全 文 ：　[收稿日期] 　2010-10-01;2011-01-17修回
　[作者简介] 　杨玉红(1966-),女 ,教授 ,硕士 ,从事食品生物化学研究。 E-mai l:yuzh ao88666@sina.com
[ 文章编号] 1001-3601(2011)03-0148-0028-03
金线兰愈伤组织诱导条件的优化
杨玉红 , 林 海
(鹤壁职业技术学院 , 河南 鹤壁 458030)
　　[摘　要] 为探索金线兰愈伤组织的诱导和细胞培养技术 ,以金线兰根状茎 、幼茎 、叶片和离体胚为外植
体 ,2 ,4-D 、NAA 、6-BA和 ZT 4种激素采用 L9(34)正交试验设计 ,对外植体愈伤组织诱导的条件进行了研究。结果表明:6-BA 和 2 ,4-D在诱导金线兰愈伤组织中作用极为显著 ,4种激素对愈伤组织的诱导作用大
小依次为 6-BA>2 ,4-D>NAA>ZT ,初步断定金线兰愈伤组织诱导的最佳激素配比为 0.2 mg/L 2 , 4-D+
0.9 mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA+0.25 mg/L ZT ;根茎和幼茎作为外植体更易诱导愈伤组织形成;暗培养较光暗交替培养褐化率低 。[关键词] 金线兰;愈伤组织;诱导;条件[中图分类号] S567.9 [文献标识码] A
Optimization of Callus Induction Condition in Anoectochilus roxburghii
YANG Yu-hong , LIN Hai
(Hebi College of Vocation and Technology , Hebi , Henan 458030 , China)
　　Abstract:T he rhizome , young stem , leaf and in vi t ro embryo of Anoectochi lus roxburghi i were
cultured on media wi th dif ferent hormone combinat ions to optimize callus induction condition for probing
the technique o f callus induction and cell culture in Anoectochi lus roxburghii .The results show ed that 6-
BA and 2 , 4-D had the signi ficant ef fect on i ts callus induction , the callus induction effect of four tested
ho rmones w as 6-BA>2 ,4-D>NAA>ZT , the optimum medium for callus induction w as M S+0.2 mg/L
2 ,4-D+0.9 mg/ L NAA + 1.0 mg/L 6-BA +0.25 mg/ L ZT , the callus induction rate of rhizome and
young stem w as higher than that of leaf and in vit ro embryo , and the callus brow ning rate cultured under
dark condition w as lowe r than that cultured under light/dark condi tion.
Key words:Anoectochi lus roxburghii ;cal lus;induction;condit ion
　　金线兰 〔Anoectochi lus roxburghi i (Wal1.)
Lindl.〕属兰科开唇兰属植物 , 全草入药 ,味甘 、性
平 ,具有清热凉血 、除湿解毒的功效 ,可治疗肺结核 、
糖尿病 、肾炎 、膀胱炎 、重症肌无力 、遗精 、风湿性及
类风湿性关节炎 、小儿惊风 、妇女白带和毒蛇咬伤等
症 ,是民间珍稀名贵的中草药[ 1] 。除药用外 ,由于株
型矮小 ,叶型优美 ,叶面黑紫色 ,有金黄色带及绢丝
光泽的美丽网脉 ,还是观赏价值极高的室内观叶珍
品 ,具有广阔的开发利用前景 。金线兰种子自然条
件下萌发率很低 ,再加上过度采集 ,野生资源日益枯
竭[ 2] 。在人工培养条件下诱导愈伤组织生长并使其
