (EA.
hy926)按照常规方法[10]复苏，将收获细胞用含体积分
数为10%胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml
青霉素和100 μg/ mg 链霉素的高糖DMEM 培养液
悬浮后，种植于50 mm培养瓶内，置37℃、5% CO2 孵
箱培养2 d。待细胞生长至80%融合时，用于实验。
1.2.2 内皮细胞缺氧损伤模型的建立[11]：取对数生
长期 EA.hy926 细胞，经 0.25%胰蛋白酶和 0.02%
EDTA 室温消化后，用含 10%胎牛血清的高糖
DMEM培养基制成密度为1×105个/ ml 细胞悬液，
以100 μl/ 孔等量种植于平底细胞培养板，置37℃、
5%CO2 孵箱培养 24 h使细胞贴壁。换用无血清
DMEM培养基连续培养12 h后，用无糖DMEM培养
基（预先充入95%N2+5%CO2混合气饱和30 min）替
代正常培养基，而后迅速将培养板移入通有95%N2+
5%CO2混合气的缺氧装置中，维持氧浓度<1%，37℃
缺氧培养2 h后进行各项指标的检测。
1.2.3 实验分组：实验设正常对照组、缺氧模型组、
高（3.00 mg/ml）、中（1.50 mg/ml）、低浓度（0.75 mg/ml）
蕨麻正丁醇部位组，复方丹参（3.00 mg/ml）组，共6
组，每组8个复孔，重复2次。
1.2.4 MTT法检测细胞代谢活力：将接种于96孔板
中状态良好，生长密度无明显差异的细胞按上述随
机分为6组，缺氧模型组及药物干预组缺氧处理2 h，
正常对照组则于37℃、5%CO2培养箱中同步孵育2
h，而后取出各组样本，每孔加入20 μl MTT（5 g/L），
于37℃、5%CO2孵箱中继续孵育4 hr，终止培养，倒
板。加入150 μl DMSO振摇15 min，使结晶充分溶
解，于测定波长490 nm处，测定各孔吸光度（A）值。
1.2.5 LDH、ET-1活性及NO含量测定：接种于24孔
板的内皮细胞，同上分为6组，各组处理同1.2.4。2 h
后，将各组细胞培养液离心取上清液，用比色法测定
LDH的活性和NO含量，放射免疫法测定ET-1的活
性，实验操作按试剂盒说明进行。
1.2.6 细胞内SOD活性的测定：接种于24孔板的内
皮细胞，同1.2.4处理2 h后，0.25%胰酶消化，血清终
止，离心 10 min，转速 1 000 r/min。加 1 ml 0.01 M
PBS溶解沉淀制成细胞悬液，超声破碎，用黄嘌呤氧
化酶法测定SOD活性，实验操作按试剂盒说明进行。
1.2.7 统计学处理：数据用SPSS13.0统计软件处理，
实验结果用􀱽±s表示，进行单因素方差分析，以P <
0.05为有统计学意义。
2 结 果
2.1 内皮细胞MTT实验结果及LDH、SOD活性
与正常对照组比较，MTT法测得缺氧模型组细
胞A值显著减小（P < 0.01），LDH外漏量显著增加
(P < 0.01)；细胞内SOD活性显著下降(P < 0.01)；与模
型组比较，各浓度蕨麻正丁醇部位组和复方丹参组
细胞A值显著增加（P < 0.01)、LDH活性显著降低
（P < 0.01），高浓度蕨麻正丁醇部位组细胞SOD活性
显著升高（P < 0.01），中、低浓度蕨麻正丁醇部位组、
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复方丹参组细胞SOD活性升高（P < 0.05)。见表1。
表1 蕨麻正丁醇部位对缺氧损伤内皮细胞代谢活力、LDH、
SOD活性的影响（􀱽±s，n = 8）
组别
正常对照组
缺氧模型组
蕨麻正丁醇部
位3.00 mg/ml
蕨麻正丁醇部
位1.50 mg/ml
蕨麻正丁醇部
位0.75 mg/ml
复方丹参组
3.00 mg/ml
A值
0.43±0.05
0.22±0.04①
0.44±0.04③
0.35±0.02②③
0.29±0.02①④
0.32±0.02①③
LDH
(U/L)
8.89±3.19
44.03±5.81①
9.05±4.42③
23.87±6.38①③
28.64±6.71①③
23.46±5.16①③
SOD
(U/ml)
70.63±6.40
38.74±3.85①
63.41±6.99③
51.50±4.48②④
48.21±5.41②④
46.72±5.25②④
①：与正常对照组比较，P < 0.01；②：与正常对照组比较，P < 0.05；
③：与缺氧模型组比较，P < 0.01；④：与缺氧模型组比较，P < 0.05
2.2 蕨麻正丁醇部位对缺氧损伤内皮细胞NO和
ET-1含量的影响
与正常对照组比较，缺氧模型组内皮细胞NO
含量显著降低（P < 0.01）、ET-1含量显著增加（P <
0.01）；与缺氧模型组相比，蕨麻正丁醇部位各浓度
组培养基中ET-1含量均显著降低（P < 0.05）、NO含
量均显著增加（P < 0.05）。见表2。
表2 蕨麻正丁醇部位对缺氧损伤内皮细胞NO、ET-1含量
的影响（􀱽±s，n = 8）
组别
正常对照组
缺氧模型组
蕨麻正丁醇部位
蕨麻正丁醇部位
蕨麻正丁醇部位
复方丹参组
浓度
(mg/ml)