增殖是实现快繁和分离其次生代谢产物获取金线兰
药用成分的重要途径 ,但目前对金线兰愈伤组织诱
导的研究鲜见报道。对此 ,笔者采用正交试验研究
了 4种植物生长物质对诱导愈伤组织生长的影响 ,
以期为金线兰愈伤组织的诱导和细胞培养提供依
据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 外植体 金线兰植株 ,采购自花卉市场 。
1.1.2 金线兰离体胚 金线兰种子 ,市场采购 ,清
水浸泡 24 h ,剥取离体胚。
1.1.3 培养基 MS 基本培养基 +3%蔗
糖+0.8%琼脂 , 不同浓度的 2 , 4-D 、NAA 、6-BA 、
ZT ,pH 5.8 ～ 6.0 ,每 150 mL 三角瓶中加培养基
30 ～ 40 mL ,灭菌时间 20 min ,双层牛皮纸封口 ,灭
菌后 1 ～ 2 d备用。
1.2 方法
1.2.1 外植体消毒 在超洁净工作台上进行操
作 ,将金线兰芽的尖端部分 ,幼嫩的根状茎 ,新生叶
片用清水冲洗干净后 ,再用蒸馏水冲洗 5 次 , 用
75%的酒精浸泡 30 s在用无菌水冲洗3次 ,0.1%的
HgC l2浸泡 8 ～ 10 min ,在用无菌水冲洗 3 次 ,即完
成消毒 。
1.2.2 接种 消毒后的材料置于无菌滤纸上吸干
水分 ,然后将材料切割成适量大小接种到加有不同
浓度激素的培养基中。
1.2.3 试验处理与设计
1)根状茎。基本培养基为 MS +3%蔗糖 +
0.8%琼脂 ,激素处理选取 2 , 4-D 、6-BA(表 1)。每
种激素处理接种 12瓶 ,6瓶于光暗交替下培养 ,6瓶
于暗处培养 。光暗交替培养放在日光灯照明的培养
架上 ,每天光照时间为8:00-18:00 ,温度设置为
　贵州农业科学　2011 , 39(3):28 ～ 30　Guizhou Ag ricultural Science s
表 1 金线兰根状茎的激素处理
Table 1　The ho rmone combination fo r inducing callus fr om rhizomes o f Anoectochilus roxburghii
激素
Hormone
处理组合 Combination
M 1 M 2 M 3 M 4 M 5 M 6 M 7 M 8 M 9
2 , 4-D/(mg/ L) 0.5 1.0 1.5 2.0 0.5 0.5 0.5 1.0 2.0
6-BA/(mg/ L) 0 0 0 0 0.5 1.0 2.0 0.5 0.5
20℃恒温培养;暗处培养时放在 20℃培养箱中培
养 ,湿度为 85%～ 90%。每隔 10 d观察记录每种处
理外植体的变化 。
2)幼茎 、叶片及离体胚。基本培养基为 MS +
3%蔗糖+0.8%琼脂 ,选取 2 , 4-D 、NAA 、6-BA 、ZT
4种激素处理 ,每种激素取 3 个水平(表 2),利用
L9(34)正交试验设计(表 3),考察 4种激素对金线
兰愈伤组织诱导的影响 。每个处理接种 6 瓶 ,离体
胚每个处理接种 2 瓶 , 于暗处 20℃培养 ,湿度为
85%～ 90%。每隔 10 d观察外植体变化并记录 。
表 2 金线兰愈伤组织诱导的激素水平
Table 2　The level and factor of hormone s fo r inducing
callus from young stem , leaf and in vitro
embryo o f Anoectochi lus roxburghii
水平
Level
因子 Factor
2 , 4-D/
(mg/ L)
NAA/
(mg/ L)
6-BA/
(mg/ L)
KT/
(mg/ L)
1 0.2 0.1 0 0.25
2 0.6 0.3 0.5 0.50
3 1.2 0.9 1.0 1.00
表 3 愈伤组织诱导的 4 因素 3 水平正交试验设计
Table 3　The o r thogonal design fo r callus induction of
Anoectochilus roxburghii
处理
T reatment
因子 Factor
2 , 4-D/
(mg/ L)
NAA/
(mg/ L)
6-BA/
(mg/ L)
KT/
(mg/ L)
1 0.2 0.1 0 0.50
2 0.2 0.3 0.5 1.00
3 0.2 0.9 1.0 0.25
4 0.6 0.1 0.5 0.25
5 0.6 0.3 1.0 0.50
6 0.6 0.9 0 1.00
7 1.2 0.1 1.0 1.00
8 1.2 0.3 0 0.25
9 1.2 0.9 0.5 0.50
2 结果与分析
2.1 根状茎诱导的愈伤组织
光暗交替下的金线兰愈伤组织生长的较疏松 ,
为绿色团块状 ,而暗处理下金线兰愈伤组织较紧密 ,
白色或略带黄色 。光暗交替培养:M1处理到 60 d时
有新的须根出现 , 70 d 时须根下生成不规则突起 ,
80 d时变成类似芽状的组织 , 90 d时生成花蕾样突
起;M 3处理在 80 d时才有新根出现 , 90 d时须根变
长;M 4处理外植体表面在 20 d 时有短细毛出现 ,
90 d时表皮开裂;M8处理在 90d 时下部生成一突
起。暗处培养:M1在 45 d时有须根出现 , 55 d 时出
现芽状体 , 65 d 时出现不规则突起;M4处理直到
65 d时都没有什么变化 。其他处理则因染菌外植体
全部死亡。
金线兰根状茎诱导愈伤组织生长方面 ,在 10d
左右切口便可观察到白色致密的颗粒状愈伤组织 ,
30 d时愈伤组织生长达到最大速度。低浓度处理的
金线兰外植体在暗处培养 45 d时出现须根 , 65 d左
右出现芽状体 ,光暗交替培养条件下 60d 出现须
根 ,80 d左右出现芽状体。因此 ,金线兰根状茎在暗
培养下诱导愈伤组织生长较光暗交替下好 。
2.2 不同激素处理对金线兰离体胚 、叶片和茎愈
伤组织诱导的影响
接种 10 d后离体胚看不出变化 ,30d 时可观察
到部分处理中离体胚膨胀伸长 ,但不明显 。在对叶
片进行愈伤组织诱导的培养基中 ,部分叶片在 30d
时没有明显出现愈伤组织 ,大部分叶片外缘及脉线
处变黑或已经死亡 ,造成这种结果的原因可能是由
于消毒时间过长或消毒液浓度过高 ,叶片过于幼嫩
造成死亡或培养基的激素配比不适合叶片愈伤组织
的诱导 。接种 10 d后金线兰幼茎切口处出现白色
点状物质 ,20 d后白色点状物质逐渐扩大 ,形成一层
薄薄的愈伤组织 , 30 d后出现较明显的愈伤组织 。
从表 4可知 ,通过 6-BA 、2 , 4-D 、NAA 、ZT 4种
激素 3个水平 9个浓度组合的正交试验发现 ,各种
组合对金线兰愈伤组织诱导的影响差异很大 ,通过
对试验结果进行极差分析[ 3] (将最大值减去最小值
即为因子极差)发现 ,因子 6-BA 作用极为显著 ,因
子 2 , 4-D 、NAA 作用显著 ,因子 ZT 不显著(表 5)。
从表 5看出 , 4 种激素对愈伤组织的诱导作用
大小依次为 6-BA>2 , 4-D>NAA>ZT 。金线兰愈
伤组织最佳激素配比可初步断定为 0.2mg/ L 2 , 4-
D+0.9mg/ L NAA+1.0mg/L 6-BA+0.25mg/L
ZT ,且该结果和试验中第 3组诱导率最大相吻合。
但因试验各处理的重复中愈伤组织诱导率差异较
大 ,因而试验的可行性较差 ,最佳激素配比仍需进一
步试验验证 ,由表 5还可看出 , 6-BA 、2 ,4-D为金线
兰愈伤组织诱导主要因素 ,是否 6-BA 和 2 , 4-D两
者的组合更适合诱导金线兰愈伤组织尚需进一步试
验 。
2.3 外植体大小对愈伤组织诱导的影响
以金线兰幼茎为外植体 ,当茎直径小于 0.5 cm
时 ,从接种第 7天开始 ,茎两端切口处渐渐变黄并随
着时间的延长 ,色泽逐渐加深 , 20 d时变成深褐色 ,
且部分外植体切口分泌出淡黄色液体 , 30 d时部分
幼茎渐渐发黑死亡 。外植体直径大于 0.5 cm 时 ,接
·29·　第 3 期 杨玉红 等　金线兰愈伤组织诱导条件的优化
表 4 各激素组合下金线兰愈伤组织的诱导率
　　　　Table 4　The callus induction r ate of in vitro embryo , leaf and young stem of Anoectochilus roxburghii
cultured on media with different ho rmone combinations
处理
T rea tment
2 , 4-D NAA 6-BA ZT 愈伤组织诱导率/ %
Callus induction rate
褐化率/ %
Brow ning ra te
1 0.2 0.1 0 0.25 50.0 45.45
2 0.2 0.3 0.5 0.50 35.0 25.00
3 0.2 0.9 1.0 1.00 76.5 23.08
4 0.6 0.1 0.5 1.00 33.3 25.00
5 0.6 0.3 1.0 0.25 69.2 22.22