--
--
3.00
1.50
0.75
3.00
NO
（μmol /L）
10.71±1.36
2.42±1.69①
49.32±2.67①③
25.42±3.75①③
12.46±2.53③
22.73±1.90①③
ET-1
（pg/ml）
85.83±9.31
182.13±3.66①
99.52±9.05③
111.22±8.48②③
129.85±7.24①③
112.91±7.98①③
①：与正常对照组比较，P < 0.01；②：与正常对照组比较，P < 0.05；
③：与缺氧模型组比较，P < 0.01
3 讨 论
细胞缺氧损伤时，线粒体功能异常，氧化呼吸
链受损，电子传递阻断，ATP产生减少。琥珀酸脱氢
酶是琥珀酸氧化呼吸链里重要的复合酶之一，其活
性可间接反映内皮细胞缺氧损伤的程度。MTT检
测法就是利用琥珀酸脱氢酶可以催化MTT生成紫
红色不溶性有色产物的特性，通过测定吸光度来反
映各组的细胞活性。本实验结果表明，缺氧模型组
比正常对照组吸光度值显著降低，说明缺氧2 h内
皮细胞内琥珀酸脱氢酶的活性降低，细胞代谢能力
已经受损。与缺氧损伤模型组比较，本试验3个浓
度蕨麻正丁醇部位均可以显著提高细胞活性，其中
3.00 mg/ml组与正常对照组无差异，说明蕨麻正丁
醇部位能对抗缺氧对内皮细胞琥珀酸脱氢酶活性
的损害，维持缺氧损伤细胞的呼吸功能。
LDH可以催化乳酸生成丙酮酸，同时产生ATP，
是参与细胞能量代谢的一个重要的酶。缺氧导致
细胞急性损伤时，细胞膜完整性遭到破坏，细胞通
透性增加，LDH将从胞浆中释放出来，因此培养液
中LDH活性的变化可以间接反映胞膜完整性。本
实验结果显示，与缺氧损伤模型组比较，各剂蕨麻
正丁醇部位均可在缺氧时显著减少内皮细胞LDH
的外漏量，其中3.00 mg/ml组与正常对照组无差异，
表明蕨麻正丁醇部位在缺氧时可有效维持细胞膜
的完整性。
生物体内的自由基包括活性氧、氧自由基与活
性氮自由基。当细胞缺氧会导致活性氧爆发性产
生，与此同时组织中清除氧自由基的SOD活性却下
降，抗氧化酶系的保护作用减弱，破坏了氧化抗氧
化之间的平衡，导致自由基堆积，使细胞由于膜脂
质过氧化而致损伤。有学者认为中药保护心脑血
管耐受缺氧的机制之一可能是提高了机体清除氧
自由基的能力[12]。李园媛等报道，蕨麻能减慢空气
对高原菜籽油的氧化速度[5]。本课题组前期实验也
证实蕨麻醇提物能对抗氧自由基引起的细胞老化[1]。
我们在前期研究中也证实蕨麻正丁醇部位可在心
肌细胞缺氧时通过提高SOD活性，增强细胞抗氧化
损伤的能力[7]。本实验结果同样显示蕨麻正丁醇部
位可以在缺氧时显著提高内皮细胞内SOD活性，且
3.00 mg/ml组SOD活性与正常对照组无差异，充分
证实蕨麻正丁醇部位可通过增强细胞清除自由基
的能力，对抗缺氧导致的细胞膜氧化损伤。
ET是稳定正常血液循环的关键物质，它含有
ET-1、ET-2和ET-3三种异构体，其中ET-1活性最
强，是唯一存在于血管内皮的ET。ET-1是由21个
氨基酸组成的生物活性多肽，它是一种内皮源性强
效血管收缩肽，其合成和分泌受多种化学和物理因
素的调节，通过与其分布广泛的特异性受体结合，
可使血管收缩和痉挛。ET-1 主要由血管内皮细胞
（vascularendothelial cell，VEC）分泌，在VEC损伤时
可大量分泌，因此ET-1是目前测定VEC损伤的重
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要手段之一。NO是血管内皮细胞分泌的舒血管活
性物质，除具有舒张血管、抑制血管平滑肌增殖外，
还有抗氧化损伤、抗血小板聚集和抑制单核-巨噬
细胞浸润等作用[14]。血管内皮细胞分泌的NO和
ET-1是一对作用相反的血管活性分子，二者不仅是
生理状态下血管张力及其它心血管功能的调控者，
而且也是多种心血管疾病如动脉粥样硬化、心力衰
竭等病理过程的参与者[15]。内皮源性NO与ET的平
衡失调即NO合成和释放减少与ET合成与释放的
异常增加，与动脉粥样硬化的形成有密切的关系[16]。
在病理状态下，ET-1可明显促进血管平滑肌细胞的
分裂增殖，并且活化巨噬细胞，引起内皮进一步损
伤，因此有效地降低过高的ET-1含量可以减轻对
机体的损伤[17]。本实验发现细胞缺氧2 h后NO含量
降低，ET-1分泌增加，证明缺氧造成了内皮功能的
损伤。蕨麻正丁醇部位可升高培养液中NO含量，
减少缺氧损伤内皮细胞ET-1的分泌，提示其在缺
氧时可改善内皮细胞功能，保护血管内皮。在以前
的实验中我们也证实发现蕨麻正丁醇部位能增加
急性缺血小鼠血中NO含量，减少心肌的损伤[9]。与
本次实验结果相吻合。
综上所述，蕨麻正丁醇部位对内皮细胞缺氧损
伤具有明显保护作用。其机制可能与减少氧自由
基生成量，提高机体对氧自由基的清除能力；增加
NO产生、减少ET-1的分泌，维持内皮功能有关。
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（责任编辑：张璐）
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