6 0.6 0.9 0 0.50 50.0 18.18
7 1.2 0.1 1.0 0.50 57.9 33.33
8 1.2 0.3 0 1.00 9.3 16.67
9 1.2 0.9 0.5 0.25 21.1 50.00
CK 0 0 0 0 5.6 42.86
表5 金线兰离体胚 、叶片和茎不同激素下的愈伤组织诱导率
Table 5　The ca llus induction rate of in v it ro embryo , leaf
and young stem of Anoectochilus roxburghii
cultured on media with differ ent ho rmone
分组
Group
愈伤组织诱导率/ % Callus induction rate
2 , 4-D NAA 6-BA ZT
1 161.5 141.2 109.3 140.3
2 152.5 113.5 89.4 142.9
3 88.3 147.6 203.6 119.1
极差 RT 　 73.2/ 3 　 34.1/ 3 　114.2/ 3 　 23.8/ 3
种 10 d开始在切口处愈伤组织以点状出现 ,15d 时
已能看到薄薄一层白色结晶状物质 , 30d 时形成白
色较致密的愈伤组织。吕玉虎[ 4] 等研究认为 ,外植
体在培养基上的不同放置方式对百合鳞片愈伤组织
诱导也有影响 ,其诱导出芽能力从强到弱依次为鳞
片内侧向上>鳞片竖直插入>鳞片内侧向下平放 。
金线兰外植体的放置方式是否影响到愈伤组织的生
长还需进一步研究。在试验中 ,金线兰茎水平放置
和垂直放置(一切口接触培养基)两者的愈伤组织生
长情况有明显的差异 ,竖放置生成愈伤组织的量多
且愈伤组织较致密 ,生长旺盛 ,水平放置愈伤组织生
成量少 ,疏松且生长较慢 。
3 讨论
1)在试验过程中 ,外植体或愈伤组织发生褐化
现象其原因是多酚化合物在多酚氧化酶的作用下氧
化为活性酸化物和环形多聚体氧化蛋白时形成深色
化合物 ,这些物质很快又被氧化和形成复杂的醌类
物质 ,从而导致外植体组织或细胞逐渐形成褐色或
黑色 ,最后死亡[ 5-6] 。据报道 ,加入抗氧化剂或吸附
剂对抑制褐化有明显的效果 , 在试验中通常采用
PVP(聚乙烯吡咯烷酮)和活性炭抑制褐变[ 7-8] 。本
次试验结果表明 ,金线兰愈伤组织褐化率比较高 ,这
是因为培养基中没有加入抑制剂所致。
2)根据细胞全能性理论 ,植物任何器官都可以
用作外植体 ,但不同组织器官培养成功的难易程度
不同 ,同一种植物不同的组织和器官再生能力也有
很大差异[ 9] 。本试验中取根状茎 、幼茎 、叶 、离体胚
为外植体 ,试验结果表明 ,只有根状茎和幼茎易产生
愈伤组织 ,愈伤组织满布切口或外侧 、质地紧密 、时
间相对短 ,且诱导率较高 。离体胚愈伤组织形成不
明显。叶片在消毒时被杀死 ,无愈伤组织生成 。根
状茎 、幼茎和离体胚诱导愈伤组织能力不同 ,表明不
同器官和组织的再生能力也不同 。
[ 参 考 文 献]
[ 1] 中国科学院中国植物志编委会.中国植物志[ M] .北
京:科学出版社 , 2000:220.
[ 2] 陈 浴 , 林坤瑞 ,管其宽 , 等.金线莲生物学特性及生
境特点的研究[ J] .亚热带植物通讯 , 1994 , 23(11):
18.
[ 3] 徐吉民.正交法在医药科研中的应用[ M] .北京:医药
科技出版社 , 1987:36.
[ 4] 吕玉虎 , 李彬青 ,吴淑平 , 等.百合的离体组织培养和
快速繁殖[ J] .信阳农业高等专科学校学报 , 2002 , 12
(2):19-20.
[ 5] 陈 菲 , 李 黎 ,宫 伟.植物组织培养的防褐化探讨
[ J] .北方园艺 , 2005(2):69.
[ 6] 张明文 , 陈力耕.银杏组织培养中控制褐化的研究
[ J] .中国南方果树 , 2003 , 32(3):51-52.
[ 7] 郭 勇 , 崔唐兵 , 谢秀祯.植物细胞培养技术与应用
[ M] .北京:化学工业出版社 , 2003:12.
[ 8] 薛建平 , 柳 俊 , 蒋细旺.药用植物生物技术[ M] .合
肥:中国科学技术大学出版社 , 2005.
[ 9] 毛子成 , 彭正松.半夏快速繁殖体系的研究进展[ J] .
中国中药杂志 , 2003 , 28(3):193-195.
(责任编辑:杨　林)
